感染性心内膜炎瓣膜mNGS检测的病原学价值.pdf

：研究生园地感染性心内膜炎瓣膜 检测的病原学价值 作者简介：卞天丹，年生，女，硕士研究生，研究方向：感染性心内膜炎。通信作者：陶臻，主任医师，：。卞天丹，朱丽莹，宋爽，王文静，陶臻（南京医科大学附属南京医院 南京市第一医院感染科，南京）摘要：目的 评估瓣膜宏基因组二代测序（，）对感染性心内膜炎（，）的病原学诊断价值。方法 收集于 年 月 日至 月 日在南京医科大学附属南京医院接受瓣膜手术患者 例，根据改良杜克标准确诊为 患者 例，非 患者 例。采集各患者的静脉血及瓣膜组织标本，同时进行血培养、瓣膜培养以及瓣膜 检测，并进一步比较 和传统诊断方法（血培养、瓣膜培养）诊断 病原学的临床效能。结果在 例经病理诊断为 的患者中，血培养阳性 例，瓣膜培养阳性 例，瓣膜 阳性 例；血培养、瓣膜培养和瓣膜 诊断 的敏感性分别为、和。瓣膜 与血培养或瓣膜培养的检测结果在细菌的属水平上相一致。瓣膜 的属相对丰度（）、种序列数（）、覆盖率（）与抗生素的使用时间有关。瓣膜 可以指导培养阴性 患者的抗生素治疗。结论 瓣膜 对 的病原学诊断具有较高的临床价值，为后续患者的抗生素治疗提供了依据。关键词：感染性心内膜炎；瓣膜；宏基因组二代测序中图分类号：文献标志码：，（，）：（）（），（），（），（），：；感染性心内膜炎（，）是一种死亡率较高，并发症严重的疾病。部分患者因瓣膜功能受损，行外科手术干预术后需要长期、规律的抗感染治疗。精准的病原学检测是影响 患者预后的重要因素。目前培养（包括血培养、瓣膜培养）仍然是 病原学诊断的主要方法。由于临床上对患者术前应用抗生素等原因，导致传统病原学检测手段无法检出病原体，有学者推荐采用血清学试验和 检测培养阴性 的病原学指标，但二者仅针对特定的微生物，仍缺乏全面性。宏基因组二代测序（，）作为一种新型的分子生物学检测方法常用于中枢神经系统感染，骨关节感染，皮肤和软组织感染和呼吸道感染等的病原学诊断。然而，国内关于瓣膜 在 病原学诊断中的应用价值报道少见。因此，本研究旨在采用 检测心脏瓣膜组织，并和传统培养方法（包括血培养、瓣膜培养）比较，以期评估其对 病原学诊断的临床应用价值。临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ，材料与方法 研究对象 收集 年 月 日至 月 日在南京市第一医院心胸外科接受瓣膜手术的患者 例，其中 例患者符合改良杜克标准确诊为，其余 例为非 患者。患者纳入标准：血培养或瓣膜培养阳性，心超提示，瓣膜病理提示。排除标准：术中瓣膜标本量少无法行 检测；外院和本院血培养结果不一致。在 例 组患者中，男 例，女 例，年龄（）岁，其中 例患者存在基础心脏瓣膜病，包括非风湿性心脏病 例、先天性心脏病 例、风湿性心脏病 例及肥厚性心肌病 例，人工瓣膜心内膜炎有 例；其余 例患者无基础心脏病。例患者入院前使用过抗生素；患者术前超声心动图提示有瓣膜赘生物，其中单纯二尖瓣 例，单纯主动脉瓣 例，二尖瓣合并主动脉瓣 例。在非 组患者中，男 例，女 例，年龄（）岁，瓣膜基础病中包括非风湿性心脏病 例、先天性心脏病 例、风湿性心脏病 例；无人工瓣患者；术前均未使用过抗生素治疗；患者术前超声心动图未见瓣膜赘生物。本研究通过南京医科大学附属南京医院医学伦理委员会审核批准（批准文号：），研究对象均知情同意。主要仪器及试剂 自动血培养系统及培养瓶（美国 公司），哥伦比亚血平板、巧克力平板、麦康凯平板及 检测试剂盒（美国赛默飞世尔公司），质谱仪（法国生物梅里埃公司），试剂盒及 文库构建试剂盒（天津金匙公司），安捷伦 生物分析仪（美国安捷伦科技公司），二代测序及生物信息学分析由天津金匙公司完成。标本采集及培养 血培养 所有 患者在入院后至少接受一次外周静脉穿刺血培养。在使用抗菌药物之前或者下次使用抗菌药物之前（为已使用抗菌药物的患者），每次血培养从 个不同穿刺位点采集，采集的血液立即注入需氧、厌氧和真菌血液培养瓶（每瓶 血液）。血培养瓶在 内置于自动血培养系统中培养 ，对培养阳性的标本及时转种至哥伦比亚血平板、巧克力平板及麦康凯平板。培养的微生物通过 质谱仪进行菌株鉴定。瓣膜培养取心胸外科手术后摘除的瓣膜组织，置于无菌管内立即送检，在无菌条件下，将切除的瓣膜研磨成匀浆，随机分为两份，一份用于常规培养，另一份（约 ）置于 保存，用于后续 测序。瓣膜组织在培养前加入 脑心浸液增菌，置于 、培养箱中培养 。若发生浑浊则及时转种至哥伦比亚血平板、巧克力平板及麦康凯平板。未出现浑浊的标本在培养 后亦转种至血平板、巧克力平板及麦康凯平板。培养的微生物通过 质谱仪进行菌株鉴定。瓣膜 检测 提取冷冻的标本恢复至常温，取约 的瓣膜组织加入蛋白酶 消化过夜，按照 试剂盒说明书操作提取。通过 检测试剂盒进行检测，取浓度 样本置于 保存。文库构建及测序 文库由 文库构建试剂盒构建。使用安捷伦 生物分析仪评估 文库质量。构建的 文库浓度（）经 测定。最后，将 文库混合后使用 测序仪进行测序，测序序列数为 ，测序模式为 ，测序数据量不低于 。数据的处理及过滤 去除低质量和短的（长度）读数以产生高质量的测序数据。通过 比对减去映射到人类参考基因组（）的人类宿主序列。其余的非人类数据被映射到由病毒、细菌、真菌和寄生虫组成的分类参考数据库，该数据库可以从美国国家生物技术信息中心（，：）下载。包含 个病毒分类群、个细菌、个真菌和 个与人类感染性疾病相关的寄生虫的基因组序列。瓣膜 阳性结果的判读标准结果判读：序列数指匹配到该病原体的序列数目。序列数的多少与标本中病原体含量多少、病原体基因组大小、标本中核酸提取量呈正相关，而与标本中人源序列比例呈负相关。当 检测到某种细菌（种水平）的序列数是其余所有细菌的 倍以上时，认为具有临床意义。统计学分析 采用 统计学软件及 统计学软件进行统计分析。对数据进行正态性和方差齐性分析，符合正态分布的数据以 表示，计量资料用两独立样本 检验，率的比较用检验，两组间比较采用配对 检验，多组临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ，间比较采用方差分析，如不符合正态分布，则应用非参数统计学分析，数据以中位数（四分位数）（，）表示，并用 检验，以 为差异有统计学意义。结果血培养、瓣膜培养及瓣膜 检测病原体情况 以病理检测为金标准，检出的病原体类型中以革兰氏阳性菌为主，血培养检出 例，瓣膜赘生物培养检出 例，检出 例。革兰氏阴性菌中，血培养检出 例，检出 例。其他病原体中，血培养检出 例，检出 例。见表。表 种方法病原体检出情况（）病原体类型血培养瓣膜培养瓣膜革兰氏阳性菌葡萄球菌属链球菌属缺陷乏养菌革兰氏阴性菌纹带棒状杆菌其他近平滑念珠菌贝纳柯克斯体总计 血培养、瓣膜培养及瓣膜 的诊断效能 种方法检测 病原体的敏感性以病理诊断为金标准，血培养的诊断敏感性为（），瓣膜培养的诊断敏感性为（），瓣膜 的诊断敏感性为（）。另有 例患者 种方法检测均阴性，但瓣膜病理可见炎性细胞；其余 例非 患者经 种方法检测均阴性，且瓣膜病理均未见炎性细胞。培养阳性 患者的瓣膜 检测一致性结果 例培养阳性 患者中有 例仅血培养阳性，例仅瓣膜培养阳性，其余 例经血培养和瓣膜培养均为阳性。共培养出金黄色葡萄球菌 例、嵴链球菌 例、血红链球菌 例、咽峡炎链球菌 例、缺陷乏养菌 例、近平滑念珠菌 例、棒状杆菌 例。而瓣膜 结果与培养结果（血培养或瓣膜培养）在细菌的属水平上完全一致。培养阴性 患者的瓣膜 检测一致性结果 例培养阴性 患者经瓣膜 检出病原体核酸序列 例，仅 例 未检出病原体核酸序列，检出病原体的阳性率为。共检出金黄色葡萄球菌 例、口腔链球菌 例、解没食子酸链球菌 例、停乳链球菌 例、毗邻颗粒链菌 例、戈登链球菌 例、缓症链球菌 例、贝纳柯克斯体 例。抗生素对于瓣膜 结果的影响随着抗生素 的 使 用，瓣 膜 的 属 相 对 丰 度（）、种序列数（）、覆盖率（）与抗生素的使用时间相关。抗生素使用时间越长，瓣膜 的属相对丰度、种序列数、覆盖率越低。见表。表 瓣膜 结果与初始抗生素方案使用时间关系（，）指标抗生素使用 周抗生素使用 周抗生素使用 周 值属相对丰度（）（，）（，）（，）种序列数（，）（，）（，）覆盖率（）（，）（，）（，）讨论 目前培养（血培养和赘生物培养）仍然是 病原学诊断的主要方法。然而，国内有报道表明，约 的 病例培养为阴性，导致诊断延迟，影响预后。本研究中的血培养阳性率为，与国内其他研究结果基本一致，分析原因可能是前期抗生素治疗和苛养菌感染所致。相比之下，不依赖于培养，理论上可以全面检测出标本中存在的所有病原体。本研究中，血培养、瓣膜培养、瓣膜 的诊断敏感性分别为、，瓣膜 诊断敏感性明显高于血培养和瓣膜培养。并且瓣膜 与培养结果（血培养或瓣膜培养）在细菌的属水平上完全一致。在 检出的病原微生物中，解没食子酸链球菌、毗邻颗粒链菌、缺陷乏养菌、停乳链球菌、贝纳柯克斯体、真菌、纹带棒状杆菌均是临床引起 的不常见的病原微生物，证实了 具有全面性。随着抗生素的使用，瓣膜 的属相对丰度（）、种序列数（）、覆盖率（）受抗生素的使用时间影响，抗生素使用时间越长，瓣膜 的属相对丰度、种序列数、覆盖率越低。患者在抗生素治疗后，感染逐渐控制，瓣膜 检出的病原体核酸量逐渐减少，提示瓣膜上的临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ，细菌量减少，这也是瓣膜培养阴性的可能原因之一。赘生物使瓣膜和心血管内膜的结构发生炎症性的病变。研究表明，在脓毒症中，血 阳性率约为 ，在疾病发作 周后，血 的阳性率与血培养相差不大。国外有学者行瓣膜 研究时证实，检测的阳性率可达 。故而对于术前病原学阴性的 患者，若瓣膜 结果为阳性，将对患者术后抗感染治疗具有重要的指导意义。年欧洲心脏病学会关于 的指南建议，瓣膜置换术后也需要接受系统规范的预防性抗菌治疗 周，否则会存在较高的 复发风险。此外，仍需要进行外科手术干预后才可取得样本，这也限制了其临床应用。血 与瓣膜 各有优势，但目前尚无关于在 中血 与瓣膜 检出率的比较，仍需要进一步的研究。在治疗方面，根据 年欧洲心脏病学会关于 的指南指出，对于链球菌建议 内酰胺类联合氨基糖苷类治疗，葡萄球菌建议万古霉素联合氨基糖苷类治疗，两者治疗方案不同。本研究中，所有 例培养阴性 患者均接受了经验性抗生素治疗，主要为广谱抗生素（包括碳青霉烯类、万古霉素和达托霉素）。例病原学为链球菌的患者抗生素治疗方案依据 检测结果进行了有效调整（改为 内酰胺类联合氨基糖苷类治疗），位瓣膜 的检测结果为贝纳柯克斯体，明确病原学后调整抗生素方案为多西环素利福平，在指导抗菌药物的合理使用中具有重要意义。值得注意的是，也存在与其他分子生物学方法一样的缺陷，它只能检测出病原体的 或，无法区分病原体的存活状态。此外，本研究尚存在一些局限性。第一，本次实验仅为单中心研究，患者多来自南京周围地区，可能存在参与者选择偏差，不适用于其他地区人群。第二，本研究样本量较小，很多 常见的病原学菌株无法覆盖，对于敏感性和特异性的研究需要进一步大规模的研究验证。参考文献，：，（）：，（）：，：（）：（），（），（）：，：，：，：胡金伟，王稀，李晓琴，等 宏基因二代测序技术辅助诊断艾滋病合并耶氏肺孢子菌肺炎 例 临床检验杂志，（）：，：，：，（）：，（）：，（）：戴媛媛，马筱玲 宏基因组二代测序技术在临床病原学诊断中的应用 临床检验杂志，（）：朱丽萍，赵金龙，付亮，等 三种检测方法在感染性心内膜炎病原学诊断中的作用 局解手术学杂志，（）：，：，：，（）：（收稿日期：）（本文编辑：许晓蒙）临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ，