肝细胞癌关键基因分析及相关免疫机制分析.pdf

SYSTEMS MEDICINE 系统医学系统医学 2023 年 6 月第 8 卷第 12 期 基础医学系统研究 肝细胞癌关键基因分析及相关免疫机制分析肖琪，严树丽，詹珊珊广东江门中医药职业学院医学技术学院，广东江门 529000摘要 目的 筛选肝细胞癌关键致病基因，分析免疫相关致病机制。方法 GEO数据库下载芯片数据，筛选差异基因，并进行注释。构建差异基因的蛋白质相互作用（protain-protain interaction,PPI），计算核心基因。分析hub基因对预后的影响，并探索免疫学机制。结果 通过GEO2R的分析筛选并以韦恩图取交集得到差异基因798个。利用Cytoscape软件计算得到核心关键基因共6个，分别为CDK1、CCNA2、CCNB1、CDC20、TOP2A、KIF11，上述基因的高表达会降低患者生存率，可能是相应蛋白会抑制免疫细胞并辅助肿瘤细胞进行免疫逃逸。结论 本研究找到影响肝细胞癌发生发展的关键蛋白，分析其促进肿瘤发展的相关免疫机制，为后续临床试验及药物研发提供理论基础。关键词 肝细胞癌；免疫浸润；预后分析中图分类号 R4 文献标识码 A 文章编号 2096-1782（2023）06(b)-0037-08Analysis of Key Genes and Related Immune Mechanisms in Hepatocellular CarcinomaXIAO Qi,YAN Shuli,ZHAN ShanshanDepartment of Medical Technology,Guangdong Jiangmen Chinese Medicine College,Jiangmen,Guangdong Province,529000 ChinaAbstract Objective To screen the key pathogenic genes of hepatocellular carcinoma,and analyze the immune-related pathogenic mechanisms.Methods The microarray data was downloaded from the GEO database,and the differential genes were screened and annotated.Construct the protain-protain interaction(PPI)of differential genes and calculate the core genes.Analyze the effect of hub gene on prognosis and explore the immunological mechanism.Results Through GEO2R analysis and screening,798 differential genes were obtained through the intersection of Venn diagrams.6 core key genes were calculated by using Cytoscape software,namely CDK1,CCNA2,CCNB1,CDC20,TOP2A,KIF11.The high expression of the above genes will reduce the survival rate of patients,possibly because the corresponding proteins can inhibit immune cells and assist tumor cells in immune escape.Conclusion This study finds the key proteins that affect the occurrence and development of hepatocellular carcinoma,and analyzes the related immune mechanisms that promote tumor development to provide a theoretical basis for subsequent clinical trials and drug development.Key words Hepatocellular carcinoma;Immune infiltration;Prognosis analysis肝细胞癌的治疗一直是难点，对于早期肝细胞癌患者，手术、局部破坏性治疗和肝移植是非常有效的治疗手段，但手术治疗后的复发是个主要问题，肝细胞癌5年复发率超过70%。在很多情况下，肝细胞癌经常在晚期才被诊断出来，许多晚期患者不适合手术根治性治疗，传统的全身化疗也收效甚微1-3。目前，晚期患者可以口服多激酶抑制剂索拉菲尼进行治疗，但只对不到 1/3 的患者有很好的疗效，并且在治疗后的 6个月内会出现明显的耐药性。随着长期使用索拉菲尼还会出现额外的问题，DOI：10.19368/ki.2096-1782.2023.12.037基金项目 广东大学生科技创新培育专项资金资助项目（pdjh2022b1051）。作者简介 肖琪（1992-），女，硕士，中级检验师，研究方向为分子生物学、肿瘤免疫学。37系统医学 2023 年 6 月第 8 卷第 12 期 基础医学系统研究 系统医学 SYSTEMS MEDICINE如药物毒性问题等。近年来，许多科研工作者发现免疫系统对于肿瘤的发生发展具有重要影响4-6，各种针对癌症的免疫治疗手段层出不穷，如 PD-1抗体治疗、CAR-T 技术的应用等，但目前这些方法均有其局限性和不良反应，因此迫切需要研发新型药物来与传统药物配合使用，才能更好地解决这些问题，因此本文选取 2019年 6月、2019年 8月、2013年4月上传到GEO数据库中的测序数据，利用生物信息学技术分析肝细胞癌的免疫学机制，为药物研发提供理论基础。现报道如下。1 材料与方法1.1 数据来源在 基 因 表 达 综 合（Gene Expression Omnibus，GEO）数 据 库 中 获 得 肝 细 胞 癌 数 据 表 达 芯 片GSE101685、GSE101728、GSE46408，其中GSE101685 包含正常组织 10 例，肝癌组织 24 例；GSE101728 包 含 正 常 组 织 7 例，肝 癌 组 织 7 例；GSE46408包含正常组织6例，肝癌组织6例。1.2 共差异基因的筛选GEO2R在线分析工具依托R语言limma程序包对基因芯片进行分析，利用 GEO2R(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)对3个基因组表达谱芯片进行分析，以|LogFC1|、矫正P0.9为筛选条件，构建蛋白互作网络，导出结果后，利用Cytoscape软件对蛋白互作网络进行可视化处理，采用 Cyto Hubba插件计算蛋白节点并进行评分，取评分前 20 位的基因再次进行互作分析，将排名前 10 位的基因定义为关键基因（hub基因）。1.5 关键基因的生存分析利用GEPIA网站对筛选后的6个hub基因进行生存分析。打开 GEPIA 后，选择“Expression Analysis”模块，点击“Survival Analysis”，输入基因名称，选择进行总生存率分析或无病生存率分析，选择肝癌，即得到基因表达对肝癌患者生存率的影响。1.6 免疫学机制分析利用 TIMER2.0 数据库对 6 个 hub 基因进行免疫评估。TIMER2.0（http:/p-genomics.org/）数据库提供免疫相关（immune association）、癌症探索（cancer exploration）和免疫评估（immune estimation）分析。利用 TIMER2.0的免疫相关评价模块分别对6个hub基因与肝癌组织免疫浸润情况进行相关性分析。2 结果2.1 肝细胞癌共差异基因的筛选通过GEO2R的分析筛选，获得3组肝细胞癌表达谱芯片差异表达火山图，其中横坐标负值代表下调基因，正值代表上调基因。通过 GEO2R 的分析筛选，根据|LogFC1|、矫正P0.05为筛选标准，得到GSE101685 数据集 DEGs 2 600 个，GSE101728 数据集 DEGs 4 359个，GSE46408 DEGs 4 604个，以韦恩图 取 交 集 获 得 共 差 异 基 因（co-DEGs）798 个，见图1。2.2 GO功能分析和KEGG通路富集分析通过 DAVID 数据库对 798 个共差异基因进行GO分析，结果显示，这些基因主要参与芳香族氨基酸代谢过程，胞内氨基酸代谢过程，细胞对异物的刺激反应等生物过程。同时差异基因主要富集于稠密染色体、着丝粒区域以及有丝分裂纺锤体等区域，参与的分子功能主要有花生四烯酸环氧合酶活性、氨基转移酶活性的调节等。KEGG 富集分析显示，共差异基因主要参与的代谢通路包括细胞周期循环、补体和凝血级联反应、丁酸代谢等通路，见图2。2.3 PPI网络构建及关键基因筛选通过STRING数据库构建蛋白质相互作用网络及 Cytoscape 软件 Cytocubba 插件计算关键节点蛋白，得到 degree前 20的基因，将 20个基因再次构建相互作用网络，将排名前 10 位的基因定义为影响38系统医学 2023 年 6 月第 8 卷第 12 期 基础医学系统研究 SYSTEMS MEDICINE 系统医学肝细胞癌发生发展的关键基因，按照排序分别为CDK1、CCNA2、CCNB1、CDC20、TOP2A、BUB1、KIF11、CCNB2、MAD2L1、ASPM，见图 3，经 TCGA 数据 库 及 HPA 数 据 库 验 证 后，筛 选 得 到 CDK1、CCNA2、CCNB1、CDC20、TOP2A 和 KIF11 这 6 个关键基因，见图4。2.4 预后分析利用GEPIA网站进行肝细胞癌的预后分析，结图1差异基因的筛选注：A为数据集GSE101685、GSE101728、GSE46408的火山图；B为3个数据集的upset图。图2差异表达基因的GO富集分析和KEGG通路分析注：A为GO富集分析；B为KEGG通路分析。39系统医学 2023 年 6 月第 8 卷第 12 期 基础医学系统研究 系统医学 SYSTEMS MEDICINE果显示，6 个 hub 基因高表达均会降低患者的总生存率及无病生存率，其中CDC20在总生存率中的风险比（hazard ratio,HR）值最大，为 2.3，而 CCNB1 在无病生存率中的HR值最大，为2，见图5。图4核心基因在肝癌组织与正常组织中蛋白水平表达量注：A为核心基因蛋白水平表达量分析；B为核心基因的免疫组织化学染色分析；*为P0.01。图3差异基因的PPI互作网络分析及核心基因筛选注：左侧圆环为分数较低基因；右侧外环为分数较高基因；右侧内环为核心基因之间的互作关系。40系统医学 2023 年 6 月第 8 卷第 12 期 基础医学系统研究 SYSTEMS MEDICINE 系统医学2.5 肿瘤免疫微环境分析为了研究6个hub基因高表达导致肝癌患者预后不良的原因，利用TIMER2.0数据库分析hub基因与不同免疫细胞数量的相关性，结果显示，hub基因与大部分T淋巴细胞呈负相关，但与CD4+Th2细胞呈明显正相关（P0.001）。hub基因与中性粒细胞、树突状细胞及 M1 型巨噬细胞相关性较低，与原始巨噬细胞、NK细胞呈负相关，但与肿瘤相关成纤维细胞呈明显正相关（P0.001），见图6。3 讨论对于肝癌的治疗，早期肝癌可以选择的方法有很多，如手术、破坏性治疗等，但由于肝细胞癌的特图5核心基因的生存分析曲线注：A为核心基因的总体生存曲线；B为核心基因的无病生存曲线。41系统医学 2023 年 6 月第 8 卷第 12 期 基础医学系统研究 系统医学 SYSTEMS MEDICINE点，其被早期诊断的可能性并不高，而对于晚期肝癌，主要的治疗手段是让患者服用索拉菲尼7-9，索拉菲尼作为抗肝癌的一线药物，治疗效果显著，但目前已经发现许多患者对索拉菲尼有耐药现象10，其耐药机制也逐渐被发现。所以急需开发治疗晚期肝癌的新型药物，对索拉菲尼进行补充，甚至取代索拉菲尼对肝细胞癌患者进行治疗，近些年肿瘤免疫药物研发产业蓬勃发展，产生了许多针对肝细胞癌的免疫治疗药物，但依然存在治疗效果不确切、治疗范围有限、具有明显不良反应等缺点，因此本文也通过分析肝细胞癌相关免疫机制来进一步为免疫药物的研发提供理论基础。本研究利用GO分析、KEGG分析、STRING数据库分析以以及核心基因计算等手段发现 CDK1、CCNA2、CCNB1、CDC20、TOP2A 和 KIF11 这 6 个基因对于肝细胞癌的发生发展可能具有明显促进作用。肿瘤微环境是指肿瘤的发生发展过程影响其生长、转移等性状的环境因素，包括代谢、分泌、免疫、结构的改变，其中肿瘤周围的免疫环境至关重要，肿瘤可以通过免疫逃逸来躲避免疫细胞的杀伤11-13，找到肿瘤免疫逃逸的机制及重要靶点蛋白对于研发抗肿瘤药物至关重要。本研究发现 6 个图6核心基因与免疫细胞浸润相关性分析注：A为核心基因与T淋巴细胞浸润相关性分析；B为核心基因与其他免疫细胞相关性分析。42系统医学 2023 年 6 月第 8 卷第 12 期 基础医学系统研究 SYSTEMS MEDICINE 系统医学核心基因会导致患者预后不良，通过对核心基因及不同免疫细胞的相关性分析发现，核心基因与大部分 T 淋巴细胞、NK 细胞呈负相关，已有研究表明，CD8+T细胞、NK 细胞对肿瘤起到杀伤作用，是主要抑制肿瘤的免疫效应细胞14，这可能是肝细胞癌免疫逃逸的原因之一。本研究结果显示，所有的核心基因与 CD4+的 Th2 细胞呈现出明显的强烈的正相关，有文献表明，当 Th2 在肿瘤免疫微环境中占主要部分时，会促进肿瘤的进展、转移和一定的耐药性15。另外，有文章报道，肿瘤细胞可以通过刺激胸腺基质淋巴细胞生成素表达促进原始辅助 T 细胞分化为 Th2 细胞，进而促进肿瘤细胞的增殖16。白细胞介素-4 是 Th2 分化的必要细胞因子，同时Th2也会再次分泌白细胞介素-4进行正反馈，但免疫细胞上的白细胞介素-4和白细胞介素-4受体结合 会 导 致 Th2 细 胞 内 STAT6 磷 酸 化、核 易 位 核GATA3 转录因子的表达，导致 Th2 细胞因子的分泌，最终可以促进肿瘤细胞的生长和转移17。以上文献均说明，Th2可能会促进肿瘤细胞的发生和发展。本研究发现，CDK1等6个蛋白与Th2肿瘤浸润呈强相关性，这 6个核心基因导致肝细胞癌患者预后不良的原因可能是通过介导肿瘤细胞周围免疫微环境的变化，促进肿瘤细胞的免疫逃逸，导致患者生存率降低。目前，报道 6 种核心基因与 Th2 细胞相关的研究较少，已有研究者证明 CCNA2 在肿瘤中与 Th2呈正相关18；CCNB1没有报道过在肿瘤患者中与 Th2 细胞之间的关系，但可能在 COVID-19 感染过程中与 Th2 细胞关系比较密切18；TOP2A在肝癌中与 Th2 细胞呈正相关关系19，然而，并没有确切的研究表明 CCNA2、TOP2A 是如何调节 Th2细胞的，同时对于CDK1、CCNB1、CDC20、KIF11这4个基因与 Th2细胞的关系的研究本研究尚属首次，但基因发挥作用的具体机制还不明确，需要进行后续的生物学实验研究验证。综上所述，本研究基于 GEO 及 TCGA 等网络数据库筛选肝细胞癌发生发展的关键蛋白，分析其促癌机制，为后续肝细胞癌的机制研究及药物研发奠定理论基础。参考文献1 Verslype C,Van Cutsem E,Dicato IM,et al.The management of hepatocellular carcinoma.Current expert opinion and recommendations derived from the 10th World Congress on Gastrointestinal Cancer,Barcelona,2008J.Annals of Oncology,2009,20 Suppl 7:vii1-vii6.2 朱翠雯,马甜甜,段怡平,等.基于 TCGA 数据库分析DDX27 在肝细胞癌中的预后价值J.分子诊断与治疗杂志,2023,15(4):549-553.3 姜文雯,余滔,赵露.CT与MR影像学检查在肝细胞癌临床诊断中的应用效果分析J.影像技术,2023,35(2):41-44.4 Xu Z,Peng B,Liang Q,et al.Construction of a ferroptosis-related nine-lncRNA signature for predicting prognosis and immune response in hepatocellular carcinomaJ.Front Immunol,2021,12:719175.5 孟道林,张彤,王翔.代谢相关脂肪性肝病对晚期肝细胞癌索拉菲尼治疗影响分析J.广州医科大学学报,2022,50(5):28-33.6 李晓明,姚立鹏,程丽慧.索拉菲尼对肝细胞癌凋亡和自噬相关蛋白表达的影响及耐药分析J.中国现代普通外科进展,2022,25(1):7-11.7 邓永,唐腾骞,张雷达.miRNA-200b 逆转肝细胞癌HepG2细胞对索拉菲尼的耐药性及其相关机制J.第三军医大学学报,2021,43(22):2435-2440.8 陈奕殷.DMC通过CYP3A5和AMPK通路提高肝细胞癌的索拉菲尼敏感性D.福州:福建医科大学,2021.9 Galle PR,Dufour JF,Peck-radosavljevic M,et al.Systemic therapy of advanced hepatocellular carcinomaJ.Future Oncology(London,England),2021,17(10):1237-1251.10 Tang W,Chen Z,Zhang W,et al.The mechanisms of sorafenib resistance in hepatocellular carcinoma:theoretical basis and therapeutic aspectsJ.Signal Transduct Target Ther,2020,5(1):87.11 权虎,石磊,陈杰,等.肿瘤微环境在肝细胞癌中的研究进展J.肿瘤药学,2023,13(2):150-154.12 田堰鑫,李娜,高雷,等.肿瘤微环境与肝癌干细胞相互作用对肝细胞癌发生发展的影响J.临床肝胆病（下转第52页）43系统医学 2023 年 6 月第 8 卷第 12 期 中西医结合系统研究 系统医学 SYSTEMS MEDICINE参考文献1 殷贞燕,洪文,陈惠娟,等.针灸配合六味地黄汤治疗慢性湿疹患者的临床效果分析J.中医临床研究,2018,10(34):33-35.2 彭琳,穆玉雪,任北大,等.慢性湿疹的脏腑辨证及传变规律J.中华中医药杂志,2018,33(8):3571-3573.3 中国中医药学会皮肤科分会.湿疹(湿疮)中医诊疗专家共识(2016年)J.中国中西医结合皮肤性病学杂志,2018,17(2):181-183.4 李彩彩,尹业辉,杨会生,等.穴位自血疗法治疗慢性湿疹疗效与安全性的系统评价J.中国中医基础医学杂志,2018,24(11):1597-1599,1606.5 蓝海冰,徐萍萍,孙晨,等.运用贺氏针灸三通法对慢性湿疹皮损 EASI 评分及瘙痒症状影响的临床疗效评估J.中国中西医结合皮肤性病学杂志,2017,16(1):52-54.6 刘茵,朱炯.火针治疗慢性湿疹临床疗效及患者EASI、瘙痒评分、血清因子水平影响J.辽宁中医药大学学报,2018,20(5):119-121.7 魏璠,杨佼.外治法治疗湿疹的研究进展J.世界中西医结合杂志,2020,15(7):1369-1372.8 孙悦童,卢益萍.针药综合治疗脾虚湿蕴型湿疹临床观察J.山西中医,2019,35(2):47-48.9 李茜,林诗雨,李晶晶,等.岭南火针治疗慢性湿疹的疗效观察及对患者免疫功能的影响J.河北中医,2018,40(4):600-603.10 刘芳,方剑乔,王晨瑶,等.方剑乔辨治慢性湿疹经验J.浙江中西医结合杂志,2020,30(10):781-782.11 李彩彩,李思婷,尹业辉,等.湿疹的发生及针灸治疗概述J.辽宁中医杂志,2018,45(12):2676-2680.12 赵晶,张树明.针灸疗法在湿疹治疗中的应用进展J黑龙江中医药,2020,49(3):403.13 唐文龙,张仁义,程孝顶,等.针灸综合疗法治疗慢性荨麻疹研究进展J.新中医,2020,52(19):126-128.14 陈凡,姚艳玲,陈佳利,等.温针灸联合刺络拔罐治疗湿疹的临床疗效研究J.中医药学报,2022,50(5):64-68.（收稿日期：2023-03-28）杂志,2023,39(3):684-692.13 Gajewski TF,Schreiber H,Fu YX.Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironmentJ.Nat Immunol,2013,14(10):1014-1022.14 Wang W,Green M,Choi JE,et al.CD8(+)T cells regulate tumour ferroptosis during cancer immunotherapyJ.Nature,2019,569(7755):270-274.15 Lopez-Yrigoyen M,Cassetta L,Pollard JW.Macrophage targeting in cancerJ.Ann N Y Acad Sci,2021,1499(1):18-41.16 Protti MP,De Monte L.Thymic stromal lymphopoietin and cancer:th2-dependent and-independent mechanismsJ.Front Immunol,2020,11:2088.17 Basu A,Ramamoorthi G,Albert G,et al.Differentiation and regulation of th cells:a balancing act for cancer immunotherapyJ.Front Immunol,2021,12:669474.18 Chen S,Zhao Z,Wang X,et al.The predictive competing endogenous rna regulatory networks and potential prognostic and immunological roles of cyclin a2 in pan-cancer analysisJ.Front Mol Biosci,2022,9:809509.19 Li Z,Fang J,Chen S,et al.A risk model developed based on necroptosis predicts overall survival for hepatocellular carcinoma and identification of possible therapeutic drugsJ.Front Immunol,2022,13:870264.（收稿日期：2023-03-27）（上接第43页）52