丹皮治疗新型冠状病毒肺炎的有效成分、核心靶点及作用机制.pdf

山东医药2023 年第 63 卷第 23 期丹皮治疗新型冠状病毒肺炎的有效成分、核心靶点及作用机制俞军1，2，胡阳生1，21 安徽医科大学第一附属医院药学部，合肥230012；2 安徽省公共卫生临床中心摘要：目的基于网路药理学和分子对接技术探讨丹皮治疗新型冠状病毒肺炎（COVID-19）的有效成分、核心靶点及潜在作用机制。方法通过中药系统药理学分析平台（TCMSP）获取丹皮的有效成分及作用靶点，GeneCards和OMIM数据库获得COVID-19相关靶点，两者取交集后获得丹皮治疗COVID-19的潜在靶点。将潜在靶点输入STRING数据库，获取靶点蛋白在生物系统中的相互作用关系，建立蛋白互作网络（PPI）图筛选核心靶点，采用Cytoscape软件绘制 COVID-19-丹皮有效成分靶点网络图，筛选丹皮主要活性成分。对潜在靶点进行 GO和KEGG富集分析，获取潜在靶点的相关分子功能和信号通路。采用Discovery Studio 2019软件对靶点网络图中丹皮主要活性成分及临床常用于治疗COVID-19的药物奈玛特韦、瑞德西韦与COVID-19的药物治疗靶点3CL蛋白酶、血管紧张素转化酶2（ACE2）进行分子蛋白对接。结果共获得丹皮有效成分6个，即槲皮素、丁子香萜、谷甾醇、山奈酚、（+）-儿茶素、单体5-5-（4-甲氧基苯基）-2-呋喃 亚甲基 巴比妥酸（简称巴比妥酸），有效成分作用靶点150个，与COVID-19相关靶点716个取交集后获得丹皮治疗COVID-19的潜在靶点36个。PPI图显示核心靶点主要包括血管内皮细胞生长因子受体（VEGFR）、白细胞介素6（IL-6）、IL-1B等。COVID-19-丹皮有效成分靶点网络图显示，丹皮治疗COVID-19的主要活性成分排名先后顺序为槲皮素、山奈酚、巴比妥酸和（+）-儿茶素，核心靶点为过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARG）、环加氧酶2（PTGS2）、雌激素受体1（ESR1）。GO和KEGG富集分析得到61个分子功能和109个信号通路，分子功能主要包括细胞因子受体结合活性、DNA结合转录因子结合活性、信号受体激活因子活性等，信号通路主要包括脂质与动脉粥样硬化、IL-17、肿瘤坏死因子（TNF）家族等。分子蛋白对接结果显示，与奈玛特韦、瑞德西韦相比，丹皮有效成分巴比妥酸和槲皮素分别与3CL蛋白酶和ACE2有更稳定的结合能力。结论丹皮通过有效成分槲皮素、巴比妥酸、（+）-儿茶素、山奈酚作用于PPARG、PTGS2、ESR1等核心靶点对COVID-19发挥治疗作用，其机制主要与调控脂质与动脉粥样硬化、IL-17、TNF等通路有关。关键词：丹皮；网络药理学；分子对接；槲皮素；血管内皮细胞生长因子受体；新型冠状病毒肺炎doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2023.23.005 中图分类号：R969.4 文献标志码：A 文章编号：1002-266X（2023）23-0019-05Active ingredients，core targets and mechanism of mudan cortex in the treatment of COVID-19YU Jun1，HU Yangsheng1 Department of Pharmacy，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230012，ChinaAbstract：Objective To investigate the active ingredients，core targets，and potential mechanisms of mudan cortex in treatment of corona virus disease 2019（COVID-19）based on network pharmacology and molecular docking.Methods The Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology（TCMSP）was used to obtain the main active ingredient compounds and targets of mudan cortex，and the GeneCards and OMIM databases were used to obtain COVID-19-related targets，and the potential targets of mudan cortex for COVID-19 treatment were obtained by intersecting the above two.The potential targets were input into the STRING database to obtain the interactions of the target proteins in the biological system and to build a PPI network，and the COVID-19-mudan cortex-active ingredient-target network was diagrammed using Cytoscape software.GO and KEGG enrichment analyses were performed on the potential targets to obtain the relevant gene functions and signaling pathways.The Discovery Studio 2019 software was used to perform molecule-protein docking of the main active components of mudan cortex in the target network diagram and the clinically used drugs Nematovir and Ralte基金项目：安徽省高校自然科学研究重点项目（KJ2021A0329）；安徽医科大学校科研基金项目（2018xkj065、2022xkj057）。第一作者简介：俞军（1990-），男，主管药师，主要研究方向为抗炎免疫药理学。E-mail：通信作者简介：胡阳生（1994-），男，主管药师，主要研究方向为抗炎药物合成与药理。E-mail：开放科学（资源服务）标识码（OSID）19山东医药2023 年第 63 卷第 23 期gravir in treatment of COVID-19 with the important targets of COVID-19 3CL protease and angiotensin-converting enzyme 2（ACE2）.Results A total of 6 active ingredients of mudan cortex，quercetin，mairin，sitosterol，kaempferol，（+）-catechin，and 5-5-（4-methoxyphenyl）-2-furyl methylene barbituric acid and 150 their related targets were obtained，and 716 targets related to COVID-19 were intersected to obtain 36 potential targets of mudan cortex for the treatment of COVID-19.The PPI diagram showed that the core proteins were mainly VEGFA，IL-6，and IL-1B.The COVID-19-mudan cortex-active ingredient-target network diagram showed that the active ingredients of mudan cortex for COVID-19 were sequentially，quercetin，kaempferol，barbituric acid，and（+）-catechin，with the main targets of PPARG，PTGS2，and estrogen receptor 1（ESR1）.GO and KEGG enrichment analysis obtained 61 molecular functions and 109 signaling pathways.The molecular functions mainly included cytokine receptor binding，DNA-binding transcription factor binding，and signaling receptor activator activity.The signaling pathways mainly included lipids and atherosclerosis，IL-17，and tumor necrosis factor（TNF）family，etc.The molecular-protein docking results showed that the barbituric acid and quercetin had a more stable binding capacity to 3CL protease and ACE2，respectively，in comparison with Nematovir and Raltegravir.Conclusion Mudan cortex exerts a therapeutic effect on COVID-19 through the active ingredients quercetin，barbituric acid，（+）-catechin，and kaempferol acting on PPARG，PTGS2，and ESR1，etc.，and the mechanisms are mainly related to lipids and atherosclerosis，IL-17，TNF，and other pathways.Key words：mudan cortex；network pharmacology；molecular docking；quercetin；vascular endothelial cell growth factor；COVID-19新型冠状病毒肺炎（COVID-19）是指新型冠状病毒感染导致的肺炎，主要通过呼吸道黏膜形式传播，可以导致发热、呼吸困难、疼痛等症状1。目前，新型冠状病毒已经在全球范围内传播且发展迅速，为做好 COVID-19诊疗工作，中华人民共和国国家卫生健康委员会制定了 新型冠状病毒感染诊疗方案 并更新至试行第十版，并提出针对不同病情严重程度的COVID-19患者给予中医药治疗2。丹皮为毛茛科植物牡丹的干燥根皮，是安徽铜陵等地区产出的著名道地药材，也是 新型冠状病毒感染诊疗方案（试行第十版）中药方剂中的重要组成药材，其作用为解热、镇痛、抗炎，剂型包括片剂、注射剂、软膏剂等，长期应用无明显不良反应3-5。2023年 1月4月，本研究采用网络药理学方法探索丹皮的有效成分、核心靶点及作用机制，联合分子对接技术对COVID-19的药物靶点3CL蛋白酶和血管紧张素转化酶 2（ACE2）进行探究，为 COVID-19 的临床用药和以丹皮有效成分为先导化合物的开发提供依据。1 材料与方法 1.1丹皮有效成分及作用靶点筛选通过中药系统药理学分析平台（TCMSP，https：/tcmsp- 相关靶点筛选通过 GeneCards（https：/www.genecards.org/）和 OMIM（https：/omim.org/）数据库，检索关键词“COVID-19”，获得疾病相关靶点。1.3丹皮治疗 COVID-19 的潜在靶点筛选将“1.1”获取的丹皮有效成分作用靶点和“1.2”获取的 COVID-19相关靶点绘制Venn图，获得丹皮治疗COVID-19的潜在靶点。1.4丹皮治疗 COVID-19 的核心靶点筛选将“1.3”得到的丹皮治疗 COVID-19 的潜在靶点导入STRING 数据库（https：/cn.string-db.org/），选择“Multiple protein”和“Homo sapiens”，获取靶点蛋白在生物系统中的相互作用关系，绘制蛋白互作网络（PPI）图。运用R语言对PPI结果进行计数，获得核心蛋白的相关信息。1.5丹皮治疗 COVID-19 的主要活性成分筛选采用 Cytoscape（v.3.7.1）软件绘制 COVID-19-丹皮有效成分靶点网络图。该网络图表示COVID-19与丹皮及其有效成分和作用靶点之间的相互作用，图中同种颜色图形大小代表degree值的大小，其值越大表明丹皮对于 COVID-19的治疗越重要，筛选丹皮治疗COVID-19的主要活性成分。1.6丹皮治疗 COVID-19 潜在靶点的相关功能及通路富集分析通过R语言及“RSQLite”“BiocManager”“Colorspace”“Stringi”“DOSE”“ClusterProfiler”“Pathview”等软件包，将丹皮治疗COVID-19的潜在靶点名称转换为基因ID，分别进行GO功能富集分析（主要进行分子功能富集分析）和KEGG通路富集分析，绘制富集分析图，并展示排名前15位的富集分析结果。20山东医药2023 年第 63 卷第 23 期1.7丹皮治疗COVID-19的主要活性成分与COVID-19药物治疗靶点的结合能力观察采用分子蛋白对接技术。通过PubChem数据库收集COVID-19-丹皮有效成分靶点网络图中丹皮的主要活性成分及临床常用于治疗 COVID-19 的药物奈玛特韦（Nirmatrelvir）、瑞德西韦（Remdesivir）的3D结构图，PDB 数据库（https：/www.rcsb.org/）下载 COVID-19 的药物治疗靶点 3CL 蛋白酶（PDBID：7E18）和ACE2（PDBID：7EFP）的蛋白结构。采用 Discovery Studio2019软件进行分子配体处理，以及蛋白去除水分子、加氢、删除配体等处理，通过LibDock进行分子蛋白对接，计算结合能，结合能数值越低表示结合能力越稳定。2 结果 2.1丹皮治疗 COVID-19 的有效成分及潜在靶点筛选结果初步获得丹皮有效成分6个，即槲皮素、丁子香萜、谷甾醇、山奈酚、（+）-儿茶素和单体5-5-（4-甲氧基苯基）-2-呋喃 亚甲基 巴比妥酸（简称巴比妥酸）；初步获得丹皮作用靶点237个，去除重复靶点后共筛选出相关靶点150个，见表1。通过GeneCards和OMIM数据库获得COVID-19相关靶点 731个，除去重复靶点后共得到 716个。通过Venny图获得丹皮治疗COVID-19的潜在靶点36个，见OSID码图1。2.2丹皮治疗 COVID-19 的核心靶点筛选结果排名前30位的核心靶点主要包括血管内皮细胞生长因子受体（VEGFR）、表皮生长因子受体（EGFR）、内皮型一氧化氮合酶（NOS3），炎症相关蛋白主要包括白细胞介素（IL）-6、IL-1B、IL-10、IL-2，趋化因子配体 2（CCL2）、CXC 趋化因子配体 10（CXCL10），丝裂原激活蛋白激酶8（MAPK8）、信号转导与转录激活因子 1（STAT1）、C 反应蛋白（CRP）、CD40 配 体（CD40LG）、聚-ADP-核 糖 聚 合 酶 1（PARP1）、前列腺素G/H合酶2（PTGS2）、纤溶酶原激活物抑制剂1（SERPINE1）、中性粒细胞胞质溶胶因子1（NCF1）；凋亡相关蛋白如基质金属蛋白酶9（MMP-9）、胱天蛋白酶 8（CASP8）、热休克蛋白 1（HSPB1）、芳 香 烃 受 体（AHR）、血 红 素 加 氧 酶（HMOX1），脂类代谢相关蛋白如过氧化物酶体增殖 物 激 活 受 体（PPARG）、糖 原 合 酶 激 酶 3（GSK3B）、超氧化物歧化酶 1（SOD1），其他还有雄激素受体（AR）、雌激素受体 1（ESR1）、选择素 E（SELE）。丹皮治疗COVID-19潜在靶点的PPI图见OSID码图2。2.3丹皮治疗 COVID-19 的主要活性成分筛选结果丹皮治疗COVID-19的主要活性成分排名先后顺序为槲皮素、山奈酚、巴比妥酸和（+）-儿茶素，排名前 10 位的靶点分别为 PPARG、PTGS2、ESR1、受体蛋白酪氨酸激酶（INSR）、AHR、SELE、细胞色素p450 3A4酶（CYP3A4）、HMOX1、STAT1和B淋巴细胞瘤2（BCL2）。COVID-19-丹皮有效成分靶点网络图见OSID码图3。2.4丹皮治疗COVID-19潜在靶点的GO和KEGG富集分析结果共获得61条GO功能富集分析结果和109条KEGG通路富集分析结果，见OSID码图4。GO功能富集结果显示，分子功能主要与细胞因子受体结合活性、DNA结合转录因子结合活性、信号受体激活因子活性、转录辅助激活因子、核受体活性、生长因子受体结合、激酶调控活性、蛋白磷酸化结合等相关。KEGG通路富集分析结果显示，丹皮治疗COVID-19主要与脂质与动脉粥样硬化、IL-17信号通路、缺氧诱导因子1（HIF-1）信号通路、肿瘤坏死因子（TNF）家族信号通路、C-型凝集素受体信号通路等相关。2.5丹 皮 治 疗 COVID-19 的 主 要 活 性 成 分 与COVID-19 药物治疗靶点的结合能力山奈酚与COVID-19药物治疗靶点3CL蛋白酶、ACE2分子对接时均未发现对接位点，因此没有结合能。与3CL蛋白酶结合稳定的先后顺序为巴比妥酸、奈玛特韦、槲皮素和（+）-儿茶素，其结合能分别为185.854 1、163.508 3、109.417 0、69.357 3 kJ/mol，其中巴比妥酸较奈玛特韦具有更低的结合能。与ACE2结合稳定的先后顺序为槲皮素、瑞德西韦、（+）-儿茶素和巴比妥酸，其 结 合 能 分 别 为 201.222 1、表1丹皮有效成分及靶点筛选结果Mol IDMOL000098MOL000211MOL000359MOL000422MOL000492MOL007374分子名称槲皮素丁子香萜谷甾醇山奈酚（+）-儿茶素巴比妥酸相对分子量302.25456.78414.79286.25290.29312.30OB（%）46.4355.3836.9141.8854.8343.44DL0.280.780.750.240.240.30靶点数154 1 3 63 11 521山东医药2023 年第 63 卷第 23 期168.723 3、110.665 9、107.239 8 kJ/mol，其中槲皮素较瑞德西韦具有更低的结合能。分子蛋白对接图见OSID码图5。3 讨论 本研究通过网络药理学的方法共获得丹皮有效成分6个，包括槲皮素、丁子香萜、谷甾醇、山奈酚、（+）-儿茶素、巴比妥酸；通过分子对接的方法证实，相比于奈玛特韦和瑞德西韦，槲皮素与3CL蛋白酶、ACE2具有较低的结合能，对接更稳定，这与已有的研究结果相似7。槲皮素具有广泛的抗病毒和抗炎特性，可干扰病原体发挥毒性的多个步骤，如病毒进入、病毒复制、蛋白质组装等，当与维生素C联合用药时，可用于 COVID-19患者呼吸道感染的预防和早期治疗8。此外，抑制IL-17及其信号通路是槲皮素作用于 COVID-19的机制之一，并在临床取得较好的治疗效果9。相比于瑞德西韦或法比拉韦单独用药，当槲皮素联合用药时可缩短 COVID-19患者的住院时间，降低血清标志物碱性磷酸酶、CRP、乳酸脱氢酶的水平，升高血红蛋白水平和呼吸频率10。但与其他多数中药来源的有效成分一样，槲皮素存在生物利用度相对较低等问题。一种磷脂递送形式的槲皮素（槲皮素植物体）应用于12例健康志愿者的临床试验结果发现，槲皮素的生物利用度被提高约20倍，且没有明显的不良反应，为以槲皮素及其先导化合物的临床治疗药物的开发提供了重要参考11-12。MISHRA 等13收集了 75种美国 FDA 批准的潜在抗 COVID-19 药物，与 3CL 蛋白酶、ACE2 等药物治疗靶点进行分子对接和分子动力学模型筛选，最终显示（+）-儿茶素对多种靶蛋白具有更好的结合力和良好的分子相互作用，可作为潜在的抗COVID-19 的多靶点药物14。此外，儿茶素衍生物也具有抗 COVID-19 的潜力。ARIF 等15以（+）-儿茶素作为先导化合物，通过乙酸酯化等合成获得3种儿茶素衍生物，与奈非那韦相比，这 3种儿茶素衍生物与 3CL蛋白酶均具有较稳定的结合能。有研究进一步对（+）-儿茶素的化学结构引入不同基团，如酯基、乙酰基和邻苯三酚基等，结果显示均可以提高其抑制COVID-19的活性16。研究发现，COVID-19患者肺部显示出细胞膜破坏相关的严重内皮损伤等血管特征。ACKERMANN 等17对 7例死亡的 COVID-19患者肺部组织进行基因表达检测，结果发现VEGFR、HSPB1、IL-6、CXCL10、TNF 超家族成员 1A（TNFR1）/12A、SERPINE1、HMOX1等基因表达均升高，而上述基因均为丹皮治疗 COVID-19的重要靶点，可作为后续的研究基础。此外，VEGFR也是COVID-19恢复期治疗COVID-19合并肺纤维化的重要靶点之一18。一项纳入 6 例重症 COVID-19 患者的研究显示，在患者血液和肺气管吸入物中分离的中性粒细胞可形成炎症小体，随后小体激活释放的自分泌IL-1B前馈循环可导致成人呼吸窘迫综合征、细胞因子风暴和微血管血栓的发展，并最终引起多器官衰竭19。COVID-19感染伴动脉粥样硬化的特征是脂质及其相关蛋白的渗透、沉积和氧化，内皮损伤、激活并促进炎症的维持20。一项美国纽约多家医院纳入的5 700例COVID-19患者的队列研究发现，有心血管基础疾病的患者比没有基础疾病的患者病死率明显升高21。槲皮素可以改善动脉粥样硬化，减少炎症淋巴细胞和巨噬细胞的动脉浸润22。（+）-儿茶素可通过降低巨噬细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞中活性氧的产生，降低血浆中三酰甘油的水平及促进动脉粥样硬化基因IL-1B、IL-6、MMPs等表达，最终发挥治疗脂质升高和动脉粥样硬化的作用23。综上所述，丹皮通过有效成分槲皮素、巴比妥酸、（+）-儿茶素、山奈酚作用于 PPARG、PTGS2、ESR1 等核心靶点对 COVID-19 发挥治疗作用，其机制主要与脂质与动脉粥样硬化、IL-17、TNF等通路有关。本研究探讨了丹皮及其有效成分对 COVID-19 的作用靶点及信号通路，为以丹皮为组成成分的中药方剂及未来以丹皮有效成分作为先导化合物治疗 COVID-19 的药物研发等提供了研究基础。参考文献：1ZHU N，ZHANG D，WANG W，et al.A novel coronavirus from patients with pneumonia in China，2019J.N Engl J Med，2020，382（8）：727-733.2 新型冠状病毒感染诊疗方案（试行第十版）EB/OL.http：/ J.中药材，2019，42（3）：541-544.4罗太梅.皮敏消胶囊联合丹皮酚软膏治疗皮肤瘙痒症疗效分析 J.中国处方药，2020，18（6）：68-69.5刘丽英，王九妹，初金玉.盐酸西替利嗪滴剂联合丹皮酚软膏治疗儿童过敏性皮炎疗效观察及护理对策分析 J.中国现代药物应用，2017，11（6）：164-165.6BAI L L，CHEN H，ZHOU 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