丹栀逍遥合剂对乳腺增生模型大鼠的药效学研究.pdf

42DOl:10.16720/ki.tcyj.2022.121Special Wild Economic Animal and Plant Research特产研究丹逍遥合剂对乳腺增生模型大鼠的药效学研究袁名扬1,李新1,丁匀乔1,周学刚2,蒋蕾2,杨波1*，彭海生2（1.哈尔滨商业大学药学院，黑龙江哈尔滨150 0 7 6;2.哈尔滨医科大学大庆校区药学院，黑龙江大庆16 3319)摘要：本研究通过复制大鼠乳腺增生模型，探讨丹逍遥合剂抗乳腺增生的作用。采用苯甲酸雌二醇一黄体酮联用对雌性SD大鼠进行肌内注射造模，造模后分为模型组，他莫昔芬组，丹逍遥合剂低、中、高剂量组，灌胃给药2 0 d，治疗结束后计算胸腺和子宫指数，测量血清中雌二醇(E2)及孕酮(P)含量，观察大鼠乳腺病理组织形态。结果显示：同模型组相比，各组大鼠子宫指数明显下降，胸腺指数明显上升，E2含量降低，P水平增高，以上均有显著性差异。他莫昔芬组和丹逍遥合剂高剂量组乳腺组织病理形态基本接近正常组。丹逍遥合剂能抑制大鼠乳腺增生引起的乳头红肿和子宫肥大，同时调节血清激素水平，从而起到抗乳腺增生的作用。关键词：丹逍遥合剂；乳腺增生；药效学中图分类号：R285.5The Pharmacodynamics Studies of Danzhi Xiaoyao Mixtures inMammary Gland Hyperplasia Model Rats文献标志码：A文章编号：10 0 1-47 2 1(2 0 2 3)0 4-0 0 42-0 5YUAN Mingyang,Li Xin,DING Yunqiaol,ZHOU Xuegang?,Jiang Lei2,Yang Bol*,PENG Haisheng2*(1.Department of Pharmacy,Harbin University of Commerce,Harbin 150076,China;2.Department of Pharmacy,DaqingCampus,Harbin Medical University,Daqing 163319,China)Abstract:In this study,the anti-mammary gland hyperplasia effect of Danzhi Xiaoyao mixtures was investigated by replicating the rat modelof mammary gland hyperplasia.Female SD rats were modeled by intramuscular injection of estradiol benzoate-progesterone combination.After modeling,they were divided into the model group,tamoxifen group,and Danzhi Xiaoyao mixture were divided into the low,mediumand high dose group.Stomach administration for 20d.After the treatment,the thymus and uterine indexes were calculated,the serum estra-diol(E2)and progesterone(P)contents were measured,and the histopathological morphology of the rat mammary glands was observed.Theresults showed that compared with the model group,the uterine index of the rats in each group was significantly decreased,the thymus indexwas significantly increased,the E2 content was decreased,and the P level was increased,all of which were significantly different.The pat-hological morphology of breast tissue in the tamoxifen group and the high-dose Danzhi Xiaoyao mixtures group was basically close to thenormal group.Danzhi Xiaoyao mixtures can inhibit the redness and swelling of nipples and uterine hypertrophy caused by mammary glandhyperplasia in rats,at the same time,regulating the level of serum hormones,so as to play an anti-mammary gland hyperplasia effect.Key words:Danzhi Xiaoyao mixtures;mammary gland hyperplasia;pharmacodynamics乳腺增生是一种腺体过度增殖引起的良性增生疾病，是最常见的乳腺疾病。乳腺增生的发病群体主要是中年女性,但在近些年呈现年轻化的趋势 1。中医认为收稿日期:2 0 2 2-0 4-2 9基金项目：黑龙江省自然科学基金联合引导项目（LH2019H011)；黑龙江省中医药管理局项目（ZHY18-153)作者简介：袁名扬（19 9 6-），女，辽宁朝阳人，硕士，从事中药剂型现代化研究。通讯作者：杨波（19 7 7-)，男，山东牟平人，博士，教授，硕士生导师，从事药物制剂的制备及质量标准研究；彭海生（19 7 5-），男，黑龙江哈尔滨人，博士，教授，硕士生导师，从事Polymer合成、纳米载体设计与调控研究。乳腺增生的病因主要是肝气郁结导致的乳络不通，而现代医学则认为该病是由内分泌失调等激素紊乱因素造成的。乳腺增生患者病发时会感到乳房疼痛，甚至可第4期以触到小结节，病程容易反复，严重时会有致癌倾向，对患者的生活和健康造成了不便和危害 2 。因此,乳腺增生的治疗已经成为国内外研究的热点。西医学治疗乳腺增生主要选择激素类药物或手术治疗，激素类药物如他莫昔芬和甲睾酮等可调节雌激素水平，但不良反应多，且容易复发 3。而中医治疗比较温和，包括外治法和口服中药治疗。外治法如针刺法、推拿按摩和艾灸等。中药治疗主要采取复方用药，逍遥散和小金丸等更是被收入2 0 2 0 年版中国药典。丹逍遥散为方剂学所出的中医经典方剂，,药用牡丹皮、子、茯苓、白术、薄荷、甘草、柴胡、白芍及当归。该方可治疗干眼症、女性更年期高血压、焦虑症、绝经和慢性胆囊炎等疾病 4,5，同时还具有调气通达、养肝补脾、疏肝解郁、缓解心志郁结和调摄失宜等作用，对肝气郁结、气滞血瘀导致的乳腺结节和甲状腺结节等上部增生具有很好的疗效。本研究将丹逍遥散制成合剂，易于携带和服用，更容易被患者所接受，患者依从性好，具有很好的疗效 6 。通过复制乳腺增生大鼠模型，以他莫昔芬作为阳性对照药，将丹逍遥散制成合剂，治疗乳腺增生大鼠，探究丹逍遥合剂的疗效，为乳腺增生临床用药提供理论依据，同时为进一步的生产扩大化奠定基础，为乳腺增生患者带来福音。1材料1.1仪器倒置荧光生物显微镜（德国徕卡公司）；多功能酶标仪（美国伯腾公司）；振荡培养箱（哈尔滨东联电子公司）；电子天平（龙腾电子公司）。1.2药物和试剂苯甲酸雌二醇注射液（杭州动物药品厂，兽药字110202511)；黄体酮注射液（天津金耀药业有限公司，国药准字H12020534)；丹逍遥合剂（自制）；枸橡酸他莫昔芬片（扬子江药业集团，国药准字H32021472)；大鼠雌二醇(E2)ELISA试剂盒（武汉伊莱瑞特有限公司，批号E-OSEI-M0002)；大鼠孕酮(P)ELISA试剂盒（武汉伊莱瑞特有限公司，批号E-El-0154c)；橄榄油（杭州联科美迅有限公司）。牡丹皮、子、茯苓、白术、薄荷、甘草，柴胡、白芍及当归均由亳州长征中药饮片有限公司提供，生产许可证号皖2 0 16 0 12 7，质检员0 1，执行标准为2 0 15年版中国药典一部 7 。袁名扬，等：丹逍遥合剂对乳腺增生模型大鼠的药效学研究丹逍遥合剂的制备称取处方量的9 味饮片共7 3g，置于锅中，倒入少量水浸泡，于高压锅中蒸煮2 h，滤过，离心，取上清即得丹逍遥合剂。2.2模型的复制及给药雌性SD大鼠6 0 只，随机取出10 只作为正常组，剩余大鼠按苯甲酸雌二醇一黄体酮联用方法复制乳腺增生模型，即首先后肢肌内注射苯甲酸雌二醇0.5mg/（k g d)，连续2 0 d，然后腹腔注射黄体酮4mg/(kg?d),连续5d8。造模后的老鼠表现得精神不佳，毛发无光泽，食欲下降，随机取1只剥离乳腺，观察病理形态,判断成模 9 。成模后的大鼠随机分为5组，每组10 只，即他莫昔芬组，模型组，丹逍遥合剂低、中、高剂量组。他莫昔芬组给予枸橡酸他莫昔芬片混悬液1.8 mg/(kgd)10;丹逍遥合剂低、中、高3个治疗组分别灌胃6.57 g生药/(kgd)、13.14g 生药/(kgd)和2 6.2 8 g生药/(kgd)；正常组给予等体积生理盐水灌胃治疗，连续2 0 d。2.3观察指标与取材方法2.3.1E2和P含量的测量心尖取血10 mL,3000r/min离心30 min,取上清于4环境放置2 h后备用。按E2试剂盒和P试剂盒说明书检测方法,检测各组大鼠血清中E2及P的水平。2.3.2胸腺及子宫指数的计算大鼠取血后脱颈处死,称体质量,剥离胸腺及子宫,称重,计算脏器指数 9 。胸腺/子宫指数_mmp/m子查m大鼠2.3.3孚乳腺组织病理形态的观察剥离大鼠第4对乳腺组织，常规制作蜡块，5m切片，HE染色观察。2.4 统计学方法采用SPSS26软件，计量数据使用均数标准差(xs)表示,对组间采取方差分析，以=0.05为检验水准。3结果3.1大鼠乳头及体重的变化采用苯甲酸雌二醇一黄体酮联用方法对雌性大鼠造模，造模前后大鼠乳头外观如图1所示，结果表明431.3实验动物SD大鼠（SPF级)6 0 只，雌性（2 0 9 2 45g），辽宁长生生物技术股份有限公司，合格证号SCXK（辽）2020-0002。2方法2.1量末次给药48 h后，大鼠44造模后的大鼠乳头红肿且高挺。造模后大鼠食欲不振，毛发失去光泽，造模后的大鼠与正常组相比体重有明显差异(P0.01)，同组内大鼠同造模前体重相比增长缓慢，以上均证明造模成功。治疗2 0 d后，同正常组相比，模型组和丹逍遥合剂低剂量组大鼠体重有显著性差异(P0.01)，他莫昔芬治疗组接近正常大鼠体重，丹逍遥合剂中、高治疗组的大鼠体重增长速度有改善，说明有治疗效果，见表1。Table 1Effect of Danzhi Xiaoyao Mixtures on weight of rats(n=10)组别剂量/(g/kg)GroupDose正常组模型组他莫昔芬组低剂量组中剂量组高剂量组注：与模型组比较，1.P0.05,2.P0.01，下表同。Note:Compared with the model group,1.P 0.05,2.P 0.01,same as the table below.3.2对E2、P含量的影响按照试剂盒说明书检测方法检测发现，同模型组相比，正常组和各治疗组大鼠血清中E2含量明显下降，而P的含量则显著上升，且差异均有统计学意义Table 2Effect of Danzhi Xiaoyao Mixtures on E2 and P content in rats(n=10)组别 Group剂量/(g/kg)Dose正常组模型组他莫昔芬组低剂量组中剂量组高剂量组18.000016.000.014.000012.0000(Tu/u)/唐号10.0000特表1丹逍遥合剂对大鼠体重的影响(n=10)造模前/gBefore modeling209.8 0.7210.9 1.40.001 8211.1 0.46.57212.2 1.713.14210.8 0.526.28210.9 0.9(P0.05)，说明丹逍遥合剂可能通过调节血清中E2和P的水平，治疗乳腺增生大鼠，且丹逍遥合剂高剂量组具有很好的疗效，见表2 和图2。表2 丹逍遥合剂对大鼠E2、P含量的影响(n=10)E2/(ng/mL)5.706 8 0.372 1215.763 1 0.54620.001 87.803 3 0.815 526.5714.547 5 1.164 2113.1411.761 8 1.176 5226.287.319 6 0.999 22E2P产*研A注：A.造模前大鼠乳头外观；B.造模后大鼠乳头外观。Note:Appearance of rat nipples before modeling;B.Appearance of rat nipplesaftermodeling.Fig.1 Changes in the appearance of the nipples in rats3.3对脏器指数的影响大鼠死亡后称大鼠体质量、胸腺及子宫湿重，计算脏器指数发现：同模型组比较，正常组和他莫昔芬治疗究图1大鼠乳头的外观变化造模后/gAfter modeling225.6 2.0220.8 0.72220.6 3.02220.8 1.92220.8 1.82221.7 1.322023年第45卷第4期B治疗 2 0 d/gTreatment 20 d245.6 2.9239.8 5.82244.2 4.4240.5 2.32243.8 2.01243.7 5.21P/(ng/mL)10.087 3 0.348 424.293 8 0.326 39.525 2 0.483 925.405 8 0.668 326.956 1 0.641 528.705 9 0.692 228.00006.00004.00002.00000.0000正常组Normal group Model group TMXF group Low dose Medium dose High dosegroup组别/组Group图2丹逍遥合剂对大鼠E2和P含量的影响Fig.2 Effect of Danzhi Xiaoyao Mixtures on E2and P content in rats组、丹逍遥合剂中剂量治疗组及高剂量治疗组大鼠胸腺指数显著增大，子宫指数显著减小(P0.01)。说明乳腺增生可能会引起大鼠子宫肥大，胸腺变小，而丹模型组他莫营芬组低剂量组，中剂量组高剂量组groupgroup逍遥合剂可以缓解脏器病变，增强大鼠免疫功能，从而起到抗乳腺增生的治疗作用，见表3和图3。第4期组别Group正常组模型组他莫昔芬组低剂量组中剂量组高剂量组3.50水3.002.50（3/&u)/深器班2.001.501.000.500.00Normal group Model group图3丹逍遥合剂对大鼠脏器指数的影响Fig.3 Effect of Danzhi Xiaoyao Mixtures on viscera index of rats3.4对乳腺病理形态的影响大鼠腋下第4对乳腺切片染色后，置光学显微镜袁名扬，等：丹逍遥合剂对乳腺增生模型大鼠的药效学研究表3丹逍遥合剂对大鼠脏器指数的影响(n=10)Table 3Effect of Danzhi Xiaoyao Mixtures on viscera index of rats(n=10)剂量/(g/kg)Dose0.001 86.5713.1426.28胸腺指数子宫指数Thymus indexUterine index水*正常组模型组他莫营芬组低剂量组中剂量组高剂量组TMXFgroupLowdoseMediumdosegroupgroup组别/组Group45胸腺指数/(mg/g)子宫指数/(mg/g)Thymus indexUterine index1.98 0.1222.57 0.0821.54 0.093.20 0.081.93 0.1122.64 0.0621.61 0.053.10 0.1111.75 0.0522.79 0.0621.94 0.0722.64 0.082下观察发现：正常组大鼠乳腺组织细胞形状规则，有少量结缔组织和空泡状脂肪细胞，无增生性病变和分泌物。模型组乳腺含有部分导管，多个巨大的小叶腺泡，*腺泡形状不规则且向外延伸，周围或有小脂滴，内含分泌物。他莫昔芬组乳腺含有少量腺泡单位和导管，腺泡变小，内含少量分泌物，无明显增生性病变，乳腺组织细胞形状规则，趋近于正常组织。丹逍遥合剂剂High dose量由低到高，导管和腺泡的扩张随之降低，腺泡的数group量也随之减少，且腺泡的形状变得小而圆，分泌物也逐渐减少，增生性病变逐渐得到抑制，说明丹逍遥合剂具有很好的疗效，可以缓解乳腺增生大鼠乳腺组织的病变。ABCD注：A.正常组；B.模型组；C.他莫昔芬组；D.丹逍遥合剂低剂量组；E.丹逍遥合剂中剂量组；F.丹逍遥合剂高剂量组。Note:A.Normal group;B.Model group;C.TMXF group;D.Danzhi Xiaoyao Mixtures low-dose group;E.Danzhi Xiaoyao Mixtures medium dose group;F.Danzhi XiaoyaoMixture High-dosegroup.E图4大鼠乳腺组织病理切片图（HE，40 0)Fig.4 Histopathological section of rat mammary gland(HE,400)F464讨论乳腺增生是中年女性常发疾病，主要是由于乳腺小叶发生增生引起的异变，病发时乳房肿痛僵硬，且容易反复，严重地影响患者的身体健康和生活，致癌后更是危害患者的生命 12 。因此，治疗乳腺增生刻不容缓，临床用药的选择更是成为研究的热点。现代医学认为，乳腺增生的发病原因主要是由于下丘脑一垂体一卵巢轴调节雌激素和孕激素的紊乱，因而用药更偏重于激素类药物 13。他莫昔芬是乳腺癌患者最常用的药物,作为雌激素受体拮抗剂，可以产生抗效应，减少雌激素水平，缓解乳腺小叶的增生 14。而中医则认为乳腺增生为乳癖范畴，发病机制为肝气郁结不顺、血液不通及脾胃寒虚等多种原因，同时患者的心理状态和饮食也有一部分影响 15。丹逍遥合剂中柴胡和白芍为君药，二者可归肝入胆经。白芍敛阴补血、止痛下气，而柴胡养肝助肝，二者在太平惠民和剂局方中同属药对，共用可调理肝气,治疗情志抑郁,活血化瘀,共奏疏肝解郁之功效 16 。当归和子为臣药，当归和血止痛，滋养脾胃 17 ,子入肝胆，去热清火，二者共助君药疏散?血。生白术和茯苓为佐药，养血柔血，健脾益气，气血同治，使祛邪而不伤正，散热而不烦体。其余均为使药，补气益气，调和药性，辅助其他药材保护肝脏，疗养身体，共奏疏肝化瘀，行气?血之功。本研究通过激素紊乱复制大鼠乳腺增生模型，使用他莫昔芬作为阳性药对比疗效，结果证明丹逍遥合剂可以抑制乳腺增生引起的大鼠乳头的红肿等外观形态的异常，调节大鼠血清中E2和P水平,缓解子宫肥大，从而增强大鼠免疫功能，起到抗乳腺增生大鼠的作用。综上，丹逍遥合剂能够显著治疗乳腺增生大鼠，为乳腺增生患者用药提供新思路，方便中医临床用药。然而丹逍遥合剂治疗乳腺增生的药效基础和具体分子作用机制仍未证明，日后试验中可能会进行研究，为该合剂的大量生产和临床使用奠定基础。特产研究参考文献1 COWIN P,WYSOLMERSKI J.Molecular mechanisms guid-ing embryonic mammary gland developmentJ.Cold SpringHarbor Perspectives in Biology,2010,2(6):a003251.2 COTE M L,RUTERBUSCH J J,ALOSH B,et al.Benign bre-ast disease and the risk of subsequent breast cancer in AfricanAmerican womenJ.Cancer Prev Res(Phila),2012,5:1375-80.3 JIA Y,LIU X,JIA Q,et al.The anti-hyperplasia of mammarygland effect of protein extract HSS from Tegllarca granosaJ.Biomedicine&Pharmacotherapy=Biomedecine&Pharma-cotherapie,2017,85:1-6.4李胤.中药丹逍遥散对焦虑症的治疗作用评价 .中国医药指南,2 0 2 1,19(2 8):1-3.5吕佳.焦虑症采用丹逍遥散治疗的效果 J.中国医药指南,2021,19(32):30-32.6施红，杨奇红，张捷平，等.石斛合剂对高脂高糖加STZ造模大鼠的作用及机制探讨 J.中药药理与临床，2 0 0 2(3):2 2-2 3.7国家药典委员会.中华人民共和国药典 S北京：中国医药科技出版社,2 0 15.8唐天乐，孙阳，李宇华，等.平消胶囊对乳腺增生模型小鼠的药效学研究 J.中南药学,2 0 2 0,18(11):18 37-18 41.9温亚娟.海马对大、小鼠乳腺增生动物模型的干预作用研究 D.郑州：河南中医药大学，2 0 18.10王莹莹.中药复方利乳康对乳腺增生的作用及机制研究 D.成都：成都中医药大学，2 0 19.11关晴,赵海平，王东旭，等.鹿角盘水提物对小鼠乳腺增生的作用效果及其机制研究 .中国畜牧兽医，2 0 19，46(1)：296-304.12钱梦.肝郁证雌性大鼠乳腺的癌前基因表达及柴胡疏肝散的干预作用 D.北京：北京中医药大学，2 0 18.13李军梅，刘建勋，邢泽田，等.乳结消颗粒对肝郁气滞型乳腺增生模型大鼠的影响 J.中药新药与临床药理,2 0 2 0,31(6):627-636.14刘德亮.增液汤对津亏衰老便秘大鼠肠道菌群及宿主代谢影响研究 D.广州：广东药科大学，2 0 18.15李文杰,郭新荣,蒋啸,等.中药外敷治疗乳腺增生用药规律分析 J.中国中医药信息杂志，2 0 2 0,2 7(8)：10 6-111.16李冀，李想，高彦宇，等.柴胡一白芍配伍临床应用及现代药理学研究进展 J.辽宁中医药大学学报，2 0 19,2 1(7)：8-12.17张婷婷,王苹,张建伟,等.当归芍药散加味方对乳腺增生模型大鼠乳腺上皮组织ERK表达的影响 J.福建中医药，2 0 15,46(3):44-46.2023年第45卷第4期