甜菜几丁质酶和_1_3_葡聚糖酶活性与其对丛根病抗性的关系.pdf

281植物生理与分子生物学学报,J o u r n a l o f P l a n t P h y s i o l o g y a n d Mo l e c u l a r B i o l o g y 2 0 0 5,3 1 (3):2 8 1-2 8 62 0 0 4-0 8-2 6 收到，2 0 0 5-0 3-1 1 接受。国家自然科学基金项目(N o.3 0 3 6 0 0 5 9)资助。*E-ma i l:s y z h 3 6 y a h o o.c o m.c n;T e l:0 4 7 1-4 3 0 1 7 0 9甜菜几丁质酶和-1,3-葡聚糖酶活性与其对丛根病抗性的关系张少英1,2*，王俊斌2，王海凤2，邵金旺2，李国龙2，李晓东3(1东北农业大学农学院，哈尔滨1 5 0 0 3 0；2内蒙古农业大学甜菜生理研究所，呼和浩特0 1 0 0 1 8；3内蒙古农业科学院甜菜研究所，呼和浩特 0 1 0 0 3 1)摘要：应用比较生理学方法，以抗丛根病(r h i z o m a n i a)性不同的4 个甜菜品种为材料，研究了丛根病地和无丛根病地上抗、感病品种的几丁质酶(c h i t i n a s e)和-1,3-葡聚糖酶(-1,3-g l u c a n a s e)活性与甜菜抗丛根病的关系。抗病品种在病地和无病地上皆比感病品种具有较高的几丁质酶和-1,3-葡聚糖酶活性，表明这两种酶与甜菜抗丛根病性有关；另外，病地上两种酶的活性均不同程度地高于无病地上，是病原物侵染诱导抗性的表现。关键词：甜菜；丛根病；几丁质酶；-1,3-葡聚糖酶中图分类号：Q 9 4 5甜菜丛根病是目前甜菜生产上最严重的病害之一。甜菜感染丛根病后，块根产量和含糖率大幅度下降，给甜菜生产及其制糖业造成巨大的经济损失(王瑞刚等2 0 0 0；杨继春等2 0 0 3)。该病害是由甜菜坏死黄脉病毒(b e e t n e c r o t i c y e l l o w v e i n v i r u s，B N Y V V)侵染，以低等真菌甜菜多粘菌(P o l y m y x ab e t a e)为传播介体的一种土传病毒病(李彦丽和齐兴亚2 0 0 1；杨继春等2 0 0 3)。近年来两种细胞壁水解酶(c y t o h y d r o l a s e)即几丁质酶(c h i t i n a s e)和-1,3-葡聚糖酶(-1,3-g l u c a n a s e)在植物抗病中的作用受到广泛关注。这两种酶普遍存在于高等植物中，能够降解几丁质和-1,3-葡聚糖。植物体内不存在几丁质，-1,3-葡聚糖也只在细胞壁中少量存在，但这两种物质是绝大多数病原真菌细胞壁的主要骨架结构成分。几丁质酶和-1,3-葡聚糖酶可通过水解病原菌细胞壁直接杀死真菌，其作用具有“协同性”(陈坚等1 9 9 8；薛应龙和欧阳光察1 9 9 8；史娟等2 0 0 2；C o l l i n g e 等1 9 9 3)。相对于其他作物抗病生理生化方面的研究，国内外在甜菜方面的研究报告较少，尤其是细胞壁水解酶与甜菜抗丛根病的关系尚未见报告。本试验从比较生理学角度研究在丛根病地和无丛根病地(以下简称病地和无病地)上抗、感丛根病(以下简称抗、感病)品种的几丁质酶和-1,3-葡聚糖酶活性与甜菜抗丛根病的关系，以期探明病原物侵染与甜菜抗性相互关系的机理，为甜菜选种提供抗病生理的理论依据。1材料与方法1.1材料甜菜(B e t a v u l g a r i s L.)抗病品种：农华9 8 0 8、内甜抗 2 0 1；感病品种：甜研 3 0 4、包育 2 0 2。1.2试验设计及处理无病地试验在内蒙古农业大学教学农场进行，小区面积9.6 m 5 m，2 0 0 3 年4 月1 5 日播种，1 0月 1 5日收获、测产、检糖。病地试验在呼和浩特市毕克齐镇甜菜丛根病3 级病地上进行，小区面积1 4.4 m 4.5 m，2 0 0 3 年4 月2 0 日播种，1 0 月2 0日收获、测产、检糖。试验全部采用小区设置，品种顺序排列，每个品种种植6 行，6 次重复，其中3 个小区为取样区，3 个小区为测产区。试验地设置保护行，田间管理一致。在甜菜各生育时期取样。无病地取样时间为6 月7 日、6 月2 6 日和7 月2 8 日；病地取样时间为6月 1 2日、7月 1日、8月 6日和9月 1 9日。在3个固定小区内按对角线定点取样，第一次取样3 0 株，以后每次取样2 0 株。将样品放在冰桶内带回实验室，用水冲洗净表面泥土，用干净吸水纸吸掉水分。分别选取同一品种各植株上位置相同的功能叶3片，取其上、中、下等宽部分剪碎混匀，根切碎混匀后进行测定。1.3几丁质酶活性的测定参照B o l l e r(1 9 8 3)的方法。称取1.0 g 鲜重的材料，加5 m L 0.1 m o l/L 的乙酸缓冲液(p H 5.0)冰浴研磨，1 0 0 0 0 g离心1 0 m i n，上清液在1 0 0 0 0 g下再离心1 0 m i n，上清液置冰箱备用。取0.4 mL酶液，加入4 0 L 1%蜗牛酶，3 7 水浴反应3 0mi n 后，加入0.2 mL 饱和硼砂，放在沸水浴中7282 3 1 卷 植物生理与分子生物学学报mi n，冷却后加入2 m L 冰醋酸和1 m L 1%对二甲氨基苯甲醛(D MA B)，3 7 保温1 5 mi n，5 8 5 n m下测定其光密度。一个酶活性单位(U)定义为每克植物材料在上述条件下产生1 m o l N-乙酰氨基葡萄糖所需的酶量。1.4-1,3-葡聚糖酶活性的测定参照史益敏(1 9 9 9)的方法。称取鲜重0.5 g 的材料，放入预冷的研钵中，加3 mL 0.0 5 mo l/L的醋酸钠缓冲液(p H 5.0)和0.0 5 g 聚乙烯吡咯烷酮(P V P)，在冰浴中充分研磨，4 下1 5 0 0 0 g 离心1 5 mi n，上清液在1 0 0 0 0 g下再离心1 0 mi n，所得上清液即为粗酶液，放于冰箱备用。取1 m g/m L 的昆布多糖(S i g m a 公司产品，溶于上述醋酸钠缓冲液)0.4 mL，加入0.1 mL 酶液，于3 7 保温1 5 mi n，立即加入0.5 mL 铜试剂，混匀，并于1 0 0 水浴 1 0 mi n，置冷水中冷却，再加入0.5 m L 砷钼酸试剂，呈现蓝色后加蒸馏水3.5 mL，摇匀，6 6 0 n m波长的光下比色，测定其光密度，对照标准曲线求出样品液的还原糖含量。以 1n mo l g-1 F W s-1为1 个酶活性单位(U)。1.5含糖率的测定参照波钦诺克(1 9 8 1)的旋光法。1.6 数据处理与分析利用E x c e l 2 0 0 0 和S A S 等软件进行数据处理与分析。2结果2.1甜菜抗、感病品种几丁质酶活性差异从图1 a 可看出，在无病地上，叶片几丁质酶活性变化趋势为先升高后降低，但趋势较平缓，上升和下降的幅度都不大。6 月2 6 日后各品种几丁质酶活性均下降，但抗病品种下降较慢，因此总体上抗病品种比感病品种的基础酶活性高。尤其是7 月2 8 日抗病品种与感病品种的酶活性差异明显。在病地上，各品种叶片几丁质酶活性变化(图1 b)表现出上升和下降的幅度都比其在无病地上大。6 月1 2 日到7 月1 日，4 个品种酶活性均上升，表明受病原物侵染后，甜菜体内的几丁质酶活性都迅速升高，但抗病品种和感病品种上升幅度不同，两个抗病品种比两个感病品种上升幅度大。从7 月1 日到9月 1 9 日测定时期内，酶活性都呈下降趋势，但抗病品种农华9 8 0 8 和内甜抗2 0 1 酶活性下降明显比感病品种甜研3 0 4 和包育2 0 2 慢，由此可以看出甜菜发病后期，抗病品种仍然保持了较高的几丁质酶活性，从而维持较强的抗病性。图2 a 显示了无病地上各品种块根几丁质酶活性随时间的变化。抗病品种农华9 8 0 8 和内甜抗2 0 1的酶活性在整个测定时期内一直呈上升趋势，如农华9 8 0 8 的酶活性在6 月2 6 日和7 月2 8 日分别是6 月7 日的1.6 倍和2.3 倍；感病品种甜研3 0 4 和包育2 0 2 的酶活性从6 月7 日到6 月2 6 日也是迅速升高，但从6 月2 6 日到7 月2 8 日上升趋势则明显变缓。病地上块根几丁质酶活性变化(图2 b)与叶片酶活性变化较一致，前期(6 月1 2 日到7 月1 日)几乎同步升高，且品种间差异不显著；生育中、后期(7 月1 日到9 月1 9 日)抗病品种和感病品种的酶活性均有下降，但抗病品种下降的幅度小于感病品种，因此在病地上抗病品种块根中酶活性显著高于感病品种，尤其在 8月 6日其差异最大。图 1无病地(a)和病地(b)甜菜叶片几丁质酶活性的变化F i g.1C h a n g e s i n c h i t i n a s e a c t i v i t y i n l e a v e s o f s u g a r b e e t i n d i s e a s e-f r e e s o i l (a)a n d d i s e a s e d s o i l (b)283张少英等:甜菜几丁质酶和-1,3-葡聚糖酶活性与其对丛根病抗性的关系3 期同时可看到，整个测定时期内病地上各品种叶片和块根酶活性均比无病地上高，如病地上农华9 8 0 8 叶片7 月1 日的酶活性是无病地上相同生育时期的3倍。说明病原物侵染后诱导了植物体内几丁质酶活性的上升，尤其是越到发病后期，抗病品种和感病品种酶活性差异越大，抗病品种保持较高酶活性来抵御病原菌的侵染。2.2甜菜抗、感病品种-1,3-葡聚糖酶活性差异在无病地上，随生育进程推移，各品种叶片酶活性(图3 a)逐渐升高；且抗病品种与感病品种的酶活性差异逐渐增大。在病地上，从6 月1 2 日到8 月6 日，各品种叶片酶活性均上升，且抗病品种上升幅度明显大于感病品种，从8 月 6 日到9 月1 9 日，抗病品种和感病品种的酶活性均有下降(图3 b)；随生育进程及发病程度增加，抗病品种与感病品种酶活性的差异变的明显。这一变化规律与几丁质酶活性基本一致，表明-1,3-葡聚糖酶能够与几丁质酶起协同作用，抵抗病原菌对甜菜的侵害。无病地上块根-1,3-葡聚糖酶活性变化(图4 a)表现为各品种酶活性随生育进程均有不同程度上升。抗病品种与感病品种的酶活性差异在6 月7 日已很明显。农华9 8 0 8 酶活性上升比其它三个品种快，且抗病品种在整个测定时期内均保持了较高的酶活性。对病地上块根的-1,3-葡聚糖酶活性测定结果(图4 b)表明，除9 月1 9 日感病品种甜研3 0 4 酶活性略高于抗病品种内甜抗2 0 1 外，整个测定时期内仍然是抗病品种酶活性高于感病品种。不论在病地或无病地上，抗病品种-1,3-葡聚糖酶活性都比感病品种高，这一结果充分说明-1,3-葡聚糖酶与甜菜的抗病性有关。另外，病地上各生育时期酶活性测定结果均明显高于无病图2无病地(a)和病地(b)甜菜块根几丁质酶活性的变化F i g.2C h a n g e s i n c h i t i n a s e a c t i v i t y i n t u b e r o u s r o o t s o f s u g a r b e e t i n d i s e a s e-f r e e s o i l (a)a n d d i s e a s e d s o i l (b)图3无病地(a)和病地(b)甜菜叶片-1,3-葡聚糖酶活性的变化F i g.3C h a n g e s i n -1,3-g l u c a n a s e a c t i v i t y i n l e a v e s o f s u g a r b e e t i n d i s e a s e-f r e e s o i l (a)a n d d i s e a s e d s o i l (b)284 3 1 卷 植物生理与分子生物学学报地，表明病原物侵染诱导了甜菜体内-1,3-葡聚糖酶活性，在防御反应中起有利作用。2.3几丁质酶和-1,3-葡聚糖酶活性变化与甜菜产量、含糖率的关系由于几丁质酶和-1,3-葡聚糖酶参与并提高甜菜对丛根病抗性，从而对甜菜的产量和含糖率有正效应。从甜菜测产、检糖结果(表1)及相关分析(表2)可看出，甜菜叶片几丁质酶活性的变化与产量在病地上呈正相关，尤其在7 月1 日、8 月6 日和 9 月 1 9 日达到极显著和显著水平(r=0.9 9*，0.9 7*，0.9 7*)，块根几丁质酶活性的变化则在发病后期与产量呈相关关系。但是几丁质酶活性的变化与甜菜含糖率无相关关系。叶片和块根的-1,3-葡聚糖酶活性变化与产量呈正相关关系，而与图 4无病地(a)和病地(b)甜菜块根-1，3-葡聚糖酶活性的变化F i g.4C h a n g e s i n -1,3-g l u c a n a s e a c t i v i t y i n t u b e r o u s r o o t s o f s u g a r b e e t i n d i s e a s e-f r e e s o i l (a)a n d d i s e a s e d s o i l (b)表 2病地上甜菜几丁质酶和-1,3-葡聚糖酶活性与产量和含糖率的相关系数T a b l e 2C o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n t b e t w e e n c h i t i n a s e,-1,3-g l u c a n a s e a c t i v i t y a n d y i e l d,s u g a r c o n t e n t o f b e e t i n d i s e a s e d s o i l Date Correlation coefficient Organ Yield vs.Yield vs.Sugar content vs.Sugar content vs.(month/day)Chitinase -1,3-Glucanase Chitinase -1,3-Glucanase6/12Leaf0.760.98*0.370.61Tuberous roots0.410.99*0.370.627/1Leaf0.99*0.99*0.640.70Tuberous roots0.180.570.540.138/6Leaf0.97*0.98*0.710.71Tuberous roots0.95*0.97*0.730.719/19Leaf0.97*0.99*0.750.71Tuberous roots0.820.500.550.34*:Significant correlation;*:Most significant correlation.表 1甜菜抗、感病品种产量和含糖率T a b l e 1Y i e l d a n d s u g a r c o n t e n t o f r e s i s t a n t a n d s u s c e p t i b l e s u g a r b e e t v a r i e t i e s Diseased soil Disease-free soil Variety Yield Sugar content Yield Sugar content (kg/hm2)(%)(kg/hm2)(%)Nonghua 980854 348.21 018.0a14.70.03b58 346.31 407.6a17.00.04aNeitiankang 20150 875.51 158.7b15.90.07a55 418.01 185.8b17.00.05aTianyan 30440 375.51 195.8c12.90.04d39 800.0904.7c14.80.10bBaoyu 20234 985.7983.8d14.10.05c38 570.91 338.5c14.70.08c 285张少英等:甜菜几丁质酶和-1,3-葡聚糖酶活性与其对丛根病抗性的关系3 期甜菜发病后含糖率无相关关系。可见，几丁质酶和-1,3-葡聚糖酶对甜菜抵抗丛根病并最终提高产量有一定作用，而在提高含糖率方面影响不大。3 讨论在植物抗病防御系统中，几丁质酶和-1,3-葡聚糖酶的作用受到普遍关注。几丁质酶和-1,3-葡聚糖酶通过水解病原菌细胞壁直接杀死真菌。几丁质酶能分解几丁质产生几丁寡糖或N-乙酰氨基葡萄糖(N-乙酰葡萄糖胺)，几丁寡糖能诱导几丁质酶活性的进一步提高。-1,3-葡聚糖酶不仅能直接作用于植物细胞壁，而且其作用的产物(低聚糖)可作为诱导物诱导与抗病反应有关的酶类如苯丙氨酸解氨酶(P A L)、4-香豆酸-C o A联结酶(4 C L)等的积累，由此对植保素、木质素等抗病物质的合成与积累，增强植物的抗病性起促进作用。几丁质酶和-1,3-葡聚糖酶在离体条件下联合抑制病原菌，转几丁质酶和-1,3-葡聚糖酶基因植物对病原菌的抗性比未经转基因的野生种强(S c h l u mb a u m等 1 9 8 6；Ma u c h 等 1 9 8 8；B r o g i l e等1 9 9 1；Z h u 等1 9 9 4)，证实了几丁质酶和-1,3-葡聚糖酶在植物抗病中的重要作用。本实验条件下，在病地和无病地上，供试的4 个甜菜品种的几丁质酶活性和-1,3-葡聚糖酶活性均表现为抗病品种高于感病品种(图1 4)，表明高的几丁质酶和-1,3-葡聚糖酶活性有利于甜菜抗丛根病。这两种酶可能通过杀死甜菜多粘菌而使甜菜坏死黄脉病毒失去传播介体，从而截断甜菜感染丛根病的途径。正常情况下，植物体内这两种酶只有低水平的组成型表达，在植物染病后，酶活性会迅速增加。史娟等(2 0 0 2)的研究试验结果表明葡萄霜霉病菌能诱导葡萄叶片几丁质酶和-1,3-葡聚糖酶活性增高，而且两种酶活性增高的速度和幅度与品种的抗病性呈正相关。一般认为感病品种也有抗病防卫系统存在，但受诱导发挥作用的速度和强度不如抗(耐)病品种，不能及时或不足于抵抗病原物的侵染。本实验研究结果也表明，病原侵染4个品种甜菜后可使甜菜体内这两种酶活性升高，但抗病性强的品种酶活性升高比感病品种快，从而具有较高的几丁质酶活性和-1,3-葡聚糖酶活性，且两种酶的活性与甜菜产量呈正相关(表1、2)。本试验结果可作为甜菜抗病选种和鉴定的生理指标。参 考 文 献薛应龙,欧阳光察(1 9 9 8).植物抗病的物质代谢基础.见:余叔文,汤章城主编.植物生理与分子生物学(第二版).北京:科学出版社,7 7 0-7 8 3史益敏(1 9 9 9).-1,3-葡聚糖酶活性的测定.见:中国科学院上海植物生理研究所编.现代植物生理学实验指南.北京:科学出版社,1 2 8波钦诺克 X.H.著.荆家海,丁钟荣译(1 9 8 1).植物生物化学分析方法.北京:科学出版社,1 8 3-1 8 7杨继春,秦树才,阎新元,李刚,蔡葆(2 0 0 3).甜菜丛根病的发生与防治研究概述.中国甜菜糖业,(3):2 4-3 1B o l l e r T,G e h r i a A,M a u c h F,V o e g e l i U(1 9 8 3).C h i t i n a s e i n b e a nl e a v e s:i n d u c t i o n b y e t h y l e n e,p u r i f i c a t i o n,p r o p e r t i e s,a n d p o s s i b l e f u n c t i o n.P l a n t a,1 5 7:2 2-3 1B r o g l i e K,C h e t I I,H o l l i d a y M,C r e s s m a n R,B i d d l e P,K n o w l t o nS,M a u v a i s C J,B r o g l i e R(1 9 9 1).T r a n s g e n i c p l a n t s w i t he n h a n c e d r e s i s t a n c e t o t h e f u n g a l p a t h o g e n R h i z o c t o n i as o l a n i.S c i e n c e,2 5 4:1 1 9 4-1 1 9 7C h e n J(陈坚),L i G(李冠),Wa n g R P(王锐萍)(1 9 9 8).T h ei n d u c e m e n t t o t h e a c t i v i t i e s o f t h e c h i t i n a s e s a n d -1,3-g l u c a n a s e i n h a m i m e l o n y e l l o w s e e d l i n g s c a u s e d b y t h et o x i n o f P h y t o p h t h o r a me l o n i s f r o m h a mi me l o n.P l a n tP h y s i o l C o m m u n (植物生理学通讯),3 4(1):2 8-3 0 (i nC h i n e s e)C o l l i n g e D B,K r a g h K M,M i k k e l s e n J D,N i e l s e n K K,R a s m u s s e nU,V a d K (1 9 9 3).P l a n t c h i t i n a s e s.P l a n t J,3:3 1-4 0L i Y L(李彦丽),Q i X Y(齐兴亚)(2 0 0 1).R e s e a r c h p r o g r e s s o ns u g a r b e e t r h i z o m a n i a i n o u r c o u n t r y.S u g a r C r o p C h i n a(中国糖料),(1):3 4-3 8 (i n C h i n e s e)M a u c h F,M a u c h-M a n i B,B o l l e r T(1 9 8 8).A n t i f u n g a l h y d r o l a s e si n p e a t i s s u e.I n h i b i t i o n o f f u n g a l g r o w t h b y c o m b i n a t i o no f c h i t i n a s e a n d -1,3-g l u c a n a s e.P l a n t P h y s i o l,8 8:9 3 6-9 4 2S c h l u mb a u m A,Ma u c h F,V o e g e l i U,B o l l e r T(1 9 8 6).P l a n tc h i t i n a s e s a r e p o t e n t i n h i b i t o r s o f f u n g a l g r o w t h.N a t u r e,3 2 4:3 6 5-3 6 7S h i J(史娟),H u J J(胡景江),Wa n g H L(王红玲),M a n L M(满丽梅),Z h a n g Y L(张永丽)(2 0 0 2).T h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e nc e l l w a l l h y d r o l a s e a c t i v i t y i n d u c e d b y P l a s m o p a r a v i t i c o l aa n d r e s i s t a n c e o f g r a p e v i n e t o d o w n y m i l d e w.N o r t h w e s tF o r e s t r y U n i v (西北林学院学报),1 7(1):4 2-4 4 (i nC h i n e s e)Wa n g R G(王瑞刚),L i G J(李国婧),S h a o J W(邵金旺)(2 0 0 0).P r e s e n t s t a t u s a n d p r o s p e c t f o r s t u d y o n s u g a r b e e t d i s e a s er e s i s t a n c e.S u g a r C r o p C h i n a (中国糖料),(4):5 1-5 4 (i nC h i n e s e)286 3 1 卷 植物生理与分子生物学学报Z h u Q,Ma h e r E A,Ma s o u d S,D i x o n R A,L a mb C J(1 9 9 4).E n h a n c e d p r o t e c t i o n a g a i n s t f u n g a l a t t a c k b y c o n s t i t u t i v ec o-e x p r e s s i o n o f c h i t i n a s e a n d g l u c a n a s e g e n e s i n t r a n s g e n i ct o b a c c o.B i o/T e c h n o l o g y,1 2:8 0 7-8 1 2The Relationship Between Activities of Chitinase and-1,3-Glucanaseand Resistance to Rhizomania in Sugar BeetZHANG Shao-Ying1,2*,WANG Jun-Bin2,WANG Hai-Feng2,SHAO Jin-Wang2,LI Guo-Long2,LIXiao-Dong3(1College of Agronomy,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2Institute of Sugar Beet Physiology,Inner MongoliaAgricultural University,Huhhot 010018,China;3Institute of Sugar Beet,Inner Mongolia Academy of Agricultural Science,Huhhot010031,China)Abstract:The relationship between activities ofchitinase and-1,3-glucanase and resistance torhizomania of sugar beet were studied in diseased soiland disease-free soil by using a method of compara-tive physiology.Two resistant varieties and two sus-ceptible ones of sugar beet were used in thisexperiment.Chitinase and-1,3-glucanase activitiesof the resistant varieties were higher than the suscep-tible ones in either diseased soil or disease-free soil(Figs.14).There is a positive correlation betweenchitinase,-1,3-glucanase activity and yield of beetin diseased soil(Table 2),suggesting that pathogeninfection can induce resistance to rhizomania throughactivating chitinase and-1,3-glucanase.Key words:sugar beet;rhizomania;chitinase;-1,3-glucanaseThis work was supported by the National Natural Science Founda-tion of China(No.30360059).*E-mail: