钙离子浓度对光暗适应罗氏沼虾感光细胞可溶性Gq蛋白α亚基的影响.pdf

动物学研究2 0 0 3。O Ct 2 4(5)：3 7 3 3 7 6 Zoo t ogi e a l Re s e ar c h C N 5 3-1 04O Q I S S N 0 2 5 4-5 8 5 3 钙 离 子 浓 度 对 光 暗适 应 罗 氏沼 虾感 光 细胞 可 溶性 Gq蛋 白 亚 基 的 影 响 冯 志国，袁维佳，章 骏，许 燕(上海 师范 大学 生命 与 环境科 学学 院，上海2 0 0 2 3 4)摘要：以光适应和暗适应条件下的罗氏沼虾复眼视网膜为材料，分别用高钙溶液、生理溶液、低钙溶液孵 育后，用蛋 白质提取液提取可溶性 G q蛋 白 a 亚基并 S D S P A GE电泳，利用 T a n o n G I S凝胶图像处理系统分析其 含量。从光暗条件下 3种溶液孵育后 的感光细胞 中都提取到了 4 2 k D a的可溶性 G q蛋 白 a亚基。高钙溶液、生 理溶液、低钙 溶液孵 育 后 的感光 细胞 中可溶 性 G q蛋 白 a亚基 的含 量，光适应 组 分别 是 3 1 3、3 0 9、3 0 3；暗适应组分别是 3 1 7、3 0 6、3 O l。在生理溶液和低钙溶液 中，该蛋 白含量光适应组大于暗适 应组，但低钙溶液的光适应组与暗适应组无显著差异；在高钙溶液中，暗适应组显著大 于光适应组，可能与钙 离子反馈调节作用有关。关键词：罗氏沼虾；感光细胞；可溶性 G q蛋 白 a亚基；钙离子；光适应；暗适应 中图分类号：Q 9 5 9 2 2 3；Q 4 3 6 文献标识码：A 文章编号：0 2 5 45 8 5 3(2 0 o 3)0 50 3 7 30 4 Effe c t s o f Ca l c i um Co nc e nt r a t i o n o n t he So l ubl e Gq Pr o t e i n Su buni t i n th e Pho t o r e c e pt o r Ce l l o f M a c r o br a c hi u m r o s e n be r g i o n Li g ht Ada p t a t i o n a nd Da r k Ada p ta t i o n F ENG Zh i g u o，YUAN W e i i i a l，Z HANG J u n，XU Ya n (C o l l e g e o f啦a n d E n v i r o n m e n t S c i e l t c e，S h a n g h a i T e a c h e r s U n iv e r s i t y，S han g hai 2 0 0 2 3 4，C h i n a)Ab s t r a c t：Af t e r l i g h t a n d d a r k a d a p t a t i o n，t h e r e tin a o f t h e M a c r o b r a c h i u m r o s e n b e r wa s r e s p e c t i v e i n c u b a t e d i n l I i s h c a l c i u m s o l u t i o n。p h y s i o l o g i c a l s o l u tio n a n d l o w c a l c i u m s o l u t i o n S o l u b l e G q a wa s e x t r a c t ed f r o m t h e r e ti n a o f t h e M a c r o b r a c h i u m r o s e n b e r t l l p r o t e i n e x t r a c t an d w a s e l e c t o p h o r e s i s e d b y S DS-P AGE Th e p e r c e n t of the so l ub l e G q a wa s an a l y z ed b y Tan o n GI S g e l i ma g e d i s p o s a l s y s t e m Af t e rthe i n c ub a ti o n i n t h r e e s o l u t i o n s，the so l ub l e Gq a i n 4 2k Da wa s a l l e x t r a c t ed f r o m p h o t o r e e e p t o r c e l 1 T h e pe r c e n t of the s o l ub l e G q a i n p h o t o r e e e p t o r c e ll i n h i s h e Me i um so l u t i o n p h y s i o l o gic a l s du d o n and l o w c a l c i u m sol u ti o n W fl S 3 1 3 3 0 9 and 3 0 3 res pec ti v e l y o n l i g h t a d a p t a t i o n and W as 3 1 7 ，3 0 6 and 3 O l r e s p e c ti v e l y o n d a r k a d a p t a t i o nI n p h y s i o l o gic al s du d o n and l o w c al c i um s o l u t i o n the pe r c e n t o f the p r o t e i n o n l i g h t a d a p t a t i o n Was h i g h e r than t h a t o n d a r k a d a p t a ti o n，b u t i n l o w c alc i um so l u d o n，the pe r-c e n t of the p r o t e i n o n l i g h t an d d a r k a d a p t a ti o n Was n o s i g n i fi c an t l y d i ffe ren t；i n hi g h c alc i u m so l u d o n，th e pe r c e n t o fthe p r o t e i n o n d ar k a d a p t a t i o n Was h i g h e r than tha t o n l i g h t a d a p t a ti o nTh i s Was p r o b a b l y rel e v an t t o f e e d b a c k reg u l a t i o n Ke y wo r d s：Ma c r o b r a c h i u m r o s e n b e r g；Ph o t o r e c e p t o r c e l l；So l ub l e Gq p r o t e i n a s ub u n i t；Calc i um；L i g h t a d a p t a-do n；Da r k a d a p t a t i o n Gq蛋 白是 最近几 年发 现 的一 种 G蛋 白，存在 于章 鱼(T s u d a&T s u d a，1 9 9 0)、乌 贼(S u z u k i e t a l，1 9 9 5)、螯虾(T e r a k i t a e t a l，1 9 9 6)、罗 氏沼虾 和 日本 沼虾(Z h a n g e t a l，2 0 0 1)等无 脊椎 动物 的 收 稿 日期：2 0 0 30 70 1；接受 日期：2 0 0 30 91 5 基 金项 目：上海 市高等 学校 科学技 术发 展基金 资助 项 目(0 3 D Z 0 5)1 通讯 作者(C o r r e s p o n d i n g a u th o r)，T e l：(0 2 1)6 4 3 2 2 1 4 1，E i n a i l：w e ij i a s h tu e d u c n 维普资讯 http:/ 动物学研究 2 4卷 感光细胞 中。G q蛋 白 C t 亚基 有 可溶 性 和膜 结 合 两 种形式(Na r t i a e t a l，1 9 9 9)，且 两种亚基 分子量一 样，都是 4 2 k Da。膜结 合 G q蛋 白 a亚基 可激活 乌 贼感 光 器 中 的磷 脂 酶 C(P L C)(T s u d a&T s u d a，1 9 9 0；S u z u k i e t a l，1 9 9 9)，在 光 电传导过程 中起分 子开关和信 号 放大 的作 用。G q蛋 白 C t 亚 基 的移 位(S u z u k i e t a l，1 9 9 9)、P L C与 G q蛋 白 C t 亚基 偶 联(T e r a k i t a e t a l，1 9 9 6)是 控制 光感 受器 敏感 度 的重 要分子机制。光 照影 响 G q蛋 白(T e r a k i t a e t a l 1 9 9 6)、G q蛋 白 C t 亚基 的数 量 及分 布(T e r a k i t a e t a l，1 9 9 6)。钙离 子 浓度影 响光感 受器 的光敏感性，即钙离 子浓度高，则 敏感性 下降；钙离 子浓度 低，则敏 感性 上升(B o l s o v e r&B r o w n，1 9 8 5)。钙 离 子 对 调 节 光 感 受 器 的适 应 性、对 膜传导性 的改 变和 膜 电位 的改 变 引起 的兴 奋 电流 以及对膜 电位 的上升都有 影响(S c k e r t S t i e v e，1 9 9 1；F e i n&L i s ma n，1 9 7 5；L e v y&F e i n，1 9 8 5)。细 胞内外 钙 离 子浓 度 的不 同也 能够 影 响 中华 绒螯 蟹(Y u a n e t a l，1 9 9 9)和 美 洲 鲎 腹 神 经(Yu a n e t a l，1 9 9 8)光感 受器 的结 构 特征。而 钙离 子对 光 感受 器 中 G蛋 白的活性 有无影 响?我们通 过光暗适 应条件 下研 究罗 氏沼虾感 光 细胞可 溶性 G q蛋 白 a亚基 与 细胞外钙离子 浓度 之 间 的关 系，试 图为解 答这 一 问 题提供 基础资料。1 材 料 与方 法 1 1实验材料 实验 用 健 康 成 年 罗 氏 沼 虾(Ma c r o b r a c h i u m r o s e n b e r g)于 2 0 0 3年 34月 多次 购 自上海 漕河 泾 农 贸市场。试 剂、药 品均 为进 口分 装 或 国产 分 析 纯。1 2实验方法 1 2 1 光适应 与 暗适 应处 理把饲 养在 河水 中的 1 2只罗 氏沼 虾 随意 平均 分 成 2组，一组 于 自然 光 下饲养 6 h后 在 自然光下解 剖复 眼；另一组 于全 暗 的环境 中饲养 6 h后在微 弱 的红 光下解 剖复眼。取 下视 网膜放入孵育杯 中待用。实验重复 9次。1 2 2 视 网膜在 3种溶液 中的孵育参 照 S t o w e e t a l(1 9 8 3)的方 法 配 制 生 理 溶 液 N a C 1 4 0 0，K C 1 1 0，C a C 1 2 2，Ms s o 4 2，HE P E S 1 0，葡萄糖 5 0(单 位均 为 m mo l L；p H 7 3)。在生 理溶液 中加入 5 0 m mo l L的钙 离子 即为高 钙溶 液；在 生 理溶 液 中加 入 5 0 m mo l L的 E G T A即为低钙溶 液。将 活 的视 网 膜分别放人生理、高钙和低钙溶 液 中，再把 3种溶 液 中暗处理组 的样 品用遮光纸包 住，均 放在 4下 孵育 2 4 h。1 2 3 样 品处理光适 应 组 的视 网膜 材料 从 3种 溶液 的孵 育杯 中取 出，各 自放 人 p H 7 5、冷 冻 的 含蛋 白酶 抑 制 剂 的 缓 冲 液 N a C 1 1 1 0，K C 1 3 0 0，Mg C 1 2 5 0，C t 一巯 基 乙醇 5 0，T r i s HC 1 5 0，N a N 3 2，P MS F 0 1，b e n z a mi d i n e 0。8 3，i d o a c e t a mi d e 1(单位 均为 mm o l L)中匀浆 后，置于 一2 0冷冻 过夜。解 冻 之 后，离 心 样 品(1 2 0 0 0 r rai n，4 ，3 0 mi n)，取 上清液。暗适应 组 的视 网膜 于微 弱 的红 光(离 1 5瓦 的 红灯 泡约 0 5 m)下做上述处 理。1 2 4 S D S P AG E电泳分别取经 3种溶 液处 理 的 光适应和 暗适应 的样品 的上清液，加等 量 的样 品缓 冲液 混 合，沸 水 浴 35 mi n后，进 行 S D S P A G E (浓缩胶 3，分 离胶 1 0)电泳，用 0 2 5 考 马 斯亮蓝 R 一 2 5 0染色。洗脱 后 的凝 胶用 T a n o n软件进 行扫描。1 2 5 计算 分析利用 T a n o n G I S凝胶 图像处理系 统对凝 胶蛋 白百 分含 量进 行 分析。G q蛋 白 a亚 基 在 总 蛋 白 中所 占 的 比例 由 公 式(P c q。S c q。)(p 总蛋白s 总 蛋白)1 0 0 汁算。2结 果 经过 9次 S D S P A G E电泳 重复，得 到 的结 果基 本一致。图 1 是 其 中一次 的实验结 果。从 该 电泳 图 可 以看 出，标 准蛋 白共有 6条带，第 3条 带代表 的 是分子量 为 4 3 k D a的蛋 白(图 1 Mr)。光适 应 组和 暗适 应组 的样 品，在 3种溶 液 中孵育 的视 网膜感光 细胞 蛋 白的条 带 数相 同，都是 1 1条 带，主要 集 中 在 9 7与 4 3 k D a之 间；第 1 0条 带 的蛋 白分 子量 在 4 2 k D a处，高钙溶液、生理溶液、低 钙溶液孵 育后 的感光细 胞 蛋 白在 此 处都 有 较 明显 的条带(图 1：16)。用 T a n o n G I S凝胶 图像 处理 系统 对 9次 实验结 果进行分析后，得 出 4 2 k D a处 蛋 白含 量列 于表 1。在生理溶液 和低钙溶液 中，该 蛋 白含量 光适应 组大 于 暗适应组，但低钙溶液 的光适 应组 与暗适应 组无 显 著差异；在 高 钙 溶 液 中，暗适 应 组 大 于 光适 应 组，并有显著差异。从表 中还可 看 出，无 论是 光适 应还是 暗适应，42 k D a处细胞 中蛋 白的含量 随细胞 外 的钙 离子浓 度 的增加而升 高。维普资讯 http:/ 5期 冯 志 国等：钙 离子 浓度 对光 暗适应 罗 氏沼虾感 光 细胞可溶 性 G q蛋 白 a亚基 的影 响 3 7 5 M r (k Da)一 97 _-6 6 一簟謦 43 一 30 囊 21 蔫 囊 1 4 _ _ I 1 2 3 4 5 6 3讨论 图 1 罗 氏 沼虾感 光 细胞 中可溶性 G q蛋 白 a亚 基 的 电泳 图 F i g 1 S DS P AGE o f t h e s o l u b l e G q a i n the p h o t o r e c e p t o r c e l l o f M a c r ob r a c hi um i o s e n be r Mr：低 分子 量 标 准 蛋 白；13：光 适 应；46：暗 适 应；1，4：高 钙溶 液；2，5：生 理溶 液；3，6：低 钙 溶 液。箭 头 处 为 4 2k Da。Mr：t h e l o w mo l e c u l a r w e i ght s t a n d a r d p r o t e i n；13：l i g h t a d a p t a ti o n；46：d a r k a d a p t a t i o n；1，4：h i gh c a l c i u m s o l u t i o n；2，5：ph y s i o l o g i c a l s o l uti o n；3，6：l o w c alc i u m s o l u ti o n T he p o s i tio n 0 fth e a l T O W；S 42 kDa 表 1 Tabl e 1 我们提取可溶性 G q蛋 白 a亚基 的方法 与 Z h a n g e t a l(2 0 0 0)相同，并且 在光 和 暗适应下 生 理溶 液 及高低钙溶液孵育 的视 网膜感光 细胞 中都 提取 到分 子量为 4 2 k D a的感光 细胞 蛋 白。而这种 4 2 k D a的 蛋 白条带，经免疫印迹确认就是 罗 氏沼虾光感 受器 中 G q蛋 白 a亚基(Z h a n g e t a l，2 0 0 0，2 0 0 1)。无论是在光适应还 是在 暗适应 条件下，罗 氏沼 虾感 光细胞 中可 溶性 G q蛋 白 a亚基 的含 量，高 钙 溶液 生理溶 液 低钙溶液，说 明细胞质 内钙 离子 浓度适量 升 高可 促 进 G蛋 白三 聚体 的分解，形 成 a、p和 了亚基，促进 膜结合 的 G q蛋 白 a亚基 激发 P L C，膜结合 的 Gq蛋 白 a亚 基进 而 转化 为 可溶 性 的 G q蛋 白 a亚 基。感光细胞 内的膜下潴泡囊被认 为是 细胞 内的钙 库，在光 刺激下 可 向细胞 质 中释 放钙离 子(L e v y&F e i n，1 9 8 5)。当感光 细胞 被孵 育在 高钙 溶 液 中时，可溶性 Gq蛋 白 a亚基 的含 量却 出现 了暗适应 组 光适 应组。这种现 象 可 能 的解 释是：在 光 刺激 下，钙库 向细胞 质 中释放钙离子；同时高钙溶 液 中的钙 离子也 从 细 胞 外 进 入。二 者 均 使 细 胞 质 内 的 钙 离 子 浓度 急剧升 高。而过高 的钙离子 浓度对 膜结合 三种溶液 中罗氏沼虾感光细胞中可溶性 Gq蛋白 n亚基的百分含量 Pe r c e n t o f t h e s o l u b l e Gq p r o t e i n n s ub u n i t i n t h e p h o t o r e c e p t o r c e l l o f M a c r o b r a c h i u m r o s e n b e r g i i n t h e t h r e e s o l u t i o n s n=9，上标 字母 不相 同表示 差异 显著(t t e s t，P0 0 5)。n=9，v alu e s w i th d i ff e r e n t s u p e r s c r i p t a r e s i g n ifi c ant l y d i ff e ren t(t t e s t，P0 0 5)G q蛋 白 a亚 基催 化 P L C有一 定 的抑 制作 用，膜结 一种推测，如何抑制 和反馈调节，还有 待进一 步研 合 的 G q蛋 白 a亚基转 化为可溶性 的 G q蛋 白 a亚基 的数量减少，从 而起到反馈 调节作 用。但这 仅仅 是 参 考文献：B o l s o v e r S RBl o wn J E 1 98 5 Calc i u m i o n：An i n t r a c e l l ular mess e n g e r o f1 i tad a p t a tio n，a l s o p a r t i c i p ates i n e x c i t a t i o n o f L mu u s p h o t o r e c e p t o r s l J J JP h y s io 1 ，3 6 4：3 8 43 9 3 Fe i n A，Li s ma l l J E 1 9 7 5 I x a l i z e d d ese n s itiz a tio n o f L mu u s ph o t o r e c e t o r s p r o d u c e d b y l i ght o r i n n _a c ular c alc i u m i o n i n j e c t i o n l J J S l c e，l 8 7：1 0 9 41 0 9 6 究。L e w S。F e i n A1 9 8 5R e l a ti o n s h i p b e t we e n l i ght s e n s i ti v i t y and i n t r a-c e l l u l ar f r e e c alc i u m c o n c e n t r a t i o n i n 厶 ma u s v e n t r a l p h o t o r e c e p t m,s l J J J G e nP h y s o ，8 5：8 0 58 4 1 Na r t i a K，S u J k i K，0h t s u K。S e i d o u M，Ki t o Y，Ts u ka h a r a Y 1 9 9 9 S t r u c t u r a l an d f u nc t i o n al d i ffe r e nc es o f t wo f o r ms 0 f G-I P b i n d i n g p r o t e i n，G q，i n the c e p h alo p o d r e t i n a J G o m p a r 维普资讯 http:/ 3 7 6 动物学研究 2 4卷 B o c h e m s t r y a n d Ph y s i o l o g y Pa r t B 1 2 3：3 1 9 32 7 S e ke r t A，St i e v e H 1 991 El e c t ro g e n i c Na Ca e x c h a ng e。t h e c a l c i u m c o mp o n e n t s i n t he l i g h t i n d u c e d c u r r e n t o f t h e mu u s v e n t r a l n e r v e p h o t o r e c e p t o r l J J JP h y s i o 1 ，4 3 3：4 6 74 8 2 S t o we S，1 9 8 3 L i g h t i n d u c e d a n d s p o n t a ne o u s b r e a k do wn o f t h e r h a b d o ms i n a c r a b a t d a w n：De p o l a r i z a t i o n v e r s u s c a l c i u m l e v e l E J J Co mp Ph y s i o 1，1 5 3：3 6 5 3 7 5 S mki T，Te r a k i t a A，Na r i t a K，Na K，Ts u k a ll a l a Y，Ki t o Y 1 9 95 S q ui d ph o t o r e c e p t o r p h o s p ho fi pa s e C i s s t i mi u l a t e d b y me m b r a h e G q a b u t n o t b y s o l u b l e G q a J 麟L e t t e r，3 7 7：3 3 3 3 3 7 S u z u k iT，Na r i t a K，Te r a k i t a A，r a ka i E，Na s a l K，Ki t o Y，Ts u k a h a r a Y 1 9 9 9 Re g u l a tio n o f s q u i d v i s u a l p h o s p h o l i pa s e C b y a c t i v a t e d G-p r o t e i nMp h a J C o p r a r a t i v eB i o c h e mi s t r ya n dP h y s i o l o g y Pn r tA 1 22：3 6 9 3 7 4 Te r a k i t aA，a l l mH，Ta mo t s u S，S u z u k iT，Ha r i y a maT，Ts u k a h a r a Y 1 9 9 6 L i g h t mo d u l a t e d s u b c e H u l a r l o c a l i z a tio n o f t h e a l p h a s u bu n i t o f GTP-bi n d i n g p r o t e i n Gq i n t h e c r a y fis h p ho t o r e c e p t o r s 一 I l，c ，1 3：5 3 95 4 7 Ts u d a M Ts u d a T 1 9 9 0 Two d i s t i nc t l i s h t r e g u l a t e d G p r o t e i n i n O C t o p u s p h o t o r e c e p t o r-s J B i o c h i mi c a B i o p h y s i c a A c t a，1 0 5 2：2 o421 0 Yu a n WJ 1 9 9 8 E t s o f e x a c e l l u l a r c a l c i um c o n c e n t r a t i o n o n the s p o n t a n e o u s b u mp s o f the L mu u s v e n t r a l p h o t o r e c e p t o r s J E a s t C h i n a N o r ma l U n i v(N a t u r a l S c e n c e)，8：7 37 7 袁 维佳 1 9 9 8 钙离 子浓 度 对 鲎腹 神 经 感 光器 中 自动 碰 击 的影 响 华 东师范 大学 学报(自然 科学 版)，8：7 37 7 Yu a nWJ，C h e n L，P a n X Z，Z h a n g HQ，S h e n g C1 9 9 9E ff e c t s o f c a i c i u m c o nc e n t r a tio n o n the fin e s t r u c t u r e o f d a r k a d a p t e d p h o t o r e-c e p t o r si nthe c r a b E r i o c h e i r s i n e n s i s J Z o o 1 R e s，2 0(1)：3 2 3 5 袁 维 佳，陈蕾，潘 晓 震，张 慧 绮，盛春 1 9 9 9钙离 子浓 度对 暗适 应 时 的 中华 绒 螫 蟹 光 感 受器 超微 结 构 的影 响 动物学 研究，2 0(1)：3 23 5 Zh a ng J，Xu Y。Yua n WJ 2 0 0 0 Gq p r o t e i n i n r e tin a o f s o me c r 1 1 s t a c e a I I J Ea s t Chi na No r m a l U n v (N a t u r o 2 S de n c e)，l 2：3 2 3 6 章骏，许燕，袁 维 佳 2 0 0 0几 种 甲壳 动 物 感 光器 中 的 G q蛋 白 华 东 师范 大 学学 报(自然 科 学 版)，l 2：3 23 6 Zh a ng J，Yu a I I WJ，Xu Y2 0 01 Gq a in r e t i n a o f s o me c r u s t a c e a n L J J S h a n g h a i T e a c h e r s U n i v (Na t u r a l s c )，1 2：7 3 7 8 章骏，袁 维佳，许燕 2 0 0 1 几种 甲壳 动 物感 光 器 中 的 G q蛋 白 a亚 基 的研 究 上 海 师 范 大 学 学 报(自然 科 学 版)，l 2：7 37 8 誊 融 I 维普资讯 http:/