β-catenin 蛋白H36P 突变对肝癌细胞的增殖的影响.pdf

医学分子生物学杂志,2023,20(5):450-454 J Med Mol Biol,2023,20(5):450-454DOI:10.3870/j.issn.1672-8009.2023.05.012通讯作者:李勤新(电话:[phone],E-mail:13072672 )Corresponding author:LI Qinxin(Tel:[phone],E-mail:13072672 )-catenin 蛋白 H36P 突变对肝癌细胞的增殖的影响吴忠坤1,宋平辉1,张毅1,李春博1,李勤新21陕西省核工业二一五医院普通外科 陕西省咸阳市,7120002兴平市人民医院儿科 陕西省兴平市,713199【摘要】目的 探究-catenin 蛋白 H36P 突变对肝癌细胞的增殖的影响。方法通过 PCR 扩增法扩增CTNNB1 基因,包括 WT-CTNNB1、G34R-CTNNB1 和 H36P-CTNNB1。通过双酶切法克隆至 p-CMV5 质粒载体,将相对应的质粒瞬转至 Huh7、HepG2 细胞中,并检测其蛋白表达情况。其次,使用 CHX 按时间梯度处理表达目的基因的细胞,比较 H36P-catenin 与 WT-catenin、G34R-catenin 的泛素化降解情况并分析蛋白稳定性。随后通过质核分离检测 H36P-catenin 核转位能力。最后,通过 CCK-8 计数法检查 H36P-catenin 对肝癌细胞增殖能力的影响。结果 突变体 G34R、H36P 的蛋白质表达水平,与野生型-catenin 无明显差异。在 HepG2 细胞株中,CHX 作用 8 h 时 WT-catenin 几乎完全降解,而 G34R 和 H36P 只降解了75%和 60%。Huh7 细胞株中的情况类似,6 hrs 时 WT-catenin 几乎完全降解,而 G34R 和 H36P 只降解了约40%。以上结果差异均具有统计学意义(P0.05)。相较于 WT-catenin,G34R 和 H36P 促使 HepG2细胞增殖量提升。在表达-catenin 突变体的肝癌细胞泛素化降解受抑制的情况下,与 WT-catenin、突变体 G34R 相比,表达突变体 H36P 的肝癌细胞核转位明显增加。结论-catenin 蛋白 H36P 突变蛋白表达稳定、核转位情况增多,泛素化降解过程受阻,并能促进 HepG2 和 Huh7 肝癌细胞的增殖。【关键词】-catenin 蛋白;突变;肝癌;增殖【中图分类号】R735.7Effect of-catenin H36P Mutation on Proliferation of HepatocellularCarcinoma CellsWU Zhongkun1,SONG Pinghui1,ZHANG Yi1,LI Chunbo1,LI Qinxin21Department of General Surgery,No.215Hospital of Shaanxi Nuclear Industry,Xianyan,Shaanxi,712000,China2Department of Pediatrics,Xingping Municipal Peoples Hospital,Xingping,Shaanxi,713199,China【Abstract】Objective To investigate the effect of-catenin H36P mutation on the proliferationof hepatocellular carcinoma cells.MethodsThe CTNNB1genes(WT-CTNNB1,G34R-CTNNB1,H36P-CTNNB1)were amplified by PCR amplification.It was cloned into the p-CMV5 plasmid vec-tor with a double digestion method,and the corresponding plasmids were transiently transferred intothe Huh7 and HepG2 cells.The protein expression levels were then detected by Western blot-ting.Cells transfected with the target genes were treated with CHX in a time gradient,the degrada-tion time of the H36P-catenin,WT-catenin and G34R-catenin were compared and their sta-bilities were analyzed.The nuclear translocation ability of H36P-catenin was examined after sepa-ration of the nuclear and cytoplasmic fractions.Finally,the effect of H36P-catenin on the prolifer-ation of hepatocellular carcinoma cells was examined by CCK-8 method.ResultsThe protein ex-pression levels of-catenin mutants(G34R and H36P)were not significantly different from that ofthe wild-type-catenin.In HepG2 cell line,WT-catenin was almost completely degraded byCHX in 8 hours,while the mutants only degraded 75%and 60%in the same timeperiod.Similarly,in the Huh7 cell line,WT-catenin was almost completely degraded in 6 hours,while the mutants were only degraded about 40%in the same time period.The differences in the a-bove results were statistically significant(P0.05).Compared with the WT-catenin,mutant-catenin promoted the proliferation of HepG2 cell.The nuclear translocation ability of H36P mutant-catenin was increased compared with those of WT and G34R mutant-catenin in the hepatocellularcarcinoma cells.Conclusion-catenin H36P mutant protein blocks the protein ubiquitination deg-radation process,promotes the proliferation of HepG2 and Huh7 hepatocellular carcinoma cells,and has an increased nuclear translocation.【Key words】-catenin;mutation;hepatocellular carcinoma cells;proliferation 肝癌(liver cancer)是一种起源于肝脏的恶性肿瘤,可分为原发性肝癌和继发性肝癌,其中后者更为常见1-3。肝癌在癌症死亡中排名第三,在恶性肿瘤发病中排名第四,严重危害患者生命安全4。既往流行病学调查显示,肝癌与寄生虫、病毒性肝炎、饮酒等因素相关。但这些因素对肝癌发生和发展的影响机制尚未明晰。目前,已有大量针对肝癌发病机制的分子生物学研究,并取得一定成果。研究已证实,肝癌发生发展与 Wnt/-cate-nin、PI3 K/Ras 信号通路异常、P53 调控的细胞周期异常、染色体重组、氧化应激等机制明显相关5-8。Guichard 等9研究结果显示,肝癌中 Wnt/-catenin 信号通路异常的发生率最高,其占比超过 30%。其中,-catenin 隶属 ARM 重复蛋白超家族,由 CTNNB1 基因编码。虽然这种蛋白在进化上高度保守,但能通过 Wnt/-catenin 信号通路输出信号,并对下游效应器功能产生多样且广泛的影响。既往研究表明,这条信号通路被发现在胚胎细胞、体细胞和肝细胞的生长过程中扮演重要角色,保证组织器官正常发育和再生10-11。其通路异常产生一系列连锁反应,引起细胞异常生长发育,甚至发生癌变。近期 Hirotsu 等12研究发现,16 种肝癌突变基因中频率最高的分别为 TP53 和 CTNNB1基因突变,其中 CTNNB1 基因点突变以 G34R 和H36P 为主。但目前鲜有关于 H36P 位点突变的研究,因此本研究拟讨论-catenin 蛋白 H36P 突变与肝癌细胞的增殖的影响。1 材料与方法1.1 材料与试剂人肝 Huh7 和 HepG2 细胞株及突变体 G34R 和H36P 质粒均购于上海雅吉生物科技有限公司。全部引物均由金斯瑞生物科技有限公司。主要实验试剂和药品,包括细胞培养液(上海索莱宝生物科技有限公司)、电泳染料(武汉爱博泰克生物技术有限公司)、甲醇、乙酸等试剂(国药集团)、RNA 逆转录试剂盒(德国 QIAGEN 公司)、兔-catenin 单克隆 抗 体(clone:ARC0136,武汉爱博泰克生物技术有限公司)、分子克隆试剂(美国 Invitrogen 公司)、TaqDNA 聚合酶(美国 Invitrogen 公司)、CCK-8 试剂盒(上海索莱宝生物科技有限公司)等。1.2 细胞复苏及培养取出保存的 Huh7、HepG2 细胞株后置于冰上解冻,完全解冻后 1 000 r/min 离心 5 min 移除上清,加入灭菌的新鲜培养基,吹打混合,混匀后移至 6 cm 培养皿,细胞融合度达到 80%后传代培养。传代培养时,使用 DMEM 培养液(含 10%15%胎牛血清)培养,调整密度为 3 106个/mL,置于 37 5%CO2和95%湿度下培养,生长良好状态下细胞单层贴壁生长。1.3 构建质粒及瞬时转染CTNNB1 基因(NCBI Gene ID:1499)序列获取自 NCBI 官网,并设计正反义引物链(F 链:5-CCTCCCAAGTCCTTTATGAATGG-3,R 链:5-CC-GTCAATATCAGCTACTTGCTCTT-3)。通过 PCR 扩增法扩增 CTNNB1 基因外显子序列,并通过双酶切法克隆至 p-CMV5 质粒载体上。应用 Lipofectami-neTM2000 转染法进行瞬时转染。1.4 蛋白质印迹法(Western blotting,WB)检测蛋白表达检测 使用蛋白质印迹法检测底物蛋白的表达情况。首先,抽提细胞样品中的蛋白:将待处理细胞样品冰上预冷,除去培养液后使用 PBS 缓冲液冲洗;按比例加入裂解液后冰上静置 5 min,超声破碎处理后离心并移除上清。随后,吸取微量处理好的样品进行蛋白浓度检测。其余部分加入等量 2 SDS Buffer,沸水浴10 min,蛋白变性后进行 WB分析。每个样品重复 3 次。1.5 蛋白泛素化检测利用放线菌酮(cycloheximide,CHX)法检测底物(-catenin 野生型和突变体 G34R 和 H36P)蛋白的降解。首先,将 G34R 和 H36P 突变体及WT 转染至已培养的 Huh7、HepG2 细胞株中。随后每隔 2 h 加入溶解在 DMSO 中的 CHX(100 g/L)处理,提取样品蛋白检测其表达情况。1.6 细胞增殖检测利用 cell counting kit-8(CCK-8)法检测细胞增殖。将处理好的细胞培养液中直接加入 10%体154医学分子生物学杂志,2023,20(5):450-454 J Med Mol Biol,2023,20(5):450-454积的 CCK-8,充分混合后加入 10 L 检测试剂,培养1 4h。使用酶标仪在 A450 nm下读数并记录结果,每个样品重复 3 次。1.7 蛋白核转位检测使用蛋白提取试剂盒,分别抽提核蛋白、胞浆蛋白和总蛋白,使用 WB 法检测其表达情况。其中PARP 作为核蛋白内参,GAPDH 作为全蛋白或胞浆蛋白内参。1.8 统计学分析符合正态分布的计量资料 x s 表示,用 SPSS20.0 软件采用单因素方差分析或两因素重复测量方差分析,若组间差异具有统计学意义,进一步使用 SNK 法或配对 t 检验进行两两比较。2 结果2.1肝癌细胞中-catenin 野生型及突变体的表达情况及其蛋白稳定性 WB 法检测空载对照 vector、-catenin 野生型WT-catenin、-catenin 突变体 G34R 和 H36P 在HepG2 和 Huh7 肝癌细胞株中的表达水平。结果显示,突变体 G34R、H36P 的蛋白质表达水平,与野生型-catenin 无明显差异(图 1)。A B:HepG2 细胞株和 Huh7 细胞株中蛋白表达情况;C:WB 条带灰度值(每个样品重复 3 次)图 1 肝癌细胞株中野生型、突变型-catenin 蛋白表达 CHX 实验检测-catenin 突变体在 HepG2 和Huh7 肝癌细胞株中的泛素化降解情况。结果显示,在 HepG2 细胞株中,CHX 作用8 h 时 WT-catenin几乎完全降解,而 G34R 和 H36P 只降解了75%和60%(图 2A)。Huh7 细胞株中的情况类似,6 h时 WT-catenin 几乎完全降解,而 G34R 和 H36P只降解了约 40%(图 2B),以上结果均有显著性差异(P0.05)。与同时间 WT-catenin 比较,P0.05图 2-catenin 泛素化降解量化统计254吴忠坤,等.-catenin 蛋白 H36P 突变对肝癌细胞的增殖的影响2.2-catenin 突变体对肝癌细胞增殖的影响CCK-8 细胞增殖实验检测-catenin 突变体G34R、H36P 对 HepG2 和 Huh7 肝癌细胞株增殖的影响。CCK-8 细胞增殖计数发现,相较于 WT-catenin,G34R 和 H36P 促使 HepG2 及 Huh7 细胞增殖提升(图 3)。与 WT-catenin 比较,P0.05,P0.01图 3-catenin 突变体对肝癌细胞增殖的影响2.3-catenin 野生型和突变体在肝癌细胞中核转位差异分析 分离细胞核质分离进行 WB 分析了解突变体G34R、H36P 在 HepG2 和 Huh7 肝癌细胞株中核转位情况。实验 结 果 显 示,与 WT-catenin、突 变 体G34R 相比,突变体 H36P 在肝癌细胞中的核转位明显增加(图 4)。A B:HepG2 细胞株和 Huh7 细胞株中蛋白表达情况;C:WB 条带灰度值(每个样品重复 3 次)。P0.05图 4-catenin 野生型和突变体在肝癌细胞中核转位情况3 讨论既往研究表明,-catenin 蛋白在 Wnt/-cate-nin 信号通路中扮演重要角色,在肝癌、乳腺癌和结直肠癌等多种恶性肿瘤的发生和发展中均发挥不可替代的作用13-15。小鼠、大鼠和兔等动物模型研究进一步验证了-catenin 蛋白的生物学功能。结果表明,-catenin 蛋白对细胞增殖、分化、迁移和极化等功能均有影响16。另一方面研究发现,肝癌的发生和发展期间 Wnt/-catenin 信号通路均呈现异常,其中-catenin 蛋白表达也呈异常水平16-18。除此之外,不仅在肝癌组织,甚至在离体肝癌细胞株及其构建的相应的转基因小鼠肝癌模型中都存在-catenin 的单个位点突变。本研究为了检查突变体的蛋白表达水平,对比了对照质粒、野生型、阳性对照突变体 G34R 和新突变体 H36P的蛋白表达水平。结果显示,在 HepG2 和 Huh7 肝癌细胞株中,G34R 和 H36P 蛋白表达水平与 WT-354医学分子生物学杂志,2023,20(5):450-454 J Med Mol Biol,2023,20(5):450-454-catenin 无明显差异。这可能是体外培养细胞中-catenin 内源性高水平表达的结果,因而抑制了外源性-catenin 的表达。虽上述实验未见-catenin 野生型及其突变体的蛋白表达水平差异,但其蛋白结构可能发生改变。因此接下来,本研究检测了突变体-catenin蛋白在肝癌细胞株中的泛素化降解情况。按时间梯度加入核糖体转录抑制剂 CHX 处理,以分析蛋白表达情况。结果显示,CHX 作用 6 8 h 后,WT-catenin 蛋白几乎完全降解,而 H36P 蛋白仅降解了 20%39%,与同时间段阳性对照 G34R 水平类似。这说明,H36P 在肝癌细胞中的泛素化降解过程受到了较大程度的抑制,也再次证实了 H36P蛋白表达的稳定性。本研究推测这可能是蛋白的空间分布改变的结果。为了了解 H36P 在肝癌细胞中核转位的情况,本研究分离了细胞质和细胞核,WB 检测-catenin 在细胞核和细胞质中的水平。结果表明,H36P 突变体在肝癌细胞的细胞核中的水平明显高于野生型-catenin。CCK-8 计数结果显示,相较于 WT-catenin,H36P 更加明显地促使HepG2 和 Huh7 细胞存活率(A 值)的变化。且在浸染 72 h 内,H36P 对上述细胞存活率的影响也较阳性对照 G34R 更为明显。上述结果 均 说 明,H36P 促进了肝癌细胞的增殖。综上所述,-catenin 蛋白 H36P 突变蛋白表达稳定、泛素化降解过程受阻、核转位情况增多,并能促进 HepG2 和 Huh7 肝癌细胞的增殖。虽然本研究发现-catenin 蛋白突变体 H36P 在肝癌细胞中具有促进癌细胞增殖的作用。但本研究未了解 H36P 泛素化降解受阻过程的具体机制,及H36P 与 Wnt/-catenin 信号通路中其他关键蛋白的相互作用情况。因此在下一步的研究中,拟探究突变体在信号通路中的作用。参考文献1 杨娜,谢会娟,梁文龙.肝癌患者中 IL-17 表达与 HBV基因型的相关性研究J.实用癌症杂志,2021,36(7):1087-1090.2 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