藏猪耐粗饲特性及其与肠道微生物的相关性研究.pdf

试验研究2023年第2期西 藏 农 业 科 技藏猪是青藏高原饲养的主要猪种，为当地提供了大量的肉类食品。杜长大三元杂交猪（DLY猪）是目前全世界饲养最多的瘦肉型猪，占全世界肉类食品供应的40%左右。藏猪野外生存条件较为恶劣，形成了自身抗缺氧、耐低温、抗紫外线、耐粗饲等特性，藏猪生长速度极其缓慢，饲料转化率低，但肉质鲜美，被誉为“高原之珍”1。藏猪肠道微生物与机体的多项机能密切相关，如纤维降解、疾病抵抗与环境适应等，大量的研究聚焦在藏猪的肠道微生物，特别是肠道细菌上2。研究发现，藏猪体内藏猪耐粗饲特性及其与肠道微生物的相关性研究谭占坤，吕志，陈鑫艳，付晓琪，易政宏，孙锋博，刘乐乐，刘锁珠（西藏农牧学院动物科学学院/西藏高原饲料加工工程研究中心，西藏 林芝860000）摘要：该试验旨在研究藏猪的耐粗饲特性，通过分析放牧藏猪、舍饲藏猪和商品猪（杜长大猪，DLY猪）粪便中细菌群落组成的差异性，获取与饲粮纤维消化相关的细菌群落。以饲养在西藏高原的5月龄放牧藏猪、舍饲藏猪和DLY猪为研究对象，采用消化试验测定其对饲粮纤维的表观消化率。采集粪便样品，利用单分子实时测序技术，测定粪便细菌V3-V4区域16S rRNA基因全长序列，分析粪便真菌群落的结构和多样性，采用Pearson相关分析获取饲粮纤维表观消化率与粪便中细菌群落的相关性。结果表明，放牧藏猪饲粮粗纤维、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、纤维素和半纤维素表观消化率显著高于舍饲藏猪与DLY猪（p0.05）；DLY猪粗脂肪、粗蛋白质与总表观消化率最高，放牧藏猪最低（P0.05）。粪便细菌中纤维杆菌门、变形菌门、琥珀酸弧菌属、Sphaerochaeta、纤维杆菌属、Anaerovorax，Alloprevotella rava，Fibrobacter intestinalis，Succinivibrio dextrinosolvens，Papillibacter cinnamivorans与饲粮纤维类物质表观消化率呈显著正相关（p0.05）。结果表明，放牧藏猪具备耐粗饲能力，这种能力与粪便中的纤维降解菌密切相关。关键词：藏猪；耐粗饲；细菌；相关性中图分类号：S828文献标志码：AStudy on Forage Tolerance and its Correlation With intestinal microbesin Tibetan PigsTAN Zhankun，LYU Zhi，CHEN Xinyan，FU Xiaoqi，YI Zhenghong，SUN Fengbo，LIU Lele，LIU Suozhu（College of Animal Science,Tibet Academy of Agriculture and animal husbandry/Tibetan plateau feed processing engineering research center,TibetLinzhi 860000,China）Abstract：The purpose of this experiment was to study the characteristics of forage tolerance of Tibetan pigs,analyze the differences of bacterial community composition in the feces of grazing Tibetan pigs,house-fed Tibetan pigs and commercial pigs（DLY pigs）,and obtain the bacterial communityrelated to the digestion of dietary fiber.The apparent digestibility of dietary fiber in 5-month-old grazing,house-fed and DLY pigs on the Tibetan Plateau was determined by digestion test.The 16S rRNA gene in V3-V4 region of fecal bacteria was sequenced by single-molecule real-time sequencingto analyze the structure and diversity of fecal fungal community.The correlation between apparent digestibility of dietary fiber and bacterial community in feces was obtained by Pearson correlation analysis.The results showed that the apparent digestibility of dietary fiber,neutral detergent fiber,acid detergent fiber,cellulose and hemicellulose in feces of grazing Tibetan pigs was significantly higher than that of house-fed Tibetan pigs and DLYpigs（p0.05）.DLY pigs had the highest crude fat,crude protein and gross energy apparent digestibility,while grazing Tibetan pigs had the lowest（p0.05）.In feces,Fibrinobacteria,Proteobacteria,Bribrio,Sphaerochaeta,Fibrobacteria,Anaerovorax,Alloprevotella rava,Fibrobacter intestinalis,Succinivibrio dextrinosolvens and Papillibacter cinnamivorans were positively correlated with the apparent digestibility of dietary fiber（p0.05）.The results showed that grazing Tibetan pigs had coarse feeding tolerance,which was closely related to fiber degrading bacteria in feces.Key Words：Tibetan pig;forage tolerance;bacteria;correlation收稿日期：2022-12-22作者简介：谭占坤（1986-），男，副教授，硕士研究生导师，主要从事动物营养与饲料科学专业教学、科研与社会服务工作，E-mail：。0562023年第2期试验研究西 藏 农 业 科 技存在大量的纤维降解菌，通过培养得到了一系列高产纤维素酶的细菌3。本研究中，饲喂放养藏猪、舍饲藏猪与DLY猪同一种高纤维饲粮，比较不同类型猪生产性能和养分表观消化率的差异，采用单分子实时测序技术（SMRT），测定细菌序列，初步了解放牧藏猪、舍饲藏猪与DLY猪粪便中细菌结构的多样性，最终揭示3个类型猪对饲粮纤维消化差异的机理，为深入开发藏猪资源提供多方面的技术资料。1材料与方法1.1试验动物1.1.1放养藏猪放养藏猪生长于青藏高原典型藏猪放养场所（高寒草地、森林与河谷），150 d左右，全程放牧养殖，以摄食草、树叶等纤维含量高的食物为主。1.1.2舍饲藏猪舍饲藏猪选自西藏藏牧合创农牧科技有限公司，150 d左右，全程舍饲，饲喂不含抗生素的配合饲料。1.1.3DLY猪DLY猪选自西藏林芝市巴宜区宇高农业有限公司，150 d左右，全程舍饲，养殖于西藏农牧学院藏猪消化代谢室，饲喂不含抗生素的配合饲料。1.2试验设计试验采用单因素完全随机区组试验设计，设3个处理，分别为放养藏猪组、舍饲藏猪组与DLY猪组，每组10个重复，每个重复1头猪。1.3试验饲粮试验各处理组均饲喂同一饲粮，饲粮配制参考本课题组前期研究成果，粉料、饲粮组成与营养成分表如表1所示。表1饲粮组成及营养水平（饲喂基础）原料玉米麦麸大豆油大豆粕苜蓿石粉L-赖氨酸盐酸盐预混料硅藻土合计含量/%54.478.005.006.0025.000.100.200.430.80100.00营养水平消化能/（MJkg-1）总能/（MJkg-1）粗蛋白质粗纤维钙总磷非植酸磷赖氨酸蛋氨酸+半胱氨酸色氨酸苏氨酸含量/%12.9817.3413.0410.630.380.280.190.680.360.190.441.4饲养管理试验于2019年9月13日至28日在西藏农牧学院藏猪消化代谢室内进行。试验期15 d，其中收粪期5 d，每天08：00，12：00与18：00喂料，收集损失料并记录，每天清扫猪舍1次。全试验期内试验猪自由采食与饮水，按照猪场常规饲养管理程序进行管理。试验开始前对猪只进行驱虫。1.5指标测定1.5.1生产性能试验开始与结束，称取每头猪的质量，得到初始体质量与终末体质量，计算全试验期增质量与平均日增质量；记录称料量、损失料与剩余料，计算全试验期采食量与平均日采食量，用采食量除以增质量计算料重比。1.5.2养分表观消化率在正式试验期内，按重复每天定时收集粪便，试验结束后制备得到分析样品。测定藏猪饲粮与粪便样品中水分、粗灰分、粗脂肪、粗蛋白质、粗纤维、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、钙、总磷、总能与盐酸不溶灰分（AIA）含量，采用指示剂法计算饲粮养分表观消化率，公式为：C饲粮养分消化率=100%-AdAfBfBd100%式中：Ad为饲粮中AIA含量（%）；Af为粪中AIA含量（%）；Bf为粪中营养物质含量（%）；Bd为饲粮中营养物质含量（%）。1.5.3粪便细菌测序分析每个处理分别收集6头猪排出的干净粪便，采集内部粪样装入5mLAxygen冻存管中，立即放入液氮中速冻，存放于-80 冰箱中待测。将3个类型猪各6个样品送至上海派森诺生物科技有限公司进行DNA提取、PCR扩增、高通量测序与生物信息学分析。采用正向引物27F（5-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3）和反向引物1 492R（5-ACCTTGTTACGACTT-3）对微生物 16S rRNA 基因 V3-V4 区域序列进行两步PCR 扩增，并在第二步 PCR 中将样品特异性的16bp Barcode插入正向引物和反向引物中。将等量聚合扩增子利用PacBio Sequel三代测序平台进行单分子实时测序。1.6数据统计与分析生产性能与养分表观消化率数据采用 SPSS21.0软件进行单因素方差分析，并采用Duncan s法进行多重比较，p 值小于 0.05 差异显著，p 值大于 057试验研究2023年第2期西 藏 农 业 科 技0.05差异不显著。采用QIIME2（2019.4）软件，选用UNITE数据库进行物种分类学注释与物种组成分析，根据OTU在不同样本中的分布，进行Alpha与Beta多样性分析。将细菌群落与饲粮养分表观消化率进行Pearson相关性分析。2结果与分析2.1生产性能150日龄 DLY猪的体质量为 89.00 kg，显著高于放牧藏猪21.52 kg与舍饲藏猪22.45 kg（p0.05）（图 1a）；试验结束时 DLY 猪体质量依然最高，为96.90 kg，显著高于放牧藏猪的 24.32 kg与舍饲藏猪的26.70 kg（p0.05）（图1b）；试验全期增质量与平均日增质量趋势与之类似，DLY猪分别为7.90，0.53 kg，显著高于放牧藏猪的2.80，0.19 kg与舍饲藏猪的4.25，0.28 kg（p0.05）（图1c、图1d）。采食量趋势与体质量趋势一致，DLY猪总采食量 28.92 kg、平均日采食量 2.23 kg，显著高于放牧藏猪的 15.16，1.01 kg与舍饲藏猪的 17.77，1.27 kg（p0.05）（图2a、图2b）。100806040200120100806040200初始体质量/kg终末体质量/kgbbabba放牧藏猪舍饲藏猪DLY猪放牧藏猪舍饲藏猪DLY猪10864200.80.60.40.20.0平均增量/kg全期增量/kgabbbba放牧藏猪舍饲藏猪DLY猪放牧藏猪舍饲藏猪DLY猪abcd图1体质量与增质量353025201510503210总采食量/kg平均日采食量/kgbbaabb放牧藏猪舍饲藏猪DLY猪放牧藏猪舍饲藏猪DLY猪ab图2采食量 0582023年第2期试验研究西 藏 农 业 科 技料重比分析显示，DLY 猪的料重比最低，为3.72，显著低于放牧藏猪的5.57和舍饲藏猪的4.55（p0.05）（图3）。料肉比（F/G）76543210aab放牧藏猪舍饲藏猪DLY猪图3料重比2.2养分表观消化率由图4可见，放牧藏猪对纤维类营养物质的表观消化率显著高于舍饲藏猪与DLY猪（p0.05），其中放牧藏猪粗纤维消化率分别比舍饲藏猪和DLY猪高11.40%和15.70%，中性洗涤纤维高12.58%和17.05%，酸性洗涤纤维高 12.39%和 20.56%，半纤维 素 高 12.77%和 13.74%，纤 维 素 高 24.49%和35.93%。以上数据说明，放牧养殖的藏猪由于具有耐粗饲的特性，其对饲粮纤维类物质（粗纤维、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、半纤维素和纤维素）的表观消化率均显著高于舍饲养殖的藏猪和DLY猪，当藏猪舍饲养殖时，其对纤维类物质的消化率与DLY猪相比并没有明显的差异，说明养殖方式是影响耐粗饲特性的主要因素。DLY猪DLY舍饲藏猪CTP放牧藏猪GTPbbabbaabbabbbbaabbabbbba纤维素半纤维素酸性洗涤纤维中性洗涤纤维粗纤维粗蛋白质粗脂肪总能020406080100 单位：%图4饲粮养分的表观消化率2.3粪便细菌群落与饲粮纤维表观消化率的相关性研究通过 Pearson 相关性分析发现（图 5、图 6、图7），在门水平，粪便纤维杆菌门与饲粮粗纤维表观消化率呈显著正相关（p0.05），变形菌门与饲粮粗纤维、半纤维素表观消化率呈显著正相关（p0.05），而厚壁菌门与饲粮粗纤维、半纤维素表观消化率呈显著负相关（p0.05）。在属水平，琥珀酸弧菌属、Sphaerochaeta、纤维杆菌属、Anaerovorax与饲粮纤维类物质的表观消化率呈显著正相关（p0.05），链球菌属、颤杆菌属与饲粮纤维类物质的消化呈显著负相关（p0.05）。在种水平，Alloprevotella rava，Fibrobacter intestinalis，Succinivibrio dextrinosolvens，Papillibacter cinnamivorans与饲粮纤维类物质的表观消化率呈显著正相关（p0.05），Oscillibacter valericigenes，Intestinimonas butyriciproducens，Oscillibacterruminantium，Streptococcus alactolyticus与饲粮纤维类物质的消化呈显著负相关（p0.05）。图5饲粮纤维表观消化率与门水平粪便细菌群落相对丰度的相关性图6饲粮纤维表观消化率与属水平粪便细菌群落相对丰度的相关性 059试验研究2023年第2期西 藏 农 业 科 技图7饲粮纤维表观消化率与种水平粪便细菌群落相对丰度的相关性3讨论3.1不同猪间生产性能的比较藏猪作为地方型小型猪种，生长缓慢，屠宰与瘦肉率不高，相同日龄体质量显著低于 DLY 猪。本研究发现，150日龄时，DLY猪体质量是藏猪的4倍左右，舍饲养殖的藏猪体质量略高于放牧养殖，可见，品种是决定动物生产成绩的决定性因素。生长性能不佳是地方猪种在长期遗传选育过程中形成的。王言等4采集了四川6个地方猪种纯舍饲养殖的生产成绩，发现从 2090 kg 平均日增质量在343.10433.89 kg，料重比最低为3.80，成华猪甚至达到4.77。鲁绍雄等5研究发现，云南9个地方猪种，料重比最低为撒坝猪3.63，明光小耳猪最高为6.44。陆雪林等6研究了上海的地方猪种，梅山猪育肥期日增质量460.25 g，料重比3.34，浦东白猪日增质量 422.35 g、料重比 3.59，沙乌头猪日增质量434.68 g，料重比3.77，枫泾猪日增质量451.63 g，料重比3.70。苗志国等7研究发现，长白猪比金华猪生产性能更佳，表现在平均日增质量高39.44%，料重比低24.11%，采食量无差异。在肥育期，民猪平均日增质量560g，料重比4.75，荷包猪日增质量为483 g，料重比3.668。大量研究表明，DLY猪全期平均日增质量超过600 g，料重比低于3 1。地方型猪种与瘦肉型猪差距明显，藏猪作为高原特有的小型猪种，生产性能不佳。3.2不同猪间养分消化率的比较饲料中的营养物质被机体分泌的各种消化酶类所消化，小肠是猪最主要的消化场所，蛋白质、脂类和碳水化合物大部分都在小肠内消化吸收，未被小肠消化的物质进入大肠，被大肠内的微生物所利用9。传统认为，地方猪种均具有较高的耐粗饲特性，但资料缺乏。本试验中，通过猪对饲料中营养物质的消化率，特别是纤维类物质消化率的研究发现，放牧养殖的藏猪具备更好地消化纤维的能力，直接证明了藏猪的耐粗饲能力。DLY猪肠道分泌的脂肪酶与蛋白酶丰富10，能较好地消化吸收粗脂肪与粗蛋白质，因此总能的消化率也最好。放牧藏猪长期摄入纤维类丰富的食物，蛋白质与粗脂肪较缺乏，反馈性地影响体内酶活的分泌，进而消化率均最低。3.3藏猪耐粗饲特性与粪便细菌的相关性分析纤维素是植物细胞壁的主要结构成分，约占植物干质量的35%50%11。光合作用过程产生大量的植物生物量，从而产生纤维素，这些纤维素被存在于土壤、海洋和湖泊沉积物、水和动物内脏中的纤维素分解微生物降解。纤维素水解可在好氧和厌氧条件下发生，厌氧水解占全球纤维素降解的5%10%12，鉴于环境中存在的纤维素生物量的绝对数量，这是相当可观的。在细菌中，纤维素降解细菌主要集中在需氧的放线菌目（放线菌门）和厌氧的梭菌目（厚壁菌门）13。大多数的特征纤维素分解微生物有的利用游离纤维素酶机制14，即多种分泌的酶协同作用，有的利用与外壁（纤维素体）结合的纤维素分解酶复合物来消化纤维素15。对于有氧生物最常用的游离纤维素酶机制和厌氧生物相关的纤维素体将纤维素内的-1，4键水解。通过无细胞酶机制进行纤维素水解的模型基于需氧真菌里氏木霉的纤维素酶系统，厌氧细菌和真菌的纤维素体机制是基于纤维素分解梭状芽孢杆菌的机制11。纤维杆菌门目前包括一个正式纤维杆菌属，和两个培养种（琥珀酸纤维杆菌和肠纤维杆菌），它们被认为是草食动物肠道中纤维素物质的主要降解菌13。在放牧藏猪粪便中发现了大量肠纤维杆菌，说明放牧藏猪具备高效降解饲粮中纤维物质的能力，这也是与纤维物质的消化率是一致的。4结论藏猪在放牧养殖的条件下，形成了耐粗饲的良好能力，消化纤维类物质的能力比舍饲养殖的猪种要高10%以上。0602023年第2期试验研究西 藏 农 业 科 技粪便细菌中，放牧藏猪变形菌门、纤维杆菌门，Alloprevotella、纤维杆菌属、Sphaerochaeta、琥珀酸弧菌属，Alloprevotella rava，Fibrobacter intestinalis，Succinivibrio dextrinosolvens与饲粮纤维消化密切相关。参考文献：1ZHAO Y L，LU X L，CHENG Z P，et al.Comparative ProteomicAnalysis of Tibetan Pig Spermatozoa at High and Low AltitudesJ.BMC Genomics，2019，20（1）：1-8.2SHANG Z，TAN Z，LIU S Z，et al.Characterization of Bacterial Microbiota Diversity in Tibetan Pigs Fed with Green Forage in Linzhiof the Tibet Autonomous Region J.Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents，2019，33（2）：447-455.3MENG F，MA L，JI S，et al.Isolation and Characterization of Bacillus Subtilis Strain BY-3，a Thermophilic and Efficient Cellulase-Producing Bacterium on Untreated Plant BiomassJ.Letters inApplied Microbiology，2014，59（3）：306-312.4王言，钟志君，何志平，等.四川6个地方猪种的育肥和胴体性能以及肉质和风味物质比较研究 J.畜牧与兽医，2021，53（1）：7-12.5鲁绍雄，李明丽，严达伟，等.云南地方猪种质特性及其保种与多样化利用 J.云南农业大学学报（自然科学），2020，35（6）：1096-1105.6陆雪林，吴昊旻，薛云，等.上海4个地方猪种的肥育性能和肉质特性分析 J.养猪，2020（4）：65-69.7苗志国，刘长忠，李国旺，等.金华猪与长白猪生产性能和肉品质的发育差异 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