AM-AM-FS-Is-肉类和肉制品-L-谷氨酸含量的测定-参考方法.pdf

AMAMFSIs0307 肉类 肉制品 L-(+)-谷氨酸含量的测定 比色法 AM-AM-FS-Is-0307 AM-AM-FS-Is-0307 肉类和肉制品肉类和肉制品L-(+)-谷氨酸含量的测定谷氨酸含量的测定参考方法参考方法 1.适用范围：1.适用范围：本方法是一个参考方法，适用于肉类和肉制品，包括家禽 L-(+)-谷氨酸含量的测定。2.原理概要：2.原理概要：在 0，用高氯酸萃取出试样中的 L-(+)-谷氨酸。萃取产物经离心分离、转移和过滤后，将 pH 调至 10.0。在谷氨酸酯脱氢酶存在下，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)被 L-(+)-谷氨酸还原(方程 1)。在硫辛酰胺脱氢酶存在下，得到的还原烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和氯化碘代硝基四唑反应(方程 2)，测定生成的(formazane)在 492nm 处的吸收，从而计算出 L-(+)-谷氨酸的含量。谷氨酸酯脱氢酶 L-(+)-谷氨酸 NAD H2O -酮戊二酸单酰胺 NADHNH3H (1)硫辛酰胺脱氢酶 NADH 氯化碘代硝基四唑 H NAD formazane (2)3.主要仪器和试剂：3.主要仪器和试剂：3.1.仪器 常规实验室仪器，主要有：机械磨或电磨、实验室混合器、带离心管的实验室离心机、pH 计、槽形滤纸、单刻度容量瓶(100ml 和 250ml，满足 ISO 1042 B 类要求)、单刻度移液管(100ml、50ml 和 25ml，满足 ISO 648 B 类要求)、带刻度的移液管(有 2.50ml、0.50ml、0.20ml和 0.05ml 等分度，满足 ISO 835-2 A 类要求)、小塑料压舌板、光电比色计或光谱仪、比色管(10mm 光程)、分析天平(可精确至 0.1mg)。3.2.试剂 除非另做说明，所有试剂要用分析纯，水用二次蒸馏水或矿蒸馏水。主要试剂有：1.0 mol/l 稀高氯酸溶液、2 mol/l 氢氧化钾溶液、pH 8.6 三乙醇胺磷酸盐缓冲溶液、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)溶液、氯化碘代硝基四唑(INT)溶液、硫辛酰胺脱氢酶溶液、10mg/ml 谷氨酸酯脱氢酶(GLDH)溶液、L-(+)-谷氨酸标准溶液(50.0g L-(+)-谷氨酸溶于 25ml 水中，用氢氧化钾溶液将 pH 调至 7.0，溶液稀释到 50ml，并混合均匀)。4.过程简述：4.过程简述：4.1 采样 采样可参照 ISO 3100-1。重要的一点是取样应具有代表性，样品在运输或储存时未被破坏或发生改变。初始有代表性的试样至少 200g。4.2 样品制备 试样用合适的设备进行均化，这一过程需小心操作，试样温度不能升高到超过 25。制好的试样要装在合适的密闭的容器中。4.3 测试 称取约 50g 试样，精确至 0.01g，放入实验室混合器瓶中。在 0下，向试样中加入 100ml稀的高氯酸，并混合均匀。然后将试样移入离心管中，离心分离 10min。小心移掉脂肪层，通过滤纸把顶层的液体滤至 200ml 锥形瓶中，抛掉前 10ml 滤液。用移液管移取 50ml 滤液，加入到 100ml 烧杯中，用氢氧化钾溶液并通过 pH 计测定，将溶液 pH 值调节 7.0。然后将烧杯中液体全部转移到 100ml 容量瓶中，用水稀释至刻度线，并混合均匀。溶液在冰中冷却 10min 后，通过槽形滤纸进行过滤，抛弃前 10ml 滤液。用移液管移取 25ml 或适量体积的滤液，加入到 250ml 容量瓶中，用水稀释至刻度线。使缓冲溶液和滤液温度为 2025。用移液管向两个比色管中，各加入 2.50ml 缓冲溶液，0.20ml NAD 溶液，0.20ml INT 溶液和 0.05ml 硫辛酰胺脱氢酶。加入 INT 后，使反应产物尽可能避光。向一个比色管中加入 0.5ml 滤液，得到的溶液作为测试液；另一个比色管中加入 0.5ml 水，得到的溶液作空白。用压舌板混匀溶液，在波长 492nm 处读出每个比色管中溶液对水的吸收，溶液温度应在 2025。移取 0.05ml GLDH 溶液加入到每个比色管中，混匀,1015min 后，在 492nm 处读取每个玻璃管中溶液对水的吸收值，随后，每 2min 读一次数，直到吸收值的增量为常数为止，画出吸收值对时间的曲线，求出反应开始时的吸收值。重复上述操作，只是在第一个比色管中用 0.5ml L-(+)-谷氨酸标准溶液替代 0.5ml 滤液。按 ISO 1442 标准测定试样的含水量。5.精确度：5.精确度：重复性：相同试验者使用相同设备在短时间间隔内，采用相同试验方法对同一试验材料进行分析，L-(+)-谷氨酸含量高达 0.14%时，得到的两个独立的实验结果的绝对偏差不超过5%，含量偏差最大不超过 0.02%。再现性：不同试验者使用不同设备，采用相同试验方法对同一的试验材料进行分析，L-(+)-谷氨酸含量高达 0.14%时，得到的两个独立的实验结果的绝对偏差不超过 5%，含量偏差最大不超过 0.04%。6.来源：6.来源：国际标准化组织，ISO 4134：1999(E)