快速老化模型小鼠SAMP8行为学的增龄性变化.pdf

1快速老化模型小鼠快速老化模型小鼠SAMP8行为学的增龄性变化行为学的增龄性变化褚芹 于建春潘建明于涛韩景献（指导老师）摘要目的摘要目的 对SAMP8老化征象和学习记忆能力的增龄性变化进行比较系统的研究，为利用该模型进行其他研究提供实验依据。方法方法选用 2、4、6、8、10、12月龄 SAMP8，以同龄正常老化的 SAMR1 为对照，应用老化度评分和 Morris 水迷宫测试 SAMP8 的老化度和学习记忆能力的增龄性变化。结果结果 SAMP8 在 4 月龄出现明显的老化体征，并在 6 月龄开始表现出空间学习记忆障碍。结论结论SAMP8 在成熟期（4-6 月）过后发生了快速老化，证实 SAMP8 是研究衰老和老年性痴呆的理想模型。关键词关键词快速老化模型小白鼠（SAM）;SAMP8;老化;Morris 水迷宫;学习记忆能力Age-related Changes in behavior of SenescenceAccelerated Mouse SAMP8Chu Qin,YU Jianchun,Pan Jianming,Yu Tao,Han Jingxian(The First Hospital affiliated to TianjinUniversity of TCMTianjin China 300193)AbstractObjective To observe the age-related changes in aging sign and symptoms,and learning and memory of senescence accelerated mouse SAMP8.MethodselectingSenescence Accelerated Mouse SAMP8 and normal control SAMR1 at six ages from 2thmonth to 12th month,age-related changes in aging and learning and memory werestudied by“the scores of aging”and Water Morrris Maze.Results The SAMP8 appearedobvious aging sign and symptoms at 4-month old.Compared to SAMR1 control group,SAMP8 mouse showed significant impairments on learning and memory in hiddenplatform trial at age of8th month,10th month and 12th month.In probe trial and reversaltrial,SAMP8 began to show significant impairments on learning and memory at age of6month.Conclusion The results showed that SAMP8 began to accelerate senescenseafter mature period(4-6month)and appeared learning and memory disorder at 6-8months old.It manifested that SAMP8 was an ideal model for investigating themechanism of aging and senile dementia.基金项目：教育部高等学校博士学科点专项科研基金（20060063006）作者单位：300193 天津 天津中医药大学第一附属医院基础研究部（褚芹、于建春、于涛、韩景献），天津中医药大学解剖教研室（潘建明）。联系电话：[phone] Email:http:/ 2KEY WORDSSenescence Accelerated Mouse;SAMP8;Aging;Morris water maze;Learningand Memory快速老化模型小白鼠 SAM，其前身为美国 AKR/J 系小白鼠，由竹田教授于 1968年引进日本，突然出现老化症状，经 20 年的培育，终于形成了 SAM 系统。根据老化速度分为正常老化的 R 品系（Senile-Resistant）和快速老化的 P 品系（Senile-Prone）1：R 品系随加龄匀速老化，平均存活时间为 526 天，通常用作正常老化对照组；P品系随加龄快速老化，特点是成长期（46 月龄）过后迅速出现与人类极为相似的老化诸特征，平均存活时间为 358 天，是目前公认的比较理想的自然衰老痴呆模型2、3。在石学敏院士的主持下，导师韩景献教授于 1993 年将 SAM 鼠成功引进我院，为开展老化相关研究提供了必备的条件。本研究选用不同月龄的 SAMP8，与同龄的正常老化小鼠 SAMR1 作对照，通过老化度评分和 Morris 水迷宫实验对 SAMP8 小鼠老化征象和学习记忆能力的增龄性变化进行比较系统的研究，以期为利用该模型进行其他研究提供实验依据。材料与方法材料与方法1 SAM老化度评分测试老化度评分测试11 研究对象健康的 SAMR1 和 SAMP8 2 月、4 月、6 月、8 月、10 月、12 月龄各 30 只，雌雄各半，由天津中医药大学第一附属医院动物中心提供。12 老化度评分采用日本京都大学竹田俊男和细川昌则教授制定的老化度评分标准4，将外在形体及行为的老化改变从反应性、被动性逃避反应、皮毛光泽、皮毛粗糙程度、脱毛程度、皮肤溃病、眼周损害、角膜混浊、角膜溃疡、白内障、脊柱后凸等11 项进行观察，再根据程度不同，将每项指标划分为 35 级不等，标定分值。根据这个统一的评分标准，客观地给动物评分，积分越高则老化度越高。1.3 数据处理实验数据使用 SPSS10.0 统计软件处理，采用 ANOVA 方差分析，检验水准定为 P0.05 为差异有显著性。http:/ 32 SAM衰老进程的行为学研究衰老进程的行为学研究21 研究对象健康的 SAMR1 和 SAMP8 2 月、4 月、6 月、8 月、10 月、12 月龄各 10 只，雌雄各半，由天津中医学院第一附属医院动物中心提供。22 行为学测试2.2.1Morris 水迷宫（Morris water maze）的组成5、6水迷宫由圆形水池、平台和记录系统三部分组成。水池直径 90cm，高 50cm，随意将水池分为四个象限（东北、东南、西南和西北象限）。每天实验开始，水池注水 30cm深，并加入 1 斤奶粉，使水成不透明乳白色，水温保持在 241左右。水池四周存在丰富的空间参照物（门、灯、桌椅、摄像头及实验者等），且位置保持不变，以供小鼠定位平台。圆柱形平台直径 9cm，高 28cm，置于任一象限中央，平面没于水面下 2cm。一摄像头置于水池中央的上方约 2m 处，自动采集动物游泳图像，所收集信号直接输入计算机，由图像自动采集和分析系统（中国医学科学院药物研究所提供）自动分析和处理，包括动物的逃避潜伏期、游泳路径、不同象限的停留时间及游泳路线的长度、搜索策略及中、外环游泳距离百分比等参数。2.2.2 实验内容（1）隐蔽平台试验(hidden platform trial)试验前 1d，让动物在不含平台的水池中自由游泳 90s，上午、下午各一次，使其熟悉迷宫环境。试验时平台位置固定不变，置于东北象限中央，平台中点离池壁22.5cm。在平台对侧选两个与之距离相等的点作为入水点，训练时将动物面朝池壁轻轻放入水中，记录小鼠从入水至找到平台的游泳路线的长度及找到平台的时间（逃避潜伏期，escape latency），然后让小鼠在平台上停留 10s。如果 90s 内找不到平台，潜伏期记为 90s，并将小鼠置于平台上休息 10s。每天在 2 个入水点各训练 1 次，以两次潜伏期的算术均值作为这一天的成绩进行统计分析。（2）空间探索试验（probe trial）隐蔽平台试验结束 24h 后，撤除平台。然后任选一相同入水点将小鼠放入水中，记录小鼠在 60s内的游泳路径，对小鼠在原平台象限的停留时间进行统计分析。（3）反向试验（reversal trial）http:/ 4操作基本同隐蔽平台试验，只是将平台位置移至对面象限（西南象限的中央，平台中点离池壁 22.5cm）。（4）可视平台试验（visible platform trial）为排除感觉、视觉或运动功能障碍对空间学习记忆的影响，最后 1d 进行可视平台试验。让平台位置露出水面 2cm，并帖上黄色胶带，其余操作同隐蔽平台试验。（5）试验设计所有实验小鼠均进行隐蔽平台试验 5d，探索试验 1d，反向试验 3d 及可视平台试验 1d，以评价 SAMR1 和 SAMP8学习记忆能力的增龄性变化。（6）数据处理所有数据用均数标准差（xs）表示，并用 SPSS10.0 统计软件处理。隐蔽平台试验及反向试验中所获得的数据采用重复测量数据的双因素方差分析（two-wayANOVA with repeated measures）7、8，以组别作为组间因素，不同的训练天数作为组内因素。在探索试验及可视平台试验中样本间比较用单因素方差分析（one-wayANOVE）。检验水准定为 P0.05 为差异有显著性。结果结果1 SAM老化度评分结果(见图 1)老化度评分结果(见图 1)图 1SAMR1 和 SAMP8的老化度评分老化度评分增龄性趋势图-20246810122月4月6月8月10月12月月龄老化度评分R1P8与同月龄 SAMR1 相比P0.05，与同组 2 月相比*P0.05P0.05 Compared with SAMR1 Group,*P0.05 Compared with 2-Month Group in the Same VarietySAMP8和 SAMRl 的老化度评分均呈现随龄性增加，但是二者增高的程度不同。SAMP8老化度评分随增龄显著增高，在 4、6、8、10、12 月龄的评分值明显高于同*http:/ 5组2月龄(P0.05)，并且比同龄SAMR1对照组的评分值显著增加(P0.05)。而SAMR1老化度评分随年龄增高不显著，在 8 月龄才表现出明显增高趋势(P0.05)。表明两组小鼠在 112 月的生存期间，SAMR1 出现明显衰老的现象较晚，而 SAMP8 从 4 月龄时即出现明显的衰老征象并迅速加重，表现出成熟期过后（4-6 月）迅速老化的特点。2SAM行为学测试结果行为学测试结果2.1隐蔽平台试验隐蔽平台试验中的逃避潜伏期反映了动物空间记忆的获得（acquisition）情况，即学习能力。2、4、6、8、10、12 月龄 SAMR1 和 SAMP8 学习情况的动态变化趋势见图 2：2 月、4 月和 6 月龄 SAMR1 和 SAMP8 的逃避潜伏期均随训练天数的增加而明显缩短，学习成绩稳步提高，两者比较无显著性差异。8 月、10 月和 12 月龄SAMP8没有表现出这种趋势，其中 8 月龄 SAMP8 第 3 天和第 5 天的逃避潜伏期明显长于 SAMR1，两者比较有显著性差异(P0.05)；而 10 月和 12 月龄 SAMP8 整个训练过程中其逃避潜伏期维持在较高的水平，且学习成绩不稳定，与 SAMR1 相比有显著性差异（P0.05），说明 SAMP8 小鼠的学习能力自 8 月龄出现明显低下。图 2 不同发育时期隐蔽平台试验中各组小鼠平均逃避潜伏期的变化趋势图2-Month020406080100Day1 Day2 Day3 Day4 Day5Training DayThe Escape LatencyTime(S)SAMR1SAMP84-Month020406080100Day1 Day2 Day3 Day4 Day5Training Daythe Escape LatencyTime(S)http:/ 66-Month020406080100Day1 Day2 Day3 Day4 Day5Training Daythe Escape LatencyTime(S)8-Month020406080100120Day1 Day2 Day3 Day4 Day5Trainging Daythe Escape LatencyTime(S)10-Month020406080100Day1 Day2 Day3 Day4 Day5Training Daythe Escape LatencyTime(S)12-Month020406080100Day1 Day2 Day3 Day4 Day5Training Daythe Escape LantencyTime(S)注：各数据点代表隐蔽平台试验中各组小鼠平均逃避潜伏期与 SAMR1 比较*P0.05*P0.01Age-related Changes of Mean Escape Latency Time in the Hidden Platform Trial in SAMP8 and SAMR1*P0.05*P0.01 Compared with SAMR1 Group2.2 空间探索试验探索试验主要反映动物的记忆保持能力。探索试验显示 SAMP8 在原平台象限停留时间随增龄有显著性差异，F（5,59）=3.64，P0.05。实验结果表明，2、4月龄 SAMP8 与同月龄 SAMR1 对照组比较，原平台象限的停留时间没有显著性差异（2 月 F（1，19）=1.09，P0.05；4 月 F（1，19）=0.025，P0.05）；6、8、10、12 月龄 SAMP8与同月龄 SAMR1 对照组比较，原平台象限的停留时间明显缩短（6月 F（1，19）=9.724，P0.01；8 月 F（1，19）=14.083，P0.01；10 月 F（1，19）=7.89，P0.05；12 月 F（1，19）=16.86，P0.05）。提示 SAMP8 的记忆保持能力于 6 月龄开始低于 SAMR1 对照组。（见图 3）*http:/ 7图 3 不同发育时期各组小鼠探索试验的原象限停留时间（s）The Comparison of Ability of Memory0510152025302Month4Month6Month8Month10Month12MonthGroupsRention Time(S)SAMR1SAMP8注：各数据点代表探索试验中原平台象限的停留时间。与同月龄 SAMR1 对照组比较，*P0.05,*P0.01;Age-related Changes of the Time Spent in the Quadrant of the Former Platform Position in probe trialin SAMP8 and SAMR1.*P0.05*P0.01 Compared with SAMR1 Group2.3 反向试验在连续 3d 的反向试验中，2 月和 4 月 SAMR1 和 SAMP8 的逃避潜伏期没有显著性差异；但 6 月、8 月、10 月和 12 月龄 SAMR1 和 SAMP8 的逃避潜伏期有显著性差异(P0.05)，6 月、8 月、10 月和 12 月龄 SAMP8 逃避潜伏期明显长于同月龄SAMR1。提示 SAMP8自 6 月再学习能力下降。（见图 4）图 4 不同发育时期反向试验的逃避潜伏期的比较（s）2-Month010203040506070Day 1Day 2Day3Training Daythe Escape LatencyTime(S)SAMR1SAMP84-Month020406080Day 1Day 2Day3Training Daythe Escape LatencyTime(S)*http:/ 86-Month020406080100Day 1Day 2Day3Training Daythe Escape LatencyTime(S)8-Month020406080100Day 1Day 2Day3training Daythe Escape LatencyTime(S)10-Month020406080100Day 1Day 2Day3Training Daythe Escape LatencyTime(S)12-Month020406080100Day 1Day 2Day3Training Daythe Escape LatencyTime注：各数据点代表不同月龄 SAMP8 和 SAMR1 反向试验中的逃避潜伏期比较Age-related Changes of Mean Escape Latency Time in the Reversal Trial in SAMP8 and SAMR1*P0.05,*P0.01 Compared with SAMR1 Group2.4 可视平台试验同月龄 SAMP8 和 SAMR1 逃避潜伏期的比较均无显著性差异。提示同一月龄动物在感觉、视觉或运动功能方面的差异未对其空间学习记忆产生明显的影响。（见图 5）*http:/ 9图 5不同发育时期可视平台试验的逃避潜伏期的比较（s）The Comparison of Escape Latency Time0204060802Month4Month6Month8Month10Month12MonthGroupsEscape Latency Time(S)SAMR1SAMP8注：各数据点代表可视平台试验中的逃避潜伏期，同月龄 SAMP8 和 SAMR1比较均无显著性差异。Age-related Changes ofEscape Latency Time in the Visible Platform Trial in SAMP8 and SAMR1.No obviousdifferences between SAMP8 and SAMR1 at the same age.讨论讨论老化度评分作为老化生物学的一个指标，从外在形体及行为改变来评定机体的老化程度，反映了机体的衰老征象4。SAMP8 和 SAMR1 两组小鼠老化度均随年龄增长而增加，但是两者老化征象出现的时间和随增龄增加的程度不同。SAMP8 在 4月龄即出现明显的老化征象，而 SAMR1 在 8 月龄才表现出明显的老化体征；并且伴增龄 SAMP8的老化度评分较 SAMR1 显著增加，在 4、6、8、10、12 月龄时 SAMP8组老化度得分均显著高于 SAMR1 组，说明 SAMP8 在成熟期（4-6 月）过后发生了快速老化，表现出了明显的老化征象。这与我们以前的研究结果基本相符9。学习记忆是脑的高级神经生理活动，学习是指接受外界环境信息而影响自身行为的过程，记忆则是指获得的信息或经验在脑内存储、加工和提取的过程。空间辨别性学习需要动物把空间方位周围的物体作为参照物，经过反复识认，从而在其脑内将参照物与空间方位联系起来，借助参照物来获得辨别该空间方位的能力。Morris水迷宫实验是一种让实验动物学习寻找不透明水中的隐蔽平台的操作过程。该实验自英国科学家 Richard Morris于 1981 年首次设计使用以来10，已成为一种研究空间学习和记忆的标准模式，能较准确地反映动物的空间参考记忆能力11。本实验用http:/ 10Morris 水迷宫对 SAMP8 空间参考记忆能力的增龄性变化进行系统的研究，为利用该模型进行痴呆研究提供实验依据。隐蔽平台试验用于检测动物空间辨别及学习记忆的获得能力。隐蔽平台试验结果显示，2、4、6 月 SAMP8 逃避潜伏期均随训练天数的增加而逐渐缩短，与同月龄的SAMR1相比无显著性差异；而8、10、12 月SAMP8逃避潜伏期随训练天数的增加变化不明显，且与同月龄的 SAMR1 相比明显延长，提示从 8 月龄开始 SAMP8 学习获得能力显著减退。探索试验是 Morris 水迷宫中较为敏感而精确的测试方法，测量动物的记忆保持能力12。原平台象限停留时间反映出动物的空间探索策略，及动物的记忆保持能力。在探索试验中，6、8、10、12 月龄 SAMP8原平台象限的停留时间与同月龄的 SAMR1 相比明显缩短，提示 SAMP8小鼠自 6 月龄出现记忆保持能力下降。反向试验主要反映动物的再学习能力，其实质是动物习惯于原平台位置的脱抑制过程12。反向试验中 6、8、10、12 月龄 SAMP8的逃避潜伏期与同月龄的 SAMR1 相比明显延长，表明其再学习能力减弱。Morris水迷宫结果说明 SAMP8 在 6 月龄即开始表现出空间学习记忆障碍，学习记忆的获得、保持及再学习能力的减退。空间认识图形的记忆是以视觉为基础的，Tolman 认为动物脑存在着迷宫的认知地图，可以从迷宫各点找到通向目标的通路13。本实验的可视平台试验结果排除了同月龄 SAMP8和 SAMR1 在感觉、视觉及运动功能方面的差异，保证了实验结果的可靠性。以上结果证实，SAMP8的老化征象表现出增龄性的快速衰老现象，学习记忆能力也表现出增龄性的减退；而且老化征象出现的较早，随衰老的加重 SAMP8表现出学习记忆功能障碍。本实验证实 SAMP8是研究衰老和老年性痴呆的理想模型，为后续的研究工作提供了实验依据。参考文献1.Takeda T，Hosokaw aM，Takeshita S.et al.A new murine model of acceleratedsenescenceJ.MechAging,1981,17:183-194.2.Okuma Y,Nomura Y.Senescence-accelerated mouse(SAM)as an animal model ofsenile dementia:pharmacological,neurochemicalandmolecularbiologicalapproachJ.Jpn J Pharmacol,1998,78:399-404.http:/ 113.Nomura Y,Okuma Y.Age-related defects in lifespan and learning ability in SAMP8mice J.NeurobiolAging,1999,20:111-115.4.Hosokawa M,Kasai R,Higuchi K,et al.Grading score system:a method forevaluation of the degree of senescence insenescence accelerated mouse(SAM)J.MechAgeing Dev,1984,26:91-102.5.Morris R.Developments of a water maze procedure for studying spatial learning in therat.J Neurosci Meth,1984,11(1):47-60.6.Pouzet B,Zhang WN,Feldon J,et al.Hippocampal lesioned rats are able to learn aspatial position using non-spatial 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