长链非编码RNA-02075参与调节子宫内膜异位症内膜基质细胞糖酵解的实验研究.pdf

国际生殖健康/计划生育杂志2 0 2 3年7 月第42 卷第4期JIntReprodHealth/FamPlan，Ju l y 2 0 2 3,Vo l.42,No.4D0I:10.12280/gjszjk.20230047长链非编码RNA-02075参与调节子宫内膜异位症内膜基质细胞糖酵解的实验研究265.论著朱佩佩，李凯全,钟晨怡，舒黎，吴春香，刘金勇，侯振，刁飞扬，冒韵东【摘要】目的：比较子宫内膜异位症（endometriosis,EMs）患者在位和异位内膜中长链非编码RNA-02075(LINC02075)的表达水平，研究LINC02075对内膜基质细胞糖酵解的调节作用。方法：收集10 例2 3 36 岁EMs患者的在位和异位内膜，以及10 例2 5 36 岁接受宫内节育器（intrauterinedevice,IUD）置人手术的健康女性的子宫内膜，采用实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测LINC02075的表达；培养异位内膜基质细胞,对其进行过表达LINC02075处理，以空白组作为对照,检测糖酵解相关酶的表达及细胞增殖、迁移和调亡率。结果:LINC02075在内膜细胞的细胞核和细胞质中广泛表达。与正常内膜和EMs患者在位内膜比较,EMs患者异位内膜LINC02075的mRNA表达水平显著升高(P0.05）。在异位内膜基质细胞中过表达LINC02075导致其葡萄糖的消耗显著增加（P0.05），同时与糖酵解相关的酶如已糖激酶1（hexokinase1,HK1）、丙酮酸脱氢酶激酶1（pyruvate dehydrogenasekinase1，PDK1）、乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase A,LDHA）、葡萄糖转运蛋白1(glucose transporter type1,GLUT1）和醛缩酶A（a ld o la s e A，A LD O A）的mRNA表达水平均呈上升趋势，其中LDHAmRNA表达水平升高，差异有统计学意义(P0.05);异位内膜基质细胞的增殖和凋亡率均增加、迁移力降低（均P0.05)。结论：EMs患者异位内膜中LINC02075的过表达可能通过增强糖酵解机制使异位内膜细胞增殖、迁移能力降低。【关键词】子宫内膜异位症；细胞增殖；瓦尔堡效应，肿瘤学；有氧糖酵解;LINC02075;细胞迁移Effect of Long Non-Coding RNA-02075 on Glycolysis in Endometrium Stromal Cells of Endometriosis:APreliminary Experimental Study ZHU Pei-pei,LI Kai-quan,ZHONG Chen-yi,SHU Li,WU Chun-xiang,LIUJin-yong,HOU Zhen,DIAO Fei-yang,MAO Yun-dong.Reproductive Medicine Center,The First AffiliatedHospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210029,China(ZHU Pei-pei,LI Kai-quan,ZHONG Chen-yi,SHU Li,WU Chun-xiang,LIU Jin-yong,HOU Zhen,DIAO Fei-yang,MAO Yun-dong);Affiliated SuzhouHospital of Nanjing Medical University,Suzhou 215002,Jiangsu Province,China(ZHONG Chen-yi)Corresponding author:MAO Yun-dong,E-mail:Abstract)Objective:To compare the expression levels of long non-coding RNA-02075(LINC02075)inthe eutopic and ectopic endometrium from patients with endometriosis,and to investigate the possible roles ofLINC02075 in the regulation of glycolysis in endometrial stromal cells.Methods:The samples of eutopic andectopic endometrium were from 10 patients with endometriosis aged 23-36 years.The endometrium samples from10 normal women accepting the surgery of intrauterine device placement aged 25-36 years were used as thecontrol.The expression of LINC02075 was evaluated by RT-qPCR.The ectopic endometrial stromal cells were invitro cultured.The overexpression of LINC02075 was induced by the lentivirus and adenovirus vectors.Theglycolytic enzymes,cell proliferation,migration and apoptosis rates were tested.Results:LINC02075 was widelyexpressed in the nucleus and cytoplasm of endometrial stromal cells.The expression level of LINC02075 mRNA inectopic endometrium(the endometriosis group)was significantly higher than that in normal endometrium(thecontrol group)and eutopic endometrium(the endometriosis group)(all P0.05).Overexpression of LINC02075significantly increased glucose consumption(P0.05)in ectopicendothelial stromal cells,while the expression levels of glycolysis-related enzymes such as hexokinase 1(HK1),pyruvate dehydrogenase kinase 1(PDKI),lactate dehydrogenase A(LDHA),glucose transporter type 1(GLUTI)and aldolase A(ALDOA)were also increased,among which the increased expression level of LDHA mRNA wasstatistically significant(P0.05).Overexpressed LINC02075 also increased the proliferation and apoptosis anddecreased the migration of endometrial stromal cells(all P0.05).Conclusions:The abnormally elevated LINC02075in ectopic endometrium of patients with endometriosis may promote proliferation and reduce migration ofendometrial stromal cells by the enhanced glycolytic mechanism.基金项目：国家自然科学基金（8 16 7 1438）；国家重点研发计划（2 0 17 YFC1001604）作者单位：2 10 0 2 9南京医科大学第一附属医院生殖医学中心（朱佩佩，李凯全，钟晨怡，舒黎，吴春香，刘金勇，侯振，刁飞扬，冒韵东);南京医科大学附属苏州医院(钟晨怡）通信作者：冒韵东，E-mail:266Keywords Endometriosis;Cell proliferation;Warburg effect,oncologic;Aerobic glycolysis;LINC02075;Cellmigration国际生殖健康/计划生育杂志2 0 2 3年7 月第42 卷第4期JIntReprodHealth/FamPlan,July2023,Vol.42,No.4(J Int Reprod Health/Fam Plan,2023,42:265-271)子宫内膜异位症（endometriosis,EMs)是指子宫内膜的间质和腺体在子宫腔以外的部位浸润和生长。EMs常见的临床症状为痛经、慢性盆腔痛和不孕-2 。目前为止,有一些理论可以解释EMs的发病机制，如上皮细胞化生、直肠阴道区域的苗勒管残体原位发育、经血逆流种植3,遗传因素也逐渐受到关注4。然而，尚无单一的学说可以完整解释EMs的发病机制。目前已有大量的研究表明EMs患者的子宫内膜基质细胞采用有氧糖酵解的方式,亦称为瓦尔堡效应(Warburg效应)5。Warburg效应是指正常情况下细胞主要依赖氧化磷酸化来产生能量，但是肿瘤细胞即使在氧气充足的情况下仍然采用有氧糖酵解的方式产能。长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是指长度超过2 0 0 个核苷酸的异质性转录本，不具有或者具有较弱的蛋白编码能力。研究表明lncRNA参与许多生理病理学过程，包括细胞分化6 、细胞周期变化。LncRNA的许多分子机制也被发现，包括参与基因编辑、染色体重塑、调节剪切、mRNA的沉默和转录调节18-1。近年来,越来越多的研究表明lncRNA在调节肿瘤细胞能量代谢中发挥着重要作用。其能够直接或间接调节葡萄糖代谢、脂代谢以及其他通路涉及的关键酶，从而使肿瘤细胞处于高代谢水平,提供细胞生存所需的能量与物质,增强其生存能力。比如,lncRNAHULC在肝癌中通过与乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase A,LDHA)和丙酮酸激酶M2(pyruvatekinaseM2,PKM2)相互作用促进有氧糖酵解12 。既往也有研究发现lncRNA在EMs中存在差异表达,并促进内膜基质细胞的增殖、迁移和侵袭等生物学行为13。笔者所在课题组之前的研究发现，抗增殖蛋白（prohibitin,PHB）可影响EMs异位基质细胞的糖代谢4。大多数lncRNA基因位于蛋白质编码基因的10 kb内并通过作用于该蛋白质编码基因发挥作用15-16 ,基于此，笔者依据该理论通过Ensembl数据库、NONCODE数据库发现了LINC02075。LINC02075位于人染色体17 q21.33，具有3个外显子，对于其是否在EMs的发生、发展中发挥作用，目前鲜有相关研究。本研究比较EMs患者在位和异位内膜基质细胞LINC02075的表达水平，旨在探讨LINC02075对内膜基质细胞糖酵解的调节作用。1对象与方法1.1研究对象1.1.1临床标本对于EMs患者分别收集其异位及在位内膜组织,异位子宫内膜样本和在位子宫内膜样本均来自10 例2336岁的EMs患者，所有标本根据分类进行混样。所有患者均为2 0 2 1年8 月一2 0 2 2 年1月在南京医科大学第一附属医院生殖医学中心行腹腔镜手术并在术后病理确诊为EMs。正常子宫内膜样本来自10 例2 5 36 岁的接受宫内节育器（intrauterinedevice,IUD）置人手术的参与者，在比较3组LINC02075的表达差异中，此组作为对照组。纳人标准：处于月经增殖期；月经规则，无其他内分泌、代谢和免疫性疾病；无恶性肿瘤史；至少3个月内未使用留体类激素（包括流产或避孕药物）。排除标准：合并卵巢囊肿或肿瘤；卵巢功能减退；多囊卵巢综合征；肥胖或低体质量；合并内分泌疾病，包括高泌乳素血症、甲状腺功能亢进或减退、肾上腺皮质增生症、糖尿病、各种原因引起的低促性腺激素性性腺功能减退、垂体占位或梗死、卡尔曼综合征（K a l l m a n n 综合征）等；吸烟、酗酒；有毒物、特殊药物、放射性物质接触史；存在染色体异常。本研究由南京医科大学第一附属医院伦理委员会批准（编号：2 0 13-SRFA-093），且所有患者均签署了知情同意书。1.1.2研究试剂0.2%I型胶原酶（Sigma公司，美国）;10%胎牛血清、DMEM/F-12(Gibco公司，美国）;1%抗生素、CCK8试剂盒（苏州新赛美生物公司，中国);兔抗人波形蛋白抗体（A b c a m公司，美国）；鼠抗人角蛋白抗体18（Cell SignalingTechnology，美国）；AlexaFlour594驴抗兔IgG二抗、AlexaFlour488驴抗鼠IgG二抗（Invitrogen公司，美国）；乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetra-acetic acid,EDTA）胰蛋白酶、TRIzol(Invitrogen公司，美国）;PrimeScriptIMRTreagentKit、T BG r e e nPremixExTaq real-timePCRKit(Takara公司，日本）;葡萄糖水平测定试剂盒、乳酸测定试剂盒（南京建成有限公司，中国）;AnnexinV-FITC/PI双染细胞调亡检测试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司，中国）；荧光原位杂交（fluorescencein situhybridization，FI SH）探针及试剂盒（广州锐博有限公司，中国）；Transwell小室（BDBiosciences，美国）；本课题涉及的探针、定量聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）引物过表达LINC02075的病毒均由广州锐博有限公司合成。1.2实验方法1.2.1原代细胞的分离与培养术中收集的子宫内膜样本与0.2%I型胶原酶孵育，分离获得子宫内膜基质细胞。采用单丝尼龙网纯化子宫内膜基质细胞。然后，将收集的细胞悬液以150 0 r/min的转速离心，加人含有10%胎牛血清和1%抗生素的高葡萄糖Dulbecco改良Eagle培养基。置于Thermo培养箱（ThermoFisherScientific，美国）中培养，37，5%CO2，每国际生殖健康/计划生育杂志2 0 2 3年7 月第42 卷第4期JIntReprodHealth/FamPlan，Ju l y 2 0 2 3,Vo l.42,No.42d更换1次培养基。1.2.2原代细胞的纯度鉴定对分离的细胞进行波形蛋白和角蛋白的免疫荧光染色。将载片上培养的细胞用9 5%酒精固定，分别与1:50 0 0 稀释的免抗人波形蛋白抗体和1:8 0 0 稀释的小鼠抗人角蛋白抗体室温孵育16 h后磷酸盐缓冲液（p h o s p h a t e b u f f e r s o l u t i o n，PBS）冲洗后，分别用AlexaFlour594驴抗兔IgG二抗和Alexapowder488驴抗鼠IgG二抗在37 孵育1h后用4,6-二胖基-2-苯基吲哚（4,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)进行核染色。最后用激光共聚焦显微镜对载玻片进行数字成像。1.2.3实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR检测细胞中RNA表达量。使用TRIzol试剂提取总RNA。用紫外分光光度计测定RNA的纯度和浓度。用PrimeScriptMRT试剂盒反转录至互补DNA（c o m p l e m e n t a r y D NA,c D NA）。在实时荧光定量PCR系统上用TBGreenPremixExTaqreal-timePCR试剂盒分析RNA的表达量。PCR反应条件：9530 s预变性，955s变性，然后在6 0 30 s共40 个循环的退火和延伸后，9515s，601m i n,9515s 得到熔解曲线。采用2-AA方法计算目的基因的相对表达量。所有引物均采用Primer3Plus设计,由广州锐博有限公司合成。引物序列见表1。表1实时荧光定量PCR引物序列引物名称引物序列(5-3)LINC02075上游：CTGAGACCATCAACCCTATC下游：ACTTATTCAACTGGCACTCCGLUT1上游:GGCCAAGAGTGTGCTAAAGAA下游:ACAGCGTTGATGCCAGACAGPDK1上游:TGTGAAGATGACTGACCGAGGAG下游:GGCAATCCATAACCAAAACCAGHK1上游:GCTCTCCGATGAAACTCTCATAG下游：GGACCTTACGAATGTTGGCAAPKM上游：ATGTCGAAGCCCCATAGTGAA下游:TGGGTCGTGAATCAATGTCCAALDOA上游:ATGTCGAAGCCCCATAGTGAA下游：TGGGTGGTGAATCAATGTCCALDHA上游：ATGGCAACTCTAAAGGATCAGC下游:CCAACCCCAACAACTGTAATCTSDHA上游:CGGCATTCCCACCAACTA下游:GCCCGACCAAAGACAACC-actin上游:TCAAGATCATTGCTCCTCCTGAG下游：ACATCTGCTGGAAGGTGGACA注：GLUT1葡萄糖转运蛋白1,PDK1丙酮酸脱氢酶激酶1,HK1已糖激酶1,LDHA乳酸脱氢酶A,PKM丙酮酸激酶，ALDOA醛缩酶A,SDHA琥珀酸脱氢酶A。1.2.4FISH确定LINC02075在子宫内膜基质细胞内的定位将细胞爬片置于2 4孔板底并接种细胞，待细胞生长融合达到6 0%7 0%时，对细胞进行固定、打孔，PBS清洗5min后用4%多聚甲醛室温固定10 min，PBS清洗细胞3次后再加人1mL通透液（0.5%TritonX-100的PBS），4静置5min；弃267.通透液，PBS清洗细胞3次进行探针检测：预热杂交液，每孔加人2 0 0 L预杂交液，37 下封闭30 min，避光条件下，将2.5L20mol/L探针加人到10 0 L杂交液，弃预杂交液后加人此100L探针杂交液混合液，37 杂交过夜。弃杂交液后42 下杂交洗液I清洗3次，每次5min，室温下用杂交洗液、PBS依次清洗细胞各1次，每次5min；避光下DAPI染色10 min，PBS清洗3次，每次5min后于载玻片上封片后进行荧光检测。1.2.5慢病毒及腺病毒的转染本研究中使用的慢病毒和腺病毒包装的人LINC02075cDNA和阴性对照序列均由广州锐博有限公司设计。待6 孔板中内膜基质细胞生长融合达到20%30%时，将培养基替换为含有10%胎牛血清的DMEM/F-12。基质细胞按厂家说明分别用慢病毒和腺病毒颗粒转染，转染复数（mutiplicityof infection，M O I)=10 0。转染7 2 h后用实时荧光定量PCR检测LINC02075的相对表达量。将转染后的异位内膜基质细胞作为过表达组，未处理过的异位内膜基质细胞作为对照组进行后续实验。1.2.6葡萄糖消耗测定和乳酸检测培养原代细胞并用慢病毒处理12 h后，用含0.1%血清的DMEM/F-12替换培养基，培养2 4h和48 h后收集细胞上清液和空培养基。使用葡萄糖测定试剂盒进行葡萄糖水平定量，使用乳酸测定试剂盒在96孔板中进行乳酸定量。葡萄糖含量（mmol/L)=（试验孔OD值-空白孔OD值）/（标准孔OD值-空白孔OD值）标准浓度（5.55m m o l/L）。葡萄糖消耗量=空培养基孔葡萄糖含量-培养基上清孔葡萄糖含量。相对葡萄糖消耗量(mmol/L)=葡萄糖消耗量/活细胞数目（10%个细胞）。乳酸水平计算公式为：乳酸含量（mmol/L）=（试验孔OD值-空白孔OD值）/（标准孔OD值-空白孔OD值)x标准浓度（3mmol/L）。乳酸生成量=培养基上清孔乳酸含量-空培养基孔乳酸含量。相对乳酸生成量（m m o l/L)=乳酸生成量/活细胞数目（10%个细胞）。1.2.7细胞增殖测定用CCK8试剂盒检测培养转染了腺病毒的子宫内膜基质细胞的活力。转染12 h后,将细胞接种到96孔板中，每孔10 0 L，密度为110 5细胞/mL。细胞培养0、24、48、7 2 h 后，每孔加人10 LCCK8试剂和90 L的无血清DMEM/F-12,37下孵育1h，酶标仪检测450 nm吸光度。1.2.8细胞调亡细胞调亡检测采用0.2 5%不含EDTA的胰蛋白酶消化后收集细胞沉淀，将子宫内膜基质细胞重新悬浮于5LAnnexinV-PI溶液和5LPI结合缓冲液中，室温避光孵育15min，孵育结束后加人40 0 L1xAnnexinVBindingBuffer轻柔混合后冰上静置，30 min内用流式细胞仪检测荧光强度。1.2.9细胞侵袭力测定细胞用胰蛋白酶消化，然后用胎牛血清DMEM/F-12培养基重悬。Transwell上室中放置2 0 0 L细胞悬液，下室中加人6 0 0 L含10%胎牛血清的培养基。置于培养箱2 4h后，用棉签擦拭上腔表面的细胞，膜下细胞用4%多聚甲醛固定15min，蒸馏水清洗2 次，结晶紫染色30 min，而后在高倍显微镜下计数通过滤膜的细胞数。1.3统计学方法借助GraphPadPrism9软件对实验数据进行统计学分析。定量资料采用均数标准差（xs）表示，2 组间比较采用两独立样本均数的t检验，3组间比较采用单因素方268差分析，组间两两比较采用Turkey法。P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1LINC02075在EMs组织中的表达和亚细胞定位LINC02075在EMs异位内膜中的表达水平高于正常子宫内膜和EMs在位内膜（P0.0001，见图1A）。同时细胞免疫组织化学波形蛋白染色结果证实分离细胞为子宫内膜基质细胞（见图1B）。此外，FISH结果显示,LINC02075在异位子宫内膜基质细胞的细胞核和细胞质中均有表达(见图1C)。2.2LINC02075对葡萄糖代谢的影响装的人LINC02075cDNA转染异位子宫内膜基质细胞后,LINC02075的相对表达量高于对照组（P0.05，见图2 A），说明异位基质细胞对过表达Akeratin8国际生殖健康/计划生育杂志2 0 2 3年7 月第42 卷第4期JIntReprodHealth/FamPlan，Ju ly 2 0 2 3，V o l.42,No.4LINC02075有效，可用于后续实验。过表达LINC02075后，异位内膜基质细胞2 4h和48 h葡萄糖消耗量显著增加(P0.05，见图2 C）。LINC02075在异位子宫内膜基质细胞中过表达后，关键的糖酵解酶mRNA表达上调,其中LDHAmRNA水平升高，差异有统计学意义（P0.05,见图2 D）。2.3过表达LINC02075对异位内膜基质细胞增殖和凋亡的影响慢病毒包装的人LINC02075cDNA和阴性对照分别转染异位子宫内膜基质细胞后,过表达组的LINC02075的相对表达量高于空白组和阴向腺病毒包性对照组(P0.05,见图3A）。CCK-8 法得到的细胞增殖曲线显示，过表达LINC02075可在48 h和7 2 h显著促进细胞增殖（P0.05，见图3B)。过表达LINC02075后,细胞总调亡率升高(P0.01,见图3C)。BDAPI*Merge64vimentin2工0DAPIMerge在位内膜组异位内膜组CProbeDAPIMerge18sU6LINC02075注：图A为采用实时荧光定量PCR检测3组内膜LINC02075的相对表达量比较，以-actin为对照，EMs异位内膜组（n=10)LINC02075mRNA的相对表达量高于正常子宫内膜组（n=10)和EMs在位内膜组（n=10)；*P 0.0 0 0 1。图B为通过免疫荧光法鉴定人子宫内膜细胞的纯度，使用抗波形蛋白（vimentin）抗体（在子宫内膜基质细胞中特异性表达）和抗角蛋白（keratin）抗体（在子宫内膜上皮细胞中特异性表达）进行检测，红色为波形蛋白，绿色为角蛋白，蓝色为DAPI染色的细胞核（2 0 0），标尺=10 0 m。图C为通过免疫荧光的LINC02075探针显示LINC02075的位置，探针18 s和U6分别在细胞质和细胞核中稳定表达（10 0），DAPI表示细胞核（蓝色），标尺=50 m。图1LINC02075在EMs中的表达和亚细胞定位国际生殖健康/计划生育杂志2 0 2 3年7 月第42 卷第4期JIntReprodHealth/FamPlan,July2023,Vol.42,No.4AD口对照组过表达组120.07*100.0-80.0-60.0-40.020.02.01.51.00.50.0对照组过表达组注：图A为实时荧光定量PCR检测腺病毒包装的人LINC02075cDNA转染异位子宫内膜基质细胞后，LINC02075在原代异位子宫内膜基质细胞中的相对表达量,-actin为内参基因。图B为过表达LINC02075后，异位子宫内膜基质细胞的葡萄糖相对消耗量的变化，与对照组相比,过表达组葡萄糖消耗增加（P0.05)。相对乳酸生成量（m m o l/L)=乳酸生成量/活细胞数目（10%个细胞）。图D为通过PCR检测异位内膜基质细胞过表达LINC02075后其糖代谢相关酶的mRNA水平变化。*P0.05,*P0.0001。H K 1已糖激酶1,PDK1丙酮酸脱氢酶激酶1,LDHA乳酸脱氢酶A,PKM丙酮酸激酶,ALDOA醛缩酶A,GLUT1葡萄糖转运蛋白1,SDHA琥珀酸脱氢酶A。A8642空白对照组对照组B43200注：图A为实时荧光定量PCR检测慢病毒包装的人LINC02075cDNA和阴性对照分别转染异位子宫内膜基质细胞后，LINC02075在EMs中的相对表达量，内部对照采用-actin。图B为CCK-8法检测腺病毒转染后2 4、48、7 2 h子宫内膜基质细胞的增殖情况，48、7 2 h过表达组的OD值显著高于对照组(P0.05）。图C为Annexin-V/PI双染色检测细胞调亡，流式细胞术根据Annexin-V和PI在细胞表面的荧光强度对细胞进行分布，Q4象限的细胞群代表早期凋亡细胞，Annexin-V阳性细胞的百分比表示细胞调亡水平，结果表明，过表达LINC02075可促进子宫内膜基质细胞的凋亡(P0.01)。*P 0.0 5,*P 0.0 1,*P 0.0 0 1,*P 0.0 0 0 1。2.4过表达LINC02075对异位内膜基质细胞迁移力的影响为了确定LINC02075是否在基质细胞迁移过程中发挥作用，本研究采用慢病毒转染原代异位子宫内膜基质细胞，结果显示,LINC02075过表达组通过Transwell腔的异位内膜基质细胞少于阴性对照组和空白组，差异有统计学意义（均P0.05），269.BC121*(T/louw)840*阴性过表达组+过表达组+对照组H24T时间(h）口对照组过表达组1.5(T/louu)1.0-0.50.02448时间(h)图2LINC02075对葡萄糖代谢的影响C10Q13.5610”10410310210Q489.91001010102103104105106Comp-FL6-A:4.APC空白对照组106Q14.53105104101010Q480.41001010102103104 1051064872图3LINC02075对子宫内膜基质细胞增殖和凋亡的影响口对照组121过表达组10*8642面02448时间(h)Q25.02Q31.49Q29.66Q35.41Comp-FL6-A:4.APC过表达组见图4。3讨论3.1LINC02075对EMs糖酵解代谢的影响一种有恶性倾向的良性疾病。研究发现EMs异位内膜基质细胞具有高侵袭性、高增殖性和低凋亡性17 。SDH106Q14.83105104103102100483.410010010102103104105106Comp-FL6-A:4.APC阴性对照组*2015(%）率1050空白阴性过表达组对照组对照组EMs是Q28.12Q33.65270空白对照组注：迁移实验中细胞通过Transwell迁移的代表性显微图（结晶紫染色法x100）和通过Transwell迁移的细胞的定量图，数据显示为每个视野中迁移细胞的平均数量。*P0.05,*P0.01。标尺=10 0 m。空白组：异位子宫内膜基质细胞。阴性对照组：转染了阴性对照慢病毒的异位内膜基质细胞。过表达组：转染了慢病毒包装的人LINC02075cDNA的异位内膜基质细胞。在糖代谢方面,EMs内膜基质细胞采用与恶性肿瘤细胞类似的糖酵解形式。越来越多的研究发现lncRNA可以重编程肿瘤细胞的葡萄糖代谢18-19。既往研究发现,与正常子宫内膜相比,EMs子宫内膜组织中存在大量差异表达的lncRNA。例如Cui等2 0 利用测序技术阐明了EMs增生期异位子宫内膜和正常子宫内膜lncRNA表达谱的差异。这表明lncRNA可能在EMs的发生和发展中发挥作用。笔者通过Ensembl数据库、NONCODE数据库在PHB的上游定位到LINC02075,本研究通过PCR实验发现LINC02075在异位子宫内膜基质细胞中显著上调，这提示其可能是EMs发生、发展中的调节因子。过表达LINC02075后，异位子宫内膜基质细胞葡萄糖消耗量增加（P0.05），提示LINC02075可能参与调节EMs异位内膜基质细胞的葡萄糖代谢,即促进糖酵解的作用。Xue等2 发现,在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中lncRNA促进了Warburg效应，该发现与本研究的发现都提示了lncRNA的促糖酵解作用。癌细胞可以重新调整其代谢模式来促进生长、生存、增殖和长期能量供应。这种代谢改变的共同特征是，线粒体有氧糖代谢通路正常工作，但葡萄糖摄取增加和葡萄糖酵解增加产生更多的乳酸,即Warburg效应2 。为了进一步探索LINC02075在EMs中葡萄糖代谢的潜在作用,本研究采用实时荧光定量PCR检测糖酵解酶mRNA的相对表达量。结果显示，过表达LINC02075后，糖酵解相关的酶HK1、PD K 1、LD H A、G LU T 1m RNA 水平呈现上升的趋势，但只有LDHAmRNA水平升高，差异有统计学意义（P0.05），这提示LINC02075可能通过影响子宫内膜基质细胞糖酵解过程的限速酶国际生殖健康/计划生育杂志2 0 2 3年7 月第42 卷第4期JIntReprodHealth/FamPlan，Ju l y 2 0 2 3,Vo l.42,No.4阴性对照组空白阴性过表达组对照组对照组图4LINC02075对异位内膜基质细胞迁移力的影响LDHA的mRNA表达来参与糖酵解过程18.2 3-2 4。综上，笔者推测在EMs异位子宫内膜中，LINC02075过表达可能增加了HK1和GLUT1的表达，进一步改善了葡萄糖的摄取和利用。LINC02075过表达促进子宫内膜基质细胞有氧糖酵解可能是由于LDHA表达升高,SHDA表达下降，抑制三羧酸循环，增加乳酸生成，从而迅速向子宫内膜基质细胞提供能量。3.2LINC02075影响EMs增殖、侵袭和凋亡Diao等2 和Hou等2 6 发现EMs异位基质细胞的增殖和侵袭能力较在位内膜基质细胞明显增强。本研究也发现过表达LINC02075的异位内膜基质细胞增殖力增强(P0.05）。既往研究发现EMs异位基质细胞的侵袭、血管生成和增殖增加,凋亡减少。本研究发现过表达LINC02075后的细胞迁移能力下降，凋亡增加(P0.05),这与以往研究不一致。Lee等2 7 发现,缺氧可诱导子宫PDK1代谢变化和子宫内膜基质细胞凋亡。根据以往研究，笔者推测异位内膜基质细胞中升高的LINC02075虽然增强其糖酵解能力导致其细胞增殖能力增强。但是增强的糖酵解能力仍无法抵御盆腔环境中缺氧刺激和炎症等不利因素，导致异位内膜基质细胞的调亡增加。换言之LINC02075过表达降低了细胞调亡,但环境因素影响更强,综合后表现为凋亡增加。具体的凋亡增加原因需进行后续深人的研究。综上所述，本研究发现LINC02075在EMs的差异表达,其过表达后葡萄糖消耗增加，同时子宫内膜基质细胞迁移能力减弱,增殖能力增强，凋亡增加。因此,LINC02075可能通过提高限速酶mRNA的表达水平来增强EMs异位子宫内膜基质细胞的糖酵解,从而增强细胞增殖和侵袭性生长，这可能是EMs发生125过表达组100-75-50-25-0*国际生殖健康/计划生育杂志2 0 2 3年7 月第42 卷第4期JIntReprodHealth/FamPlan,July2023,Vol.42,No.4发展的机制之一。但本研究也存在一定的局限性，未探讨LINC02075促进EMs糖酵解的具体机制，后续需扩大样本量进行深入研究。参考文献1 Wei Y,Liang Y,Lin H,et al.Autonomic nervous system andinflammation interaction in endometriosis-associated pain J.JNeuroinflammation,2020,17(1):80.doi:10.1186/s12974-020-01752-1.2 Chapron C,Marcellin L,Borghese B,et al.Rethinking mechanisms,diagnosis and management of endometriosisJ.Nat Rev Endocrinol,2019,15(11):666-682.doi:10.1038/s41574-019-0245-z.3 Sampson JEA.Peritoneal endometriosis due to the menstrualdissemination of endometrial tissue into the peritoneal cavityJJ.AmJ Obstet 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