芋可溶性淀粉合成酶CeSS基因家族的克隆和表达分析 (1).pdf

江苏农业学报(.)():/.王 立殷剑美韩晓勇等.芋可溶性淀粉合成酶 基因家族的克隆和表达分析.江苏农业学报():.:./.芋可溶性淀粉合成酶 基因家族的克隆和表达分析王 立 殷剑美 韩晓勇 蒋 璐 郭文琦 金 林 张培通(江苏省农业科学院经济作物研究所江苏 南京)收稿日期:基金项目:国家自然科学基金青年科学基金项目()江苏省自然科学基金面上项目()江苏省种业振兴揭榜挂帅项目()作者简介:王 立()男河南郑州人博士副研究员主要从事芋头遗传育种研究().通讯作者:张培通().摘要:为探索芋淀粉合成机理本研究从靖江香沙芋中克隆获得了 个芋可溶性淀粉合酶()家族基因 个基因、碱基序列全长分别为 、编码形成 个亲水性蛋白质 系统进化分析结果显示 个蛋白质、与海枣、芦笋、药用稻等单子叶植物的亲缘关系较近 表达分析结果表明这 个 基因广泛存在于芋的叶片、叶柄、母芋和子芋中 和 的表达水平随芋球茎的发育而显著增加在种植 达到峰值而 在成熟后期(种植 )的芋球茎中表达量较高关键词:芋 可溶性淀粉合成酶 基因克隆 表达分析中图分类号:.文献标识码:文章编号:()():().().:(.)淀粉是储存在叶片叶绿体或储存器官中的主要化合物被用作种子休眠和植物生长的能量来源也是人类和动物最重要的能量来源并被广泛用作工业生产的原料 植物主要合成支链淀粉和直链淀粉两者的结构和比例决定了淀粉的理化特性如溶胀、溶解性、可塑性和黏度等研究结果显示可溶性淀粉合成酶()通过催化形成 糖苷键延长合成具有不同长度的支链淀粉决定支链淀粉的链条长度和链长分布从而影响支链淀粉的理化性质以及淀粉粒的结构和品质 主要存在于植物叶片和贮藏组织主要分为 个亚家族即、和 大多存在于质体基质中 主要参与支链淀粉的短链产生 和 参与支链淀粉的链条延伸 研究结果显示 在马铃薯块茎淀粉合成中的酶活性较弱而在水稻和玉米胚乳中具有较强的活性下调 的转录水平会影响马铃薯块茎中的链长分布改变淀粉结构和其他淀粉合成酶活性 此外 每个亚家族又含有同工酶但是这些同工酶如何影响植物中合成的支链淀粉的数量和组成尚待阐明 目前关于芋可溶性淀粉生物合成的研究相对较少对于淀粉合成酶的功能尚不清楚本研究在靖江香沙芋转录组测序基础上克隆获得 个芋可溶性淀粉合成酶 家族基因通过分析氨基酸序列、蛋白质结构和亲缘进化关系检测 个基因的转录表达谱探索其与淀粉丰度形成的关系从而加快芋可溶性淀粉合成机理的深入研究 材料与方法.试验材料供试材料为靖江香沙芋 种植于江苏省农业科学院六合试验基地 分别在种植 、和 取样 地上部组织取样部位为叶片和叶柄地下部组织取样部位为母芋、子芋和根 叶片打孔取样叶柄切段取样球茎去皮取样根洗去杂质取样统一贮存于 冰箱 每个组织取样质量约 设 份重复.合成采用 天根生化科技(北京)有限公司产品提取样品 合成采用宝生物工程(大连)有限公司 和 试验方法参照试剂盒说明书.基因克隆根据已获得的靖江香沙芋转录组数据通过 方法比对获得 基因信息使用 .设计基因克隆引物和基因表达引物(表)扩增方法参考王立等的方法 扩增产物送北京鼎国科技公司完成序列测定表 家族基因特异引物 基因引物 名称序列()引物 名称序列()用途基因克隆基因克隆基因克隆基因表达基因表达基因表达基因表达.氨基酸序列和进化分析采用 完成氨基酸序列同源性比较在.中构建系统进化树 采用 在线数据库(:/./)进行蛋白质结构域预测在 网站(:/./)计算等电点和相对分子质量采用.预测亚细胞定位.转录表达分析以 基因为内参基因 采用 进行 检测按照试剂盒说明书操作定量 反应体系为 程序如下:每循环 个循环最后 每个样品 次重复 参考 等的方法计算基因相对表达量.支链淀粉含量测定采用何洁等双波长法测定芋球茎中的支链淀粉含量 取播种后不同时期球茎干燥样品质量为 用 无水乙醇 /研磨沸水浴加热溶解 冷却后定容至 检测、下的吸光值计算支链淀粉含量江 苏 农 业 学 报 年 第 卷 第 期.数据处理使用 软件和 .软件进行试验数据统计分析 结果与分析.芋可溶性淀粉合成酶家族基因克隆及序列分析 经过 比对共鉴定获得 个芋可溶性淀粉合 成 酶 基 因 分 别 命 名 为、基因碱基序列全长为 编码 个氨基酸(图)蛋白质相对分子质量和理论等电点分别为 和 (表)基因碱基序列全长为 编码 个氨基酸(图)蛋白质相对分子质量和理论等电点分别为 和(表)基因碱基序列全长为 编码 个氨基酸(图)蛋白质相对分子质量和理论等电点分别为 和 (表)蛋白质亲水性预测和亚细胞定位预测结果(表)显示 个 蛋白均为亲水性蛋白质且均定位在叶绿体图 氨基酸序列分析.表 基因家族及其编码蛋白质的生化特性 基因编码区大小()氨基酸长度()蛋白质相对分子质量理论等电点疏水指数 .王 立等:芋可溶性淀粉合成酶 基因家族的克隆和表达分析图 氨基酸序列分析.芋可溶性淀粉合成酶氨基酸序列和进化分析图 显示 个 蛋白的氨基酸序列比较相似均含有 结构 域 其 中 和 蛋白含有 个 结构域()和 个 结构域()而 仅含有 个 结构域()以及 个 结构域(、)系统进化分析结果(图)表明 个 蛋白聚类分为 组表现出进化差异:与海枣(.)中 蛋白最接近序列相似度 为 其 次 是 菜 豆()和 拟 南 芥()序列相似度分别为 和 与芦笋()中相应江 苏 农 业 学 报 年 第 卷 第 期图 氨基酸序列分析.蛋白质较相近序列相似度为 其次是菠萝()和繁穗苋()与药用稻()蛋白相似度最高序列相似度为王 立等:芋可溶性淀粉合成酶 基因家族的克隆和表达分析其次是玉米()和拟南芥()图 蛋白 结构分析.:繁穗苋:菠萝 .:拟南芥琴亚科:拟南芥:芦笋:甘蓝型油菜:芥菜:芋:油棕:大豆:甘薯:苹果:木薯:川桑:莲:药用稻 :粳稻:菜豆:海枣:胡杨:梅花:蓖麻:番茄:可可:小麦:葡萄:玉米图 不同植物 家族基因系统进化分析.江 苏 农 业 学 报 年 第 卷 第 期.芋可溶性淀粉合成酶家族基因的表达水平分析 图 显示芋可溶性淀粉合成酶家族的 个基因、在芋的不同组织中均有表达但在母芋和子芋中高表达在根、叶片和叶柄中低表达说明同一基因的组织表达谱差异较大而在同一组织中尤其是母芋和子芋中 基因表达量最高其次是 和 图 显示在芋发育过程中叶片中、基因表达趋势基本不变而球茎中的表达水平均高于叶片 球茎中的、基因在种植 后表达量开始提高在种植 表达水平达到峰值随后略有下降而 基因在种植 后在球茎中表达量开始上调在种植 时表达增速最快随后表达水平趋缓在种植 时表达水平最高同一基因不同组织间不同小写字母表示差异显著()图 、和 在不同芋组织中的表达.同一组织间不同小写字母表示差异显著()图 ()、()和 ()在芋不同发育时期的表达.()()().的基因表达与芋球茎支链淀粉含量相关性分析 图 显示芋球茎支链淀粉含量呈持续增长趋势在种植 增长速率最高球茎支链淀粉含量在种植 达到较大值 相关性分析结果显示芋球茎 的表达水平与支链淀粉含量之间存在明显正相关性 讨 论.芋可溶性淀粉合成酶家族成员具有各自独特功能 在植物叶片和贮藏组织中已经发现了 种形式的淀粉合成酶:、和 在马铃薯上的研究结果显示 和 是主要淀粉合酶会影响淀粉含量和结构 是支链淀粉主要合成酶 其 活 性 占 块 茎 可 溶 性 淀 粉 合 成 酶 活 性 的不同小写字母表示差异显著()图 不同发育时期芋球茎中支链淀粉含量分析.本研究结果显示靖江香沙芋中存在 个可溶性淀粉合成酶均具有类似的 结构域它们与腺苷二磷酸()葡萄糖结合催化合成淀粉而 中除了同样的 结构域以外还包含 个 结构域具有淀粉结合王 立等:芋可溶性淀粉合成酶 基因家族的克隆和表达分析特性可能与淀粉链长有关 前人研究发现氨基末端区域高度保守的 基序是可溶性淀粉合成的起始酶与糖原合成酶底物 葡萄糖结合可能对芋的短支链淀粉合成具有重要作用 可影响支链淀粉的分支合成改变淀粉粒的晶体层结构和淀粉糊化温度 中含有的六肽基序()与 蛋白结合位点基序相关 后者通过负调控拟南芥中可溶性淀粉合成酶活性进而影响拟南芥叶片中淀粉积累说明 与芋淀粉储藏密切相关.个芋可溶性淀粉合成酶基因与淀粉合成紧密相关 本研究结果表明、和 主要在芋球茎中表达但在芋的不同发育阶段 个基因表现出不同的表达模式 和 在未成熟的芋球茎中表达水平较高与马铃薯中的转录表达趋势相似即在种植 左右明显上调表达表明 和 更趋向于参与芋球茎中瞬时淀粉的合成 而 的转录上调时间相对较迟在种植 时上调速率最高在种植 的成熟球茎中表达水平最高与在香蕉中的表达模式基本一致说明 更倾向于参与贮藏淀粉的合成本研究发现在芋发育过程中芋球茎中支链淀粉含量持续增加在种植 达到较大值而且芋球茎中 基因表达量与芋球茎中支链淀粉含量呈正相关表明 与芋球茎中淀粉贮藏有关 该结果与在马铃薯上的研究结果类似马铃薯块茎中 活性占总 活性的 与贮藏淀粉的合成密切相关本研究结果表明芋可溶性淀粉合成酶基因家族的 个基因与球茎淀粉合成密切相关其中 和 参与芋球茎中瞬时淀粉的合成而 更倾向于参与贮藏淀粉的合成 今后需要对芋可溶性淀粉合成酶基因进行深入研究以明确和验证、和 基因功能参考文献:姚 姝张亚东路 凯等.水稻可溶性淀粉合成酶基因 和 的功能、等位变异及其互作研究进展.中国水稻科学():.李 丰.甘薯淀粉合成相关基因的克隆与分子标记开发.济南:山东大学.何虎翼唐洲萍杨 鑫等.马铃薯淀粉合成与降解研究进展.生物技术通报():.():.(.).:():.王 立殷剑美韩晓勇等.芋淀粉合成酶 基因的克隆及表达分析.园艺学报():.()().:.何 洁闫飞燕黄 芳等.双波长法测定薯芋类农产品中直链淀粉和支链淀粉的含量.食品工业科技():.马 岚李育先刘 颖等.谷子淀粉合成酶家族分析.分子植物育种():.():.():.苗红霞孙佩光刘菊华等.香蕉果实可溶性淀粉合成酶基因 的分子特征与时空表达模式.中国农学通报():.(责任编辑:陈海霞)江 苏 农 业 学 报 年 第 卷 第 期