芝堤山野生紫芝的分离纯化及驯化栽培.doc

项目编号

宁德师范学院服务海西建设项目

申 请 书

项 目 类 型：
一般项目
项 目 名 称：
闽东野生紫芝的分离纯化及驯化栽培
项目负责人：
陈锡雄
所在单位：
生物工程系
联系电话：
13515079989
电子邮箱：
chenxixiong@
申请日期：
2010.9.5

宁德师范学院
二○一○年九月
填 表 说 明

一、申请书各项内容要求实事求是，逐条认真填写，表达要明确、严谨，外来语同时用原文和中文表达。
二、申请书一式二份，采用A4幅面，于左侧装订成册。各栏空格不够时，请自行加页。封面上“项目编号”申请者不必填写。
三、简表的内容应严格按规定填写。凡选择性栏目，请在提示符A、B、C……上打“Ö”，其余栏目说明如下：
项目名称——要确切反映项目内容，字数最多不超过25个汉字（包括标点符号）。
所属学科——根据申请项目所属学科，严格按国家标准学科分类与代码（GB/T13745-92）填写。
起止年月——申请资助年限一般在五年以内。
所在单位名称——须按单位公章填写全称。

项 目 名 称
闽东野生紫芝的分离纯化及驯化栽培
项
目
类
别
所属行业
1．农业 2. 食药用菌
项
目
类
型
A.基础研究；
B.应用基础研究；
√C.应用研究（含社科、自然）；
D.试验发展；
E.新产品；
F.推广开发；
G.其它
所属学科
1．生物学 2.生物技术
起止年限
2010.9-2013.9
申请金额
3万元
项目
负责
人
姓 名
陈锡雄
性别
男
出生年月
1963.3
职 称
副教授
学历
本科
学位/授予国别
学士/中国
所在单位（院、系、所）
宁德师范学院生物工程系
主 要 合 作 单 位

项目组
人 员
总数
高级职称
中级职称
初级职称
辅助人员
5
3
1
1

一、本项目已具备的条件
灵芝是一种药用菌，灵芝多糖具有扶正固本、滋补强壮、延年益寿的主要功能，前期研究已分离得到多株闽东紫芝，提取基因组DNA，并对提取方法进行了适当的改进，得到电泳谱带清晰、整齐，可用于PCR扩增和指纹分析的基因组DNA模版。为进一步开展研究工作提供初步的基础。
实验室现有与本项目研究有关的主要仪器设备有：各型号多种高压锅、超净工作台、菌种室、栽培室、高速冷冻离心机、超低温冰箱、超纯水系统、PCR仪、电泳系统、凝胶成像系统、制冰机、紫外分光光度计等，为开展实验工作提供了很好的基础。

二、本项目对促进海峡西岸经济区建设及推动科技进步、产业结构调整和社会发展的重要意义
我国是灵芝的王国，世界上灵芝科的种类主要分布在亚洲、澳洲、非洲及美洲的热带及亚热带，少数分布于温带。我国地跨热带至寒温带，灵芝科种类多而分布广。现代医学已证实灵芝具有特殊的疗效。随着野生灵芝资源的过度开采，野生灵芝越来越少见，资源趋于枯竭。从野生种类中驯化优良生产菌种，或具有药效高的品种则潜力很大。

（一）符合海西产业政策与布局，有利于推动农村科技进步
本项目属于生物技术产业领域，生物技术是海西经济区建设的重点产业之一，其最大特点是可再生、无污染、良性循环、永续利用。利用生物技术在农村发展现代农林业，开发兼具生态功能的新型菌类产业，利用农业生产中产生的废弃物作为栽培基质，获得良好的经济效益、社会效益及生态效益，对推动农村科技进步具有积极的意义。
（二）增加农民收入，促进地方经济发展
在古代，我国劳动人民盛赞称灵芝为仙草，在《神农本草经》、《名医别录》及《本草纲目》等多种典籍中都把灵芝列为上品，谓紫芝“主耳聋，利关节，保神益精，坚筋骨，好颜色，久服轻身不老延年。”谓赤芝“主胸中结，益心气，补中增智慧不忘，久食轻身不老，延年成仙。”而现代医学也证明了灵芝的特有功效。目前，我国近年来开始大面积进行人工栽培生产，并逐渐向灵芝深加工产业发展，产值可达数亿元人民币，极具商品开发价值。因此，开展灵芝良种选育、高产栽培研究，发展灵芝栽培业有利于农民增产增收，促进地方社会经济的发展。
（三）有利于落实“三农”政策，促进新农村建设
“发展农业、建设农村、造福农民”的“三农”政策越来越受到各级政府的重视。立足古田县，辐射周边县市，发展灵芝产业，可大幅提升林地的经营效益，直接增加农民的就业，缓解环境保护和农民收入之间的矛盾，对项目区社会主义新农村建设将产生积极影响。
（四）促进食药用菌产业结构调整
项目的立项实施将为实现“高起点、规模化、良种化、标准化”建设灵芝人工栽培示范基地、推动新型食药用菌产业发展提供有力的支持。该项研究成果为灵芝优良品种的鉴定和引种提供技术参考，为这种新型经济植物种质资源的合理利用和驯化栽培提供理论依据，避免盲目引种及长期栽培导致的种质退化造成的资源浪费和经济损失。并可延长产业链，促进食药用菌产业的种类、结构、经营方式的调整和优化，促进经济增长方式的转变，促进农村经济的可持续发展，对项目区全面建设小康社会产生推动作用和影响。

三、项目内容
本项目构建研究开发平台与科技推广服务体系，开展灵芝良种选育和人工高效栽培关键技术研究与应用。
（一） 样品采集及分离纯化
1.选择春末或夏初季节，从支堤山系不同的区位采集灵芝品种，进行初步的分级处理并登记造册。
2. 然后按常规方法对所采集的样品进行分离纯化，将得到若干个灵芝品种，进行适当扩培并得到足够量的灵芝试管菌种以供后续实验使用。
（二）利用AFLP分子标记技术对灵芝样本进行种质鉴定
1. 高质量基因组DNA的提取
对CTAB分离灵芝基因组总DNA的方法进行了适当的改进，得到电泳谱带清晰、整齐，可用于酶切、PCR扩增和进行指纹图谱分析的基因组DNA模版。
2. 引物设计和合成
从已发表的文献中查询并合成AFLP预扩增引物和选择性扩增引物。
3. 酶切、连接及PCR反应体系的优化
为了摸索适宜于灵芝的AFLP反应体系，本实验拟通过以琼脂糖凝胶为检测体系，对影响酶切、连接及PCR扩增的Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物浓度以及退火温度等反应条件进行优化选择。
4. 引物筛选
根据设计好的引物对小量样本进行预试验，检验引物的有效性，选取扩增条带清晰、重现性高且多态性良好的多个引物组合。
5. 品系鉴定
利用筛选出的特异AFLP引物和反应条件，对供试样本进行试验，并对特异谱带和带组合进行分析，构建各样本的DNA指纹图谱，鉴定灵芝各样本，合并来源不同，但遗传组成上相同的各重复样本，以减小后续工作量。
6. 数据分析
电泳条带按1/0进行数据转换，清晰和再现性强的潜带记为1，无扩增谱带记为0，生成0和l组成的原始矩阵。以此为据，获得各样本的DNA指纹图谱。

（三） 进行驯化栽培实验
1.选择生长状态良好的菌株3～5个进行菌种的扩培，采用二级扩培方法，得到足够量的栽培用菌种。
2.拟定栽培路线，确定栽培方法，将不同菌株进行栽培对照，筛选出优良高产菌株。
四、工作进度安排
（一） 第一阶段
样品的采集、分离、纯化及扩培
1. 2010.10～2011.3完成相关资料的收集，拟定野外灵芝采集的路线图及确定野外采集样品的区域，并做好灵芝分离纯化前的准备工作。
2.2011.3～2011.6按既定路线图进行野外野生灵芝的采集，对样品进行初步分级处理并做好妥善处理。
3.2011.3～2011.9完成实验室灵芝样品的分离、纯化工作，并对各品系进行适当的扩大培养，以获得的一定量的试管原种。供后续实验使用。
（二） 第二阶段
利用AFLP分子标记技术对灵芝样本进行种质鉴定
1.2011.3～2011.6 AFLP反应体系的优化和引物筛选
2.2011.6～2011.11构建各样本的DNA指纹图谱
3.2011.11～2012.5确定试栽菌种并按常规方法进行供试菌株的一、二级菌种的生产，以供后续栽培实验。
（三） 第三阶段
驯化栽培实验
1. 2012.5～2012.9进行灵芝不同品种的定性栽培实验，并由此确定几个当家品种。
2. 2012.9～2013.3确定之当家品种进行一、二级菌种的生产。
3.2013.3～2013.9对供试品种的灵芝进行定量栽培实验，根据数理统计分析可得出 我们所需的灵芝品种。
五、经费预算（单位：万元）注：按项目类型，另附经费预算表
总 投 资
3万元
其 他
经费来源
合 计
其 中
其他部门拨款
单位配套
贷 款
其 他
0
0
0
0
0
六、项目组成员表（含主要合作单位参加人员）
姓 名
出生年月
性别
职称
职务
从事专业
在项目中分工
项目负责人
所在单位
签 章
陈锡雄
1963.3
男
副教授
教师
教学
项目支持人
生物工程系

丁建发
1967.2
男
副教授
教师
教学
资料收集整理及数据处理
生物工程系

张维瑞
1966.3
男
教授级高级农艺师
教师
食用菌
菌种分离、筛选及菌种生产
生物工程系

薛骏轶
1984.9
男
助理实验师
实验员
教学
灵芝种质资源分子鉴定
生物工程系

阮俊峰
1983.11
男
助理实验师
实验员
教学
灵芝的栽培生产
生物工程系

七、合作单位意见（对合作研究内容、参加人员素质与水平及提供的研究工作条件等签署具体意见）

　　　　　　 单位（公章）　　　　　

年 月 日

八、院（系）审查意见

课题组长期从事食用菌教学和科研，具有扎实的研究基础和前期研究工作，能完成该项目的研究工作。该项目建设有利于推动地方食用菌产业发展，提高农民收入，具有一定的社会效益和经济效益。同意该课题申报！

学校（公章）

2010年 10 月 8 日

九、学校审查意见

年 月 日

附：经费预算表

单位：（万元）
总投资
3.0
申请资助
合计
其中
2010年
2011年
2012年
2013年
2014年
3.0
0.8
0.8
1.4
-
-
其他经费来源
合计
其中
其他部门拨款
单位配套
贷 款
其 他

预算支出科目
总投资预算数
其中：
申请资助
总投资预算数计算依据
1、项目直接费
3.0
3.0

（1）人员费

（2）设备费

其中：购置

试制

（3）修缮费
0.1
0.1
仪器维护
（4）能源材料费
1.5
1.5
引物合成+TaqDNA聚合酶+内切酶+分离纯化试剂+电泳、染色试剂+其他药品培养基耗材
（5）试验外协费

（6）会议费
0.4
0.4
参加学术会议2×0.2
（7）差旅费
0.5
0.5
样品采集3×.05×3
（8）出版物、文献、信息传播、知识产权事务费
0.5
0.5
资料收集打印0.08＋文章版面费2×0.2＋相关书籍费0.02
（9）国际合作交流费

（10）其它直接费

2、项目间接费

（1）承担单位直接为项目服务的管理人员费和其它行政管理支出

（2）现有仪器设备和房屋的使用或折旧费

3、协作研究开发支出费

3.1 项目直接费

3.2 项目间接费

合 计
3.0
3.0

注：1、“经费支出预算”按《福建省科技三项费用管理办法》有关规定填报
2、“人员费”需说明累计全时工作时间