异甘草酸镁通过ERK通路影响大鼠肝细胞修复的研究_李斌.pdf

甘肃医药 2023 年 42 卷第 4 期Gansu Medical Journal，2023，Vol.42，No.4急性肝损伤（ALI）是影响人类健康的重要疾病，发生肝损伤后机体的一些反映肝功能的指标均发生异常，其中肝损伤的敏感指标包括谷丙转氨酶（glutamicpyruvic transaminase，GPT 又称 ALT）、谷草转氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase，GOT 又称 AST）以及机体的炎症性指标白介素-6（interleukin-6，IL-6）。目前临床上治疗 ALI 主要以抗炎保肝药物为主。异甘草酸镁（magnesium isoglycyrrhizinate，MGIG）因其显著的抗炎、抗氧化、保肝作用及不良反应少等优点，得到临床的广泛应用和认可，但其作用机制尚不清楚1，2。基于此，本研究将 ALI 大鼠作为研究对象，初步揭示异甘草酸镁通过抑制 ALI 大鼠肝组织中 ERK 和 p-ERK 的表达促进其修复的可能机制，为异甘草酸镁可修复 ALI 提供理论依据。1材料与方法1.1实验材料1.1.1实验动物。健康 Wistar 雌性大鼠 36 只，体重（20010）g，动物合格证编号：SYXK（军）2017-0047。1.1.2实验试剂。异甘草酸镁注射液（10mL：50g）购于江苏正大天晴药业股份有限公司；兔抗鼠 ERK1/2 单克隆抗体 SABC（鼠）试剂盒购于美国 Proteintech Group公司，由甘肃科美特生物科技有限公司代购；兔抗鼠p-ERK1/2 单克隆抗体购于 AmecicaCellSignalingTechnology 公司，由甘肃科美特生物科技有限公司代购；羊抗兔 IgG 购于上海经科化学科技有限公司。DAB 显色试剂盒购自上海生物制品有限公司。ELISA 试剂盒购于上海极威生物科技有限公司，CCl4（AR 级）和花生油（食用级）配置成 15%CCl4花生油溶液。1.2实验方法1.2.1建立 ALI 模型大鼠。随机选取 24 只 Wistar 大鼠，按 2mL/kg 体重给予 15%CCl4花生油溶液灌胃，1 次/日，共三天。1.2.2实验分组。将未处理的 12 只大鼠作为正常组，正常组不做特殊处理；将 24 例 ALI 模型大鼠随机分为两组，模型组大鼠按 20mL/kg 腹腔注射 0.9%氯化钠注射液，1 次/日，连续两周。治疗组大鼠按 20mL/kg 腹腔注射异甘草酸镁注射液，1 次/日，连续两周。1.2.3一般情况观察。在给药期间，每隔 4 天观察并记录各组大鼠的一般状况，包括进食、饮水、毛发变化、精神状态以及自主活动等。1.2.4ALT、AST、IL-6 的检测。两周后三组大鼠均以2mL/kg 水合氯醛溶液行腹腔麻醉，右心房穿刺取血，采血量 2.02.5mL，离心，取血清。按照 ELISA 试剂盒的操作步骤进行检测。1.2.5HE 染色进行病理形态学观察。处死大鼠取肝组织，将三组大鼠肝脏置于 4%多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋切片，HE 染色，并显微镜下观察各组肝组织的病理学变化。1.2.6免疫组化技术检测 ERK 及 p-ERK 的表达。取异甘草酸镁通过 ERK 通路影响大鼠肝细胞修复的研究李斌1，2何昱静2王俊科2卢利霞2李初谊2于晓辉21.甘肃中医药大学第一临床医学院，甘肃 兰州 730000；2.中国人民解放军联勤保障部队第九四医院，甘肃 兰州 730050【摘要】目的：探讨异甘草酸镁促进急性肝损伤大鼠肝细胞修复的作用，揭示其具体的分子机制。方法：36 只 Wistar 雌性大鼠随机选取 24 只，按 2mL/kg 体重给予 15%CCl4花生油溶液灌胃，1 次/日，共 3 天，构建急性肝损伤大鼠模型。然后进行实验分组，正常组为正常大鼠（12 只），不做特殊处理；模型组为急性肝损伤大鼠（12 只），给予 0.9%氯化钠注射液干预；治疗组（12 只）为急性肝损伤大鼠，按 30mL/kg 腹腔注射异甘草酸镁注射液，1 次/日，连续治疗两周。两周后用 ELISA 法检测各组大鼠外周血中 ALT、AST 和 IL-6 水平，肝组织 HE 染色并镜下观察各组肝组织形态学变化，免疫组化技术检测 ERK 及 p-ERK 蛋白水平，并对结果进行分析。结果：正常组肝细胞形态正常，肝板排列规则。模型组肝细胞均普遍肿胀，可见胞浆脂肪变性及肝细胞坏死。治疗组局部肝板排列欠规则，可见少量单核和淋巴细胞浸润，但整体细胞形态基本恢复。与正常组比较，模型组大鼠外周血 ALT、AST 和 IL-6 的水平及肝组织 ERK 和p-ERK 的表达增高（P0.05）；与模型组比较，治疗组大鼠外周血 ALT、AST 和 IL-6 的水平及肝组织 ERK 和 p-ERK 的表达均下降（P0.05）。结论：异甘草酸镁可以促进急性肝损伤大鼠肝细胞修复，其发挥作用可能与异甘草酸镁抑制 ERK 及 p-ERK 表达有关。【关键词】异甘草酸镁；ERK；p-ERK；急性肝损伤；肝细胞修复中图分类号：R575文献标志码：A文章编号：1004-2725（2023）04-0293-04基金项目：甘肃省卫生行业科研计划项目（编号：GSWSKY-2019-05）第一作者：李斌，男，硕士在读，消化系疾病的临床及基础研究方向通信作者：于晓辉，女，主任医师，从事消化系统疾病的临床和基础研究工作。E-mail：基础研究293DOI:10.15975/ki.gsyy.2023.04.001甘肃医药 2023 年 42 卷第 4 期Gansu Medical Journal，2023，Vol.42，No.4注：与正常组比较，*P0.05；与模型组比较#P0.05表 1异甘草酸镁注射液对大鼠 ALT、AST 及 IL-6 的影响各组石蜡切片，90烤箱 35 分钟，二甲苯、中脱蜡，不同浓度乙醇脱苯。EDTA 抗原修复后 PBS 冲洗，滴加 3%H2O2于 37恒温箱 10 分钟，灭活内源性酶。PBS 冲洗后滴加 5%BSA，37恒温箱 20 分钟封闭。滴加一抗（ERK，工作浓度 1 200；p-ERK，工作浓度 1 150），37恒温箱孵育 2 小时后 PBS 冲洗。滴加二抗（羊抗兔 IgG），37恒温箱孵育 30 分钟后 PBS 冲洗。滴加 SABC，37恒温箱孵育 30 分钟后 PBS 冲洗。DAB 工作液显色。蒸馏水洗后苏木素液复染。1%盐酸分化后置于不同浓度乙醇中脱水，晾干后树脂胶封片。最后采用免疫组化图像分析法进行结果判读。（1）阳性结果：棕黄色颗粒位于肝细胞胞浆、胞核者。（2）利用数码显微镜采集免疫组化图片，再启动显微图像分析系统，按设定程序操作，自动导出分析结果。1.2.7组织芯片的制作。选取空白蜡块 1 个，用铅笔以间距 3mm 标出 20 个点阵，并制作 54 纸质表格编号。首先将穿刺针针芯抽出 5mm 以上，再对准已标记阵点垂直均匀用力打孔。标记、取出所需的病变组织蜡块：将 HE 染色切片置于低倍显微镜下，找到并标出所需病变视野的位置，用穿刺针取出标记区域的组织，完毕后将组织柱移入已打好孔的空白蜡块。按编号顺序依次操作，空置最后一个点方便定位。最后，加热列阵蜡块使病变组织柱与周围石蜡完全融合。见图 1。1.3统计学分析应用 SPSS 26.0 和 GraphPad Software Prism 7.0 统计软件系统对实验数据进行统计分析。所有计量资料均符合正态分布性和方差齐性，以均数标准差（xs）表示，组间比较采用单因素 ANOVA分析，P0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1各组大鼠一般状况与正常组大鼠比较，急性肝损伤大鼠均出现不同程度的毛发散乱，活动量、饮食减少等状况，但治疗组大鼠逐渐活跃，皮毛光滑，活动、摄食量增加，均未出现死亡。2.2三组大鼠血清中 ALT、AST 及 IL-6 水平与正常组比较，模型组大鼠外周血 ALT、AST 和 IL-6 的水平增高（P0.05）；与模型组比较，治疗组大鼠外周血 ALT、AST 和 IL-6 的水平均下降（P0.05）。见表 1。2.3三组大鼠肝组织 HE 染色结果与正常组比较，模型组肝组织光镜下肝细胞肿胀、胞浆脂肪变性及肝细胞坏死明显。治疗组光镜下肝细胞基本恢复正常。见图 2。2.4三组大鼠肝组织 ERK 蛋白表达情况及图像分析结果显微镜下大鼠肝组织免疫组化图片提示：正常组肝细胞内未见 ERK 的表达，模型组可见肝细胞浆中大量 ERK 表达，治疗组 ERK 下降。见图 3，表 2。2.5三组大鼠肝组织 p-ERK 蛋白表达情况显微镜下大鼠肝组织免疫组化图片提示：正常组肝细胞内未见有 p-ERK 的表达，模型组可见肝细胞浆和肝细胞核中均有大量的 p-ERK 表达，治疗组 p-ERK 下降。见图4，表 3。3讨论ALI 在肝脏疾病中具有很高的发病率和死亡率3。肝脏结构和功能损伤可逐渐进展为多种肝病，如肝纤维化、肝硬化甚至肝癌4。肝损伤的发生机制涉及多种细胞因子、氧化应激、脂质过氧化产物、基因表达、信号通路（MAPK 通路）等，是一个多步骤、多因素的复杂变化过程5-10。MAPK 信号通路在炎症反应调节中的组别ALT（IU/L）AST（IU/L）IL-6（pg/mL）正常组31.0011.4533.508.3494.424.56模型组272.3336.87*312.1719.89*147.9416.63*治疗组49.504.09#50.336.16#96.428.25#注：a：肝组织芯片；b：肝组织 HE、ERK and p-ERK 芯片图 1组织芯片的制作ab注：a：正常组；b：模型组（黑色箭头：肝细胞肿胀，白色箭头：肝细胞坏死）；c：治疗组图 2三组大鼠肝组织病理形态学结果（HE 染色，200）bca294甘肃医药 2023 年 42 卷第 4 期Gansu Medical Journal，2023，Vol.42，No.4（下转第 300 页）注：与正常组比较，*P0.05；与模型组比较#P0.05表 3三组大鼠肝组织 p-ERK 表达结果组别平均灰度值阳性细胞百分比（%）正常组32.245.132.200.31模型组246.5810.63*43.542.28*治疗组82.463.18#10.211.94#注：a：正常组；b：模型组；c：治疗组图 4三组大鼠肝组织 p-ERK 蛋白表达（免疫组化染色，400）注：a：正常组；b：模型组；c：治疗组图 3三组大鼠肝组织 ERK 蛋白表达（免疫组化染色，400）表 2三组肝组织 ERK 表达情况注：与正常组比较，*P0.05；与模型组比较#P0.05组别平均灰度值阳性细胞百分比（%）正常组50.196.281.420.57模型组241.2412.63*53.762.46*治疗组75.482.37#8.331.05#作用使其成为抗炎治疗的潜在靶点。ERK 通路是MAPK 通路中重要的一条亚通路，其中 ERK 蛋白作为ERK 通路上的重要蛋白参与并调控肝细胞氧化应激、肝脏炎症及肝细胞凋亡等过程中的肝细胞信号转导、转化、分化、增殖及存活5，6。目前 ALI 的治疗是以药物为主，研究发现 MGIG可减轻由游离脂肪酸、奥沙利铂、阿霉素、甲氨蝶呤、雷公藤内酯醇、X 线放射性引起的肝损伤7，8。MGIG 是一种从甘草根中提取的新型分子化合物，具有很高的抗炎活性和保护肝细胞的作用9。此外，MGIG 不仅能减轻各种原因引起的肝损伤，还可降低因肝损伤进展为肝衰竭时所致肾功能不全等并发症的发生。例如它可通过下调 miR-193a 增加 WT1 来改善果糖诱导的大鼠肾功能不全，蛋白尿和足细胞损伤10。MGIG 发挥抗炎保肝作用的机制目前尚未完全明确，Wang W 等11研究发现，MGIG 可通过调节 p38 MAPK 信号通路减轻半乳糖胺/脂多糖诱导的大鼠 ALI，但是否可通过影响 ERK 及其磷酸化水平促进 ALI 修复的研究目前还未见报道。本实验所用大鼠 ALI 模型是由 CCl4诱导的，是一种经典的肝损伤化学模型，可出现超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶的降低12。本研究证明 MGIG 可通过调控 ERK 蛋白修复ALI 大鼠肝细胞，进一步发挥保护肝细胞的作用。本研究结果显示：模型组大鼠血清 ALT、AST 水平与正常组相比升高，IL-6 水平也升高；治疗组与模型组相比，大鼠血清 ALT、AST、IL-6 水平均降低，基本恢复正常，提示MGIG 可降低 ALI 大鼠体内转氨酶和 IL-6 水平，从而起到修复 ALI 大鼠肝细胞的目的。血清中转氨酶升高的程度可作为肝细胞受损的敏感性指标，肝细胞损伤后细胞膜的结构和功能发生异常改变，促使转氨酶由胞质释放入血13。另外，IL-6 是肝脏炎症水平和治疗后判断炎症恢复的重要指标14。研究发现15，MGIG 可抑制 CCl4诱导的肝纤维化所触发的下游促炎细胞因子水平的表达。此外，它可抑制氧化炎症反应，降低ALT、IL-1、TNF-、丙二醛（MDA）水平及升高细胞内SOD 水平，以减轻肝细胞缺氧-复氧损伤，改善肝细胞活性，维持肝细胞膜完整性，从而发挥保护肝细胞的作用16。另外MGIG 也是治疗药物性肝损伤患者有效且安全性高的治疗方法17。本研究中各组大鼠肝组织 HE 染色切片示：模型组肝细胞肿胀、胞浆脂肪变性及肝细胞坏死；治疗组肝细胞形态基本恢复正常。提示 MGIG 对 ALI 肝细胞具有修复作用。我们进一步研究了各组大鼠肝组织中ERK 和 p-ERK 的表达水平，结果发现与模型组相比，治疗组 ERK 及 p-ERK 表达水平均下调，表明 MGIG修复 ALI 大鼠肝细胞可能是通过下调 ERK 通路中ERK 及 p-ERK 的水平，进一步发挥抗炎保肝的作用。与文献报道抑制 ERK 通路的激活可减轻小鼠 ALI 严bcabca295甘肃医药 2023 年 42 卷第 4 期Gansu Medical Journal，2023，Vol.42，No.4（上接第 295 页）参考文献 1Zhao Z，Tang Z，Zhang W，et al.Magnesium isoglycyrrhizinate protectsagainst renal-ischemia-reperfusion injury in a rat model via anti-inflammation，anti-oxidation and antiapoptosis J.Mol Med Rep，2017，16（3）：3627-3633.2Yang Y Z，Liu Z H，Wang S C，et al.Magnesium isoglycyrrhizinate alleviates fructose-induced liver oxidative stress and inflammatory injurythrough suppressing NOXs J.Eur J Pharmacol，2020，883：173314.3Huang C，Yang Y，Li WX，et al.Hyperin attenuates inflammation by activating PPAR-in mice with acute liver injury（ALI）and LPS-inducedRAW2647 cells J.Int Immunopharmacol，2015，29（2）：440-447.4Torres L R，Santana F C，Torres-Leal F L，et al.Pequi（Caryocar brasilienseCamb）almond oil attenuates carbon tetrachloride-induced acute hepatic injury in rats：Antioxidant and antiinflammatory effects J.Food ChemToxicol，2016，97：205-216.5Tian J H，Liu W D，Zhang Z Y，et al.Influence of miR-520e-mediatedMAPK signalling pathway on HBV replication and regulation of 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