通管方对输卵管炎性不孕模型...se-1细胞焦亡通路的影响_刘梅.pdf

2023年2月第29卷第2期February.2023 Vol.29 No.2通管方对输卵管炎性不孕模型大鼠NLRP3/Caspase-1细胞焦亡通路的影响*刘梅1，谢星1，匡继林2（1.湖南中医药大学，湖南长沙410208；2.湖南省中医院，湖南长沙410005）摘要目的：探讨通管方对NLRP3/Caspase-1细胞焦亡通路的影响，为其治疗输卵管炎性不孕（SI）提供实验依据。方法：诱发SD雌性大鼠动情后，将含混合菌液的明胶海绵塞入大鼠子宫深处制备SI模型。100只大鼠随机分为通管方低剂量组、通管方中剂量组、通管方高剂量组、妇炎康胶囊组、空白组、假手术组和模型组。各药物组大鼠灌胃给予相应药物30 d后，肉眼观察输卵管外观形态及其与周围组织关系；HE染色评估输卵管病理学改变；ELISA检测血清IL-1、IL-18水平；Western blotting检测输卵管NLRP3、Caspase-1、IL-1、IL-18蛋白表达。结果：（1）肉眼观察可见模型组大鼠输卵管僵硬、扭曲，甚者折叠，有积脓、积液等，符合SI改变。空白组大鼠输卵管无异常改变，富有弹性。HE染色显示模型组大鼠输卵管管腔缩窄，管壁内凹增厚，纤毛减少、断裂，见大量炎症细胞浸润；空白组大鼠输卵管管壁光滑，细胞排列整齐，纤毛完整、数量众多，无炎症细胞浸润。模型组与空白组差异明显，说明造模基本成功。通管方灌胃后，输卵管纤毛数量增多，纤毛结构恢复，炎症细胞浸润减少。（2）通管方中、高剂量组可显著降低模型大鼠血清IL-1、IL-18水平（P0.05）。（3）通管方中、高剂量组可下调SI大鼠输卵管NLRP3、Caspase-1、IL-1和IL-18蛋白相对表达量，与模型组比较，差异均有统计学意义（P0.05）。结论：（1）诱发大鼠动情经阴道接种混合菌液法可成功制造SI模型，且致病机制与临床相近，值得推广。（2）通管方可减轻模型大鼠炎症反应，改善输卵管黏膜充血水肿，促进积水、积脓及系膜包裹性积液的吸收，改善输卵管外观形态，松解盆腔粘连，促进纤毛再生及功能恢复。（3）通管方可降低SI模型大鼠NLRP3、Caspase-1、IL-1、IL-18等因子的表达，其机制可能与抑制NLRP3/Caspase-1细胞焦亡通路活化相关。关键词输卵管炎性不孕；通管方；细胞焦亡；NLRP3；Caspase-1；大鼠中图分类号R285.5文献标识码A文章编号1672-951X（2023）02-0008-06DOI：10.13862/43-1446/r.2023.02.002Effect of Tongguan Fang(通管方)on the Pyroptosis Pathway ofNLRP3/Caspase-1 Cells in Rat Model of Tubal Inflammatory InfertilityLIU Mei1,XIE Xing1,KUANG Jilin2(1.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha Hunan 410208,China;2.Hunan Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine,Changsha Hunan 410005,China)AbstractObjective:To explore the effect of Tongguan Fang on the pyroptosis pathway of NLRP3/Caspase-1 cells,and provide experimental basis for its treatment of salpingitis infertility(SI).Methods:Afterinducing estrus in SD female rats,gelatin sponge containing mixed bacterial fluid was inserted into the deeputerus of rats to prepare SI model.100 rats were randomly divided into low,medium and high dose groups ofTongguan Fang,Fuyankang Capsules(妇炎康胶囊)group,blank group,sham operation group and model group.After intragastric administration of corresponding drugs to rats in each group for 30 days,the appearance offallopian tubes and their relationship with surrounding tissues were observed by visual observation.The pathologicalchanges of fallopian tubes were evaluated by HE staining.The levels of serum IL-1 and IL-18 were detectedby ELISA.Western blotting was used to detect the expression of NLRP3,Caspase-1,IL-1 and IL-18 protein引用：刘梅，谢星，匡继林.通管方对输卵管炎性不孕模型大鼠NLRP3/Caspase-1细胞焦亡通路的影响J.中医药导报,2023,29(2):8-13.*基金项目：湖南省中医药科研计划重点项目（202012）通信作者：匡继林，E-mail：82023年2月第29卷第2期February.2023 Vol.29 No.2据统计，我国不孕症的发病率为7%11%1，其中输卵管炎性不孕（salpingitis infertility，SI）约占40%2。西医主要治疗方法有子宫输卵管修复整形术、体外受精-胚胎移植（IVF-ET）术等。手术可松解盆腔组织粘连，解除输卵管梗阻与折叠，恢复输卵管大致走形，矫正输卵管伞端畸形等，但不能彻底治愈慢性炎症长期刺激导致的输卵管拾卵、输卵等功能性损伤，无法有效改善盆腔微循环，术后仍可出现不孕、异位妊娠等。IVF-ET术虽日益成熟，但费用高昂、副作用明显，非所有SI家庭适用。通管方是谢剑南教授的经验方，治疗SI的总有效率高达86.7%3，且中医协同治疗SI被越来越多医者认同及应用。本课题组前期研究证实，通管方可缓解患者慢性盆腔疼痛、提高术后自然妊娠率，改善SI模型大鼠输卵管炎症细胞浸润，促进纤毛功能恢复，降低模型大鼠相关炎症因子表达4-8，但具体机制仍不明确。各类危险信号因子均可激活细胞焦亡，引起强烈的炎症反应。本实验拟用SD大鼠制备SI模型，通过肉眼观察、病理学、细胞焦亡相关因子检测等方法评估通管方对SI模型大鼠的治疗作用及对NLRP3/Caspase-1细胞焦亡通路的影响，旨在为通管方治疗SI提供实验依据，为新药研发奠定基础。1材料1.1实验动物100只SPF级SD雌性大鼠，812周龄，体质量（21020）g，动物生产许可证号：SCXK（湘）2019-004，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。本实验由湖南中医药大学实验动物伦理委员会批准（批准号：LLBH-202104070001）。动物饲养于湖南中医药大学实验动物中心，温度（241），湿度40%60%，12 h/12 h暗/光循环，自由饮食饮水，实验严格按照 实验动物管理和使用指南9进行。1.2药物妇炎康胶囊（广西一力罗定制药有限公司，规格：0.5 g48粒，批号：210402G）。通管方的方药组成：穿山甲70 g，穿破石200g，当归100 g，丹参100 g，三七50 g，茺蔚子100 g，路路通100 g，王不留行100 g，香附100 g，赤芍100 g，薤白100 g，乳香50 g，没药50 g，泽兰100 g，党参100 g，白术100 g，炙甘草60 g。以上中药均购自湖南省中医院药剂科，并由药剂科主任鉴定为正品。中药洗净后置于锅中加15 800 mL蒸馏水，浸泡30 min后大火煮沸，保持沸腾2 h，用纱布过滤药渣，保存第一次过滤药液；往过滤后的药渣中再加94 800 mL蒸馏水，大火煮沸后保持沸腾1 h，过滤药渣及药液，两次过滤药液混合均匀后浓缩成相对密度为1.181.27的浸膏，4 冰箱密封保存，备用。1.3菌液金黄色葡萄球菌（菌种：186335，浓度：1108cfu/mL）和大肠杆菌（菌种：264133，浓度：1108cfu/mL）由湖南中医药大学易柳老师赠送；解脲支原体（菌种：0042115，浓度：1106cfu/mL）购于长沙兔子君生物科技有限责任公司。1.4试剂兽用苯甲酸雌二醇注射液（四川金科药业有限责任公司，批号：20210301）；血清IL-1（批号：CSB-E08055r）、IL-18（批号：CSB-E04610r）均购自武汉华美生物工程有限公司；Caspase-1（批号：22915-1-AP）、NLRP3（批号：19771-1-AP）、IL-1（批号：16806-1-AP）、IL-18（批号：10663-1-AP）均购自美国proteintech公司；水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司，批号：20210323）。1.5主要仪器H1650R型台式高速冷冻离心机（湖南湘仪in fallopian tubes.Results:(1)The visual observation showed that the fallopian tube of rats in the model groupwere stiff,twisted,even folded,with pus and fluid accumulation,which were consistent with the SI change.Thefallopian tubes of rats in the blank group had no abnormal changes and were elastic.HE staining showed thatthe tubal lumen of rats in the model group were narrowed,the inner concave of the tubal wall were thickened,thecilia were reduced and broken,and a large number of inflammatory cells were infiltrated.In the blank group,the fallopian tube wall were smooth,the cells were orderly arranged,the cilia were complete and numerous,andthere were no inflammatory cell infiltration.The difference between the model group and the blank group wasobvious,which indicated that the modeling was basically successful.After intragastric administration of TongguanFang,the number of cilia in the fallopian tube increased,the cilia structure recovered,and the infiltration of inflammatory cells decreased.(2)The middle and high dose groups of Tongguan Fang could significantly reduce the levelsof serum IL-1 and IL-18 in model rats(P0.05).(3)The middle and high dose groups of Tongguan Fangcould down-regulate the relative expression of NLRP3,Caspase-1,IL-1 and IL-18 protein in the fallopian tubesof SI rats,and the difference was statistically significant compared with the model group(P0.05).Conclusion:(1)The SI model can be successfully established by inducing estrus in rats through vaginal inoculation with mixedbacterial solution,and the pathogenesis is similar to clinical practice,which is worthy of promotion.(2)TongguanFang can reduce the inflammatory reaction of model rats,improve the congestion and edema of the fallopiantube mucosa,promote the absorption of hydrops,empyema and mesangial encapsulated effusion,improve theappearance of the fallopian tube,loosen the pelvic adhesion,and promote the regeneration of cilia and functionalrecovery.(3)Tongguan Fang can reduce the expression of NLRP3,Caspase-1,IL-1,IL-18 and other factorsin SI model rats,and its mechanism may be related to the inhibition of NLRP3/Caspase-1 cell pyroptosis pathwayactivation.Keywordssalpingitis infertility;Tongguan Fang;pyroptosis;NLRP3;Caspase-1;rat92023年2月第29卷第2期February.2023 Vol.29 No.2实验室仪器开发有限公司），ChemiScope6100型化学发光成像系统（上海勤翔科技有限公司）；BA210T型显微镜（Motic公司）；盖玻片、载玻片（海门远泰实验仪器厂，货号分别为DY89-1，AY89-2）。2实验方法2.1分组及造模100只大鼠适应性喂养后连续3 d注射雌二醇0.2 mL/（只 d）诱发动情，采用随机数字表法随机分为空白组、假手术组、模型组、妇炎康胶囊组、通管方低剂量组、通管方中剂量组、通管方高剂量组各14只，余下2只同法分别纳入通管方中、高剂量组各1只。除空白组和假手术组外，其余大鼠按经阴道接种混合菌液法造模。参照参考文献5并改良。造模方法：（1）采用“1.3”中脲支原体、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌（体积比为221）制备混合菌液。（2）将医用无菌明胶海绵剪成约0.5 cm0.5 cm大小，一半生理盐水浸泡，一半混合菌液浸泡，备用。（3）一手提住鼠尾使其保持半倒立位，另一手用眼科镊夹持含混合菌液的明胶海绵经阴道塞入大鼠宫腔深处，左右两边子宫各放1块，持续保持倒立姿态10 min，隔天1次，连续操作8次。同法将含生理盐水的明胶海绵塞入假手术组大鼠宫腔深处。2.2给药按体表面积折算灌胃剂量，妇炎康胶囊组大鼠灌胃给予妇炎康胶囊溶液0.81 g/（kg d）；通管方低、中、高剂量组大鼠灌胃给予通管方药液，剂量分别为7.11、14.22、28.44g/（kg d）；模型组、空白组和假手术组大鼠给予10mL/（kg d）蒸馏水灌胃，1次/d，连续灌胃30 d。2.3标本采集末次灌胃后禁食不禁水12 h，10%水合氯醛3 mL/kg麻醉，解剖暴露子宫、输卵管，拍照记录子宫、输卵管外形、色泽及与周围组织有无粘连等。腹主动脉采血后静置2 h，3 000 r/min离心15 min，取上层血清，-80 保存。取出子宫、输卵管，组织剪断分为左右两侧，左侧于4%多聚甲醛固定液固定保存，右侧于-80 保存备用。2.4观察指标2.4.1肉眼观察输卵管形态肉眼观察输卵管形态变化（有无充血肿胀、积水、化脓等），色泽，与盆腔是否粘连。2.4.2HE染色观察病理学改变左侧输卵管切片苏木精染液染色30 min，流水冲洗20 min，70%酒精分色，蒸馏水冲洗，0.5%伊红染液染色5min，酒精梯度（95%95%100%100%）脱水各2 min，二甲苯透明10 min2次，晾干，中性树胶封片，光镜观察输卵管病理改变，采集图像后保存。2.4.3ELISA检测血清IL-1、IL-18水平（1）室温平衡后配制试剂。（2）加样本100 L，摇匀，覆上板贴，37 孵育2 h，弃去液体，甩干，不洗涤。（3）再加IL-1（1:1 000）、IL-18（1:5 000）抗体100 L，覆上新板贴，37 孵育1 h，弃去孔内液体，甩干，洗板3次。（4）加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100 L，覆上新板贴，37 孵育1 h，弃去孔内液体，甩干，洗板5次。（5）加底物90 L，37 避光显色1530 min，再加终止液50 L，终止反应。（6）反应终止5 min，酶标仪在450 nm波长依序测量各孔OD值。2.4.4Western blotting法检测输卵管NLRP3、Caspase-1、IL-1、IL-18蛋白表达每组取10只大鼠的右侧输卵管250 mg，加RIPA裂解液，收集总蛋白提取液，BCA蛋白定量取200 L电泳、转模，Caspase-1（11 000）、IL-1（11 000）、IL-18（15000）、NLRP3（1500）、-actin（15 000），一抗4 摇床孵育过夜，PBST漂洗后加入二抗，室温孵育90 min，PBST漂洗后显色，ECL研色，凝胶成像系统成像，GAPDH为内参蛋白，以目的蛋白与内参蛋白灰度值之比定量分析蛋白相对表达量。2.5统计学方法采用SPSS 28.0软件整理数据，计量资料以（xs）表示，多组比较采用One-Way ANOVA检验，并用LSD行组间两两比较。P0.05为差异有统计学意义。3结果3.1输卵管形态观察空白组大鼠输卵管无扭曲、肿胀，管壁光滑，表面红润富有光泽，无充血，质地柔软，富有弹性，与周围组织无粘连，无输卵管积水及积脓情况。假手术组大鼠输卵管较空白组稍增粗，管壁稍毛糙，表面红润有光泽，无充血，质地柔软，组织弹性好。模型组大鼠输卵管肿胀、扭曲，两侧输卵管粗细不一，表面苍白无光泽，走形僵硬，质地脆，与周围组织致密粘连，部分见有系膜囊肿、积水、积脓等情况。妇炎康胶囊组大鼠输卵管增粗、扭曲，表面呈淡粉色，少光泽，走形较僵硬，质地稍脆，部分与周围组织粘连，部分见有积水，无积脓。通管方低剂量组大鼠输卵管增粗，部分扭曲，输卵管表面较苍白，少光泽，走形较僵硬，弹性较差，部分与周围组织粘连，部分有积水，无积脓。通管方中剂量组大鼠输卵管稍增粗、扭曲，表面淡粉色，有光泽，质地较柔软，弹性可，与周围组织少许膜性粘连，部分轻度积水，无积脓。通管方高剂量组大鼠输卵管有增粗、扭曲，色泽稍红润，少光泽，质地较柔软，弹性一般，部分与周围组织粘连，少许积水，无积脓。（见图1）注：A.空白组；B.模型组；C.假手术组；D.妇炎康胶囊组；E.通管方低剂量组；F.通管方中剂量组；G.通管方高剂量组图 1各组大鼠子宫、输卵管肉眼观察图片3.2各组大鼠输卵管病理学改变空白组大鼠输卵管管径正常，管腔结构清晰，纤毛数量多，各类细胞排列整齐边界清楚，无炎症细胞浸润。模型组大鼠输卵管管径明显缩窄，甚至完全阻塞，各类细胞结构排列紊乱，分界不清，纤毛破坏严重，甚至断裂，数量极少，可见大量炎症细胞。假手术组大鼠输卵管管腔较空白组稍微缩窄，管腔结构基本清晰，纤毛数量多，可见少量炎症细胞浸润。妇炎康胶囊组大鼠输卵管管腔明显缩窄，但未完全阻塞，留有一定的空间，管腔欠通畅，管壁增厚，细胞结构尚明晰，排列较整齐，纤毛变短数量相对减少，有炎症细胞浸润。通管方低剂量组大鼠病理学表现与妇102023年2月第29卷第2期February.2023 Vol.29 No.2炎康胶囊组大致相同，输卵管管腔缩窄，细胞结构尚清晰，纤毛缩短数量减少，有炎症细胞浸润。通管方中剂量组大鼠输卵管管腔无明显缩窄，细胞结构明晰，纤毛未见缩短，纤毛数量多，未见明显粘连及炎症细胞浸润。通管方高剂量组大鼠输卵管管腔基本正常，管腔通畅，纤毛数量较多，结构明晰，部分有粘连，可见少量炎症细胞浸润。（见图2）注：A.空白组；B.模型组；C.假手术组；D.妇炎康胶囊组；E.通管方低剂量组；F.通管方中剂量组；G.通管方高剂量组图 2各组大鼠输卵管病理切片图（HE，100）3.3各组大鼠血清IL-1、IL-18水平比较假手术组和空白组大鼠血清IL-1、IL-18均呈现极少量表达；模型组大鼠血清IL-1、IL-18水平明显高于空白组（P0.01）；灌胃30 d后，通管方低剂量组大鼠血清IL-1、IL-18水平与模型组比较，差异无统计学意义（P0.05）；通管方中、高剂量组和妇炎康胶囊组大鼠血清IL-1、IL-18水平明显低于模型组（P0.05），且以通管方中、高剂量组下降更明显。（见表1）表1各组大鼠血清IL-1、IL-18水平比较（xs，ng/mL）组别动物数(只)给药剂量IL-1IL-18空白组10-0.2070.064b0.1830.041b假手术组10-0.2340.027b0.2250.032b模型组10-9.7800.415a9.8030.447a妇炎康胶囊组100.81 g/(kg d)9.1630.370ab8.9710.552ab通管方低剂量组107.11 g/(kg d)10.1480.347a9.7550.322a通管方中剂量组1014.22 g/(kg d)5.5030.399ac2.5800.460ac通管方高剂量组1028.44 g/(kg d)2.5470.162ac6.7040.824acF2 725.593891.610P0.0000.000注：取样时各组大鼠存活1215只不等，故每组随机取10只进行检测。与空白组比较，aP0.01；与模型组比较，bP0.05，cP0.013.4各组大鼠输卵管NLRP3、Caspase-1、IL-1、IL-18蛋白相对表达量比较与空白组比较，模型组大鼠输卵管NLRP3、Caspase-1、IL-1、IL-18蛋白相对表达量明显升高（P0.01）；通管方低剂量组大鼠输卵管NLRP3蛋白相对表达量与模型组比较，差异无统计学意义（P0.05）；妇炎康胶囊组和通管方中、高剂量组大鼠输卵管NLRP3蛋白相对表达量明显低于模型组，差异均有统计学意义（P0.05）。通管方低剂量组大鼠输卵管Caspase-1蛋白相对表达量与模型组比较，差异无统计学意义（P0.05）；妇炎康胶囊组输卵管Caspase-1蛋白相对表达量明显低于模型组（P0.05）。通管方中、高剂量组大鼠输卵管Caspase-1蛋白相对表达量明显低于模型组（P0.01）。通管方低剂量组IL-1蛋白相对表达量与模型组比较，差异无统计学意义（P0.05）；妇炎康胶囊组和通管方中、高剂量组大鼠输卵管IL-1蛋白相对表达量明显低于模型组（P0.01）。与模型组比较，妇炎康胶囊组输卵管IL-18相对表达量明显降低（P0.05）；通管方低剂量组大鼠输卵管IL-18蛋白相对表达量与模型组比较，差异无统计学意义（P0.05）；通管方中、高剂量组大鼠输卵管IL-18蛋白相对表达量明显低于模型组（P0.01）。（见图34）图 3各组大鼠输卵管 NLRP3、Caspase-1、IL-1、IL-18 蛋白表达 Western blotting 图注：每组取10只大鼠检测。A.空白组；B.模型组；C.假手术组；D.妇炎康胶囊组；E.通管方低剂量组；F.通管方中剂量组；G.通管方高剂量组图 4各组大鼠输卵管 NLRP3、Caspase-1、IL-1、IL-18 蛋白相对表达量比较（xs，n=10）4讨论中医学无SI的具体记载，根据其临床表现可归为“断绪”“癥瘕”“全不产”等范畴。主要病机是胞脉瘀阻，冲任受损。医家大多以“活血化瘀通络法”为治疗SI总方针10，以活血化瘀通络类药物为主导，同时兼顾其他因素及患者个人体质特点灵活加减。正如 医学真传 言：“夫通则不痛，理也，但通之之法，各有不同。调气以和血，调血以和气，通也；下逆者使之上行，中结者使之旁达，亦通也。虚者，助之使通，寒者，温之使通，无非通之之法也。”通管方是谢剑南教授经验方，课题组前期研究6-8,11证实宫腔镜术后、腹腔镜术后口服通管方ABCDFFG22 kDa30-35 kDa35 kDa110 kDa42 kDa112023年2月第29卷第2期February.2023 Vol.29 No.2可降低炎症因子表达，改善子宫动脉血流，提高自然妊娠率。方中穿破石祛风利湿，活血通经；穿山甲活血消癥，消痈排脓，两者共奏活血化瘀、温经止痛之功，同为君药。当归补血活血、调经止痛，有“妇科圣药”“十方九归”之美名，景岳全书 载“阴中阳虚者，当归能养血，乃不可少；若血滞而为痢者，正所当用。其要在动、滑两字。若妇人经期血滞，临产催生，及产后儿枕作痛，俱当以此为君。”丹参活血祛瘀、凉血消痈，归心、心包、肝经，又可养血安神。三七，为散瘀止血定痛要药，本草纲目 草部第十二卷言：“大抵药气温、味甘微苦，乃阳明、厥阴血分之药，故能治一切血病，与骐竭、紫矿相同。”本草纲目草部第八卷 云茺蔚子“治风解热，顺气活血，养肝益心，安魂定魄，调女人经脉，崩中带下，产后胎前诸病。久服令人有子。”三者同为臣药，助君药活血补血，散瘀止痛。香附、赤芍、王不留行、薤白、乳香、没药、泽兰、路路通、党参、白术共为佐药，加强君臣化瘀通络之功，同时有清热凉血、疏肝理气、健脾利湿之效。甘草调和诸药、缓急止痛，为使药。全方共奏活血化瘀，通经活络之效，使壅塞闭阻之瘀血消散，冲任、胞宫通畅，气机调达，则瘀可解之，郁可畅之，痛可消之，瘀祛而生新，促进输卵管形态功能恢复。药理研究显示，穿山甲12、穿破石13均可抑制炎症反应。三七总苷14可降低GSDMD、Caspase-1蛋白水平，抑制IL-1、IL-18的释放，且与抑制OGD/R诱导的细胞焦亡通路有关。当归15、丹参16可抑制TNF-和IL-1等炎症介质的释放。香附17可抗炎抑菌、镇痛，改善子宫内膜容受性。路路通18石油醚提取物可抑制NLRP3炎性小体的活化，降低Caspase-1、NLRP3、IL-1的表达；王不留行19醇提物能下调TNF-、IL-6及IL-1的mRNA转录水平及蛋白表达，改善炎症反应。赤芍20可稳定机体微循环、抗内毒素、保肝、抗炎、抗病毒等。泽兰21-22可抗凝血、活血化瘀、抑制血管炎症、改善免疫力等，有效抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等致病菌活性。由上我们推测，通管方治疗SI的机制可能与NLRP3/Caspase-1细胞焦亡通路相关。SI的发病率逐年攀升，主要与生殖道致病菌感染相关。感染致病菌可引起机体相应的免疫应答。危险信号分子与LRR结合后可激活NLRP3发生重构，使NLRP3的N端PYD与ASC结合，同时ASC的C端与pro-Caspase-1结合，并形成有活性的NLPR3炎性小体23，切割pro-Caspase-1形成活化的Caspase-1。Caspase-1可诱导pro-IL-1、pro-IL-18形成成熟的IL-1、IL-18，同时GSDMD蛋白在细胞膜上打孔。IL-1、IL-18等炎症因子经此孔释放，进而扩大机体炎症反应，引起细胞死亡，摧毁危险因子生存繁殖环境，从而达到保护机体的作用24。NLRP3是目前研究最深入的炎性小体，可被大多数危险信号分子激活并诱发细胞焦亡，如病毒、细菌、紫外线等25-27。近年研究发现，NLRP3/Caspase-1细胞焦亡通路在妇科疾病中有重要意义。邹学红等28发现金刚藤颗粒可下调急性盆腔炎模型大鼠NLRP3炎症小体信号通路相关因子的表达，结果显示模型组大鼠NLRP3、Caspase-1、IL-1的表达均显著高于对照组，金刚藤颗粒灌胃治疗后上述因子表达均显著降低。史昭29通过临床观察得出，盆腔炎性疾病反复发作可能与IL-18的低表达有关，观察组患者IL-18表达水平显著低于对照组。对照组NLRP3 mRNA转录水平与IL-1、Caspase-1、IL-1均呈显著正相关，但观察组各指标间无明显相关性。龙熙翠等30研究发现子宫内膜息肉组织中Caspase-1和IL-18的表达高于正常增生期子宫内膜组织。本研究发现，诱发大鼠动情经阴道接种混合菌液造模后，大鼠输卵管充血增粗、变形、梗阻，甚至完全阻塞，与周围组织致密粘连。HE染色见炎症细胞浸润，组织结构紊乱。血清IL-1、IL-18水平及输卵管组织Caspase-1、NLRP3、IL-1、IL-18蛋白相对表达量显著升高，说明输卵管炎的发病与NLRP3/Caspase-1细胞焦亡通路活化相关，此法可成功制备SI模型。灌胃后，通管方中、高剂量组大鼠输卵管炎症细胞浸润明显减少，纤毛数量明显增多，输卵管形态明显改善，血清IL-1、IL-18水平显著降低（P0.05），NLRP3、Caspase-1、IL-1、IL-18蛋白表达亦显著下降（P0.05），且通管方中剂量组下降幅度最大，提示通管方可抑制NLRP3炎性小体激活，降低Caspase-1表达，下调NLRP3/Caspase-1细胞焦亡通路下游因子IL-1、IL-18的表达，阻止炎症反应进一步扩大，促进炎症渗出吸收、纤毛功能恢复、数量增加，改善输卵管外观形态，从而治疗SI。实验过程中观察发现，通管方高剂量组药物底部常有药物溶解不充分、沉积在管底等现象，由此，我们推测药物的充分溶解对药物的治疗效果有一定的影响。通管方低剂量组无明显治疗作用，提示有效的药物浓度对SI的治疗影响较大。通管方中剂量组药物溶解充分，药物浓度合适，因而治疗效果最佳。综上所述，通管方治疗SI的机制与NLRP3/Caspase-1细胞焦亡通路密切相关。通管方广泛应用于SI的治疗，且未出现毒副作用明显案例，疗效显著，安全性可靠，值得推广应用。本研究的不足之处有：（1）本课题只从动物实验水平来探讨通管方对NLRP3/Caspase-1细胞焦亡信号通路的影响，检测了Caspase-1、NLRP3、IL-1、IL-18等相关因子的表达，未结合细胞的离体和电镜技术进行进一步验证，后期可结合细胞实验和电镜技术进一步研究。（2）通管方未进行中药指纹图谱的鉴定，且中药浸膏存在溶解不完全的现象，当保存方法不当时，易出现发霉变质等情况，影响实验结果，后期研究或可采用通管方冻干粉。（3）根据文献调研及前期实验基础，本研究未检测大鼠妊娠情况，后期研究或可加入大鼠妊娠率这一指标，使实验结果更具说服力。（4）通管方低剂量组大鼠血清IL-1、IL-18水平明显高于模型组，可能与用灌胃针损伤食管、口腔等有关，后期实验灌胃时可使用软管灌胃及选择灌胃熟练者操作，提高实验数据的可靠性。参考文献1 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levelJ.Inflammation，2016，39(5)：1764-1770.（收稿日期：2022-07-19编辑：刘颖）不孕症30例疗效观察J.湖南中医杂志，2013，29(9)：12-15.4 覃君玲，匡继林，刘奇英，等.通管方对输卵管炎性阻塞性不孕大鼠模型血清IL-1、TNF-含量的影响J.上海中医药杂志，2012，46(4)：69-72.5 徐佳.通管方对SOI模型大鼠输卵管组织TGF-1、Smad3及CTGF蛋白表达的影响D.长沙：湖南中医药大学，2017.6 徐佳，匡继林，黄高艳.宫、腹腔镜术配合中药三联疗法治疗输卵管性不孕症42例总结J.湖南中医杂志，2017，33(9)：76-78.7 邱志远.通管丸含药血清对巨噬细胞炎症模型TLR2、MyD88、NF-B基因表达的影响D.长沙：湖南中医药大学，2019.8 黄紫纯，匡继林，朱维昊.通管方治疗宫腹腔镜术后输卵管性不孕患者的疗效及其对炎症因子、子宫动脉血流的影响J.湖南中医药大学学报，2020，40(12)：1539-1543.9 贺争鸣，李根平，朱德生.实验动物管理与使用指南M.北京：科学出版社，2016.10 刘玲，邵良，张伶俐，等.活血化瘀通络法对输卵管炎性不孕大鼠TLR4/MyD88/NF-B信号通路的影响J.中华中医药杂志，2022，37(3)：1652-1655.11 王带林.通管丸对巨噬细胞炎症模型中PPAR-、TRAF-6蛋白的影响D.长沙：湖南中医药大学，2020.12 吴珊.穿山甲鳞甲乙醇提取物镇痛抗炎作用及其机制的实验研究D.南宁：广西医科大学，2012.13 史彦飞，谭枚秀，徐佳，等.穿破石对SOI模型大鼠