人绒促性素单克隆抗体的制备与分离纯化.pdf

性分析实验表明,Citrostatin同时具有杀伤肿瘤细胞的功能,证明了Citrostatin同时具有抑制肿瘤新生血管的形成和直接杀伤肿瘤的双重活性。但与等摩尔浓度的T8、citropin1.18比较,在细胞和血管水平,抑制效果无明显差异,与化学合成的Citrostatin相比,抗肿瘤活性也无明显差别5。Citrostatin具有位于C端的citropin1.18序列,其带正电荷的极性氨基酸可与肿瘤细胞膜表层带负电荷的磷脂产生静电引力作用,使Citrostatin聚集于肿瘤细胞附近,而新生肿瘤组织的血管丰富,内皮细胞数量较多,Citrostatin的浓度增加可增强对内皮细胞的抑制作用。尽管细胞和血管水平只反映了Citro2statin具有双功能的抗肿瘤活性,但真正有意义的工作须在活体水平证明Citrostatin与单独使用cit2ropin1.18、T8相比,具有明显抑制肿瘤生长的优势,或者通过酰胺化增加Citrostatin的活性,达到更好的抑制肿瘤生长的目的,这有待下一步的研究证实。参考文献:1OReilly M S,Boehm T,Shing Y,et al.Endostatin:an endogenous in2hibitor of angiogenesis and tumor growth J.Cell,1997,88:2772285.2Doyle J,Brinkworth C S,Wegener KL,et al.nNOS inhibition,antimi2crobial and anticancer activityof the amphibian skin peptide,citropin1.1 and synthetic modification J.Eur J Biochem,2003,270:114121153.3Wegener KL,Wabnitz P A,Carver J A,et al.Host defence peptidesfrom the skin glands of the Australian blue mountains tree2frogLitoriacitropa.Solution structure of the antibacterial peptide citripin 1.1 J.Eur J Biochem,1999,265:6272637.4Maeshima Y,Sudhakar A,Lively J C,et al.Tumstatin,an endothelialcell2Specific inhibitor of protein synthesisJ.Science,2002,295:1402143.5 马丽,杨生生,杨志峰,等.Citrostatin的构建与活性分析J.第二军医大学学报,2006(11):124921253.人绒促性素单克隆抗体的制备与分离纯化沈 泓1,易 喻1,梅建凤1,朱克寅2,李 敏1,应国清1(1.浙江工业大学 药学院,浙江 杭州310014;2.杭州博林生物技术有限公司,浙江 杭州310018)摘 要:目的 制备人绒促性素(hCG)单克隆抗体。方法hCG抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按51融合,间接ELISA法筛选阳性孔,有限稀释法进行克隆化培养;制备腹水抗体;间接ELISA法测定抗体效价;采用HiTrap rProtein A FF亲和色谱柱纯化抗体。结果 得到2株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,细胞培养上清中抗体效价达10-3以上,腹水抗体效价达10-7以上,纯化后的单抗纯度达98%以上,回收率达75%。结论 成功获得两株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞,可用于早孕、肿瘤等诊断的研究。关键词:人绒促性素;单克隆抗体;杂交瘤细胞 中图分类号:Q57;Q813 文献标识码:A 文章编号:100521678(2010)0120022204Preparation and purification of monoclonal antibodies against humanchorionic gonadotrophinSHEN Hong1,YI Yu1,MEIJian2feng1,ZHU Ke2yin2,LI Min1,YING Guo2qing1(1.School of Pharmaceutical Science,Zhejiang University of Technology,Hangzhou310014,China;2.BIOLINK Biopharm,Co.,Ltd.,Hangzhou310018,China)收稿日期:2009209208基金项目:浙江省科技厅项目(2009c33089)作者简介:沈泓(19832),女,浙江杭州人,硕士研究生,研究方向为单克隆抗体的制备、分离纯化和应用研究;应国清,通信作者,bio2ph 。22中国生化药物杂志Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics 2010年第31卷第1期Abstract:Purpose T o prepare monoclonal antibody against hCG.Methods Balb/c mice were immunizedwith hCG,and spleen cells from the mice were fused with myeloma cells SP2/0 at ratio of 51.Positive cloneswere screened by indirect enzyme2linked2immunoadsorbent assay(ELISA),then the clones were subcloned bylimiting dilution and amplified further.After intraperitoneal injection of hybridoma cells,mouse ascites antibodywas prepared.Titres and specificity of the ascites antibody were identified and determined by indirect ELISA.The ascites were purified by protein A affinity chromatography.Results Two strains of hybridoma cell lines ob2tained could secrete MAb stably.The titre of MAb of cell culture supernate is more than 10-3,and the titre ofprepared ascites MAb is more than 10-7.The purity of the obtained monoclonal antibody was more than 98%and recovery reached 75%after purification.Conclusion The obtained two strains of hybridoma cell lines cansecrete MAb stably.The monoclonal antibodies can be used in the research of early pregnancy and tumor diag2nosis.Key words:human chorionic gonadotrophin;monoclonal antibody;hybridoma cell lines 人绒促性素(human chorionic gonadotrophin,hCG)是人类受孕后胎盘合体滋养层细胞分泌的一种糖蛋白激素。在妊娠早期hCG的浓度迅速增高,检测尿中的hCG即可证实妊娠1。有许多研究表明,在滋养层细胞肿瘤和非滋养层细胞肿瘤病人的血和尿中有游离的hCG的亚基存在2。因此,研制高纯度的hCG单克隆抗体对早孕、癌症的检测有重要的意义。传统的用得最多的纯化方法为盐析2辛酸沉淀法、疏水色谱3、离子交换4等。这些方法操作复杂,步骤繁琐,纯化效率不高,产率和纯度都很低。蛋白A亲和色谱是纯化抗体的一种重要的方法。A蛋白来源于金黄色葡萄球菌,有5个位点能够与IgG的Fc段结合,一个偶联在凝胶上的A蛋白分子至少能结合2个IgG分子。重组A蛋白可通过C端的半胱氨酸残基与琼脂糖凝胶单点偶合,增加了重组A蛋白与琼脂糖凝的结合量,因此大大提高了重组A蛋白2琼脂糖凝胶与抗体蛋白的结合能力526。这一特点使之非常适合用于纯化腹水中的单克隆抗体。但目前尚未见利用蛋白A亲和色谱方法纯化hCG单克隆抗体的报道。本研究以纯化的hCG为免疫原,利用经典的淋巴细胞融合技术,建立了稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并对得到的单克隆抗体进行了纯化和鉴定,以期为后续的早孕、肿瘤相关研究提供实验基础。1 材 料1.1 动物、细胞株BALB/c小鼠,浙江省动物实验中心,许可证:SCXK(浙200320001);F1小鼠,浙江中医药大学动物实验中心,许可证:SCXK(沪200720005);SP2/0骨髓瘤细胞,华安生物技术有限公司。1.2 仪器层流超净台SCV24A1,Streamline Laboratory Prod2ucts;三目倒置相差显微镜ELWD0.3T12SNCP,Nikon;二氧化碳恒温培养箱3111,Thermo Electron Corpora2tion;HiTrap rProtein A FF色谱柱(5 mL)、AKTA purifi2er,GE Healthcare。1.3 试剂hCG(5 000 U/mg),ProSpec公司;HAT培养液,华安生物技术有限公司;PEG(相对分子质量5 000),Sigma公司;胎牛血清(BSA),民海生物工程有限公司;RPMI 1640培养液,吉诺生物医药技术有限公司;羊抗小鼠IgG2HRP,博士德生物工程有限公司。2 方 法2.1 免疫动物取8周龄的BALB/c小鼠,用hCG抗原皮下多点免疫,每次免疫量为100g/只,第1次免疫与等量的弗氏完全佐剂充分乳化,第2,3次免疫与等量的弗氏不完全佐剂充分乳化,每次间隔7 d,融合前3 d腹腔直接注射抗原100g加强免疫。2.2 细胞融合将小鼠处死,无菌摘取脾脏,研磨制取脾B淋巴细胞悬液,洗涤调整细胞浓度为11075107/mL备用。将免疫脾B淋巴细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞按51混合后离心弃上清,缓慢加入50%PEG溶液1 mL,间隔1 min后,缓慢滴入无血清培养液,终止融合剂的作用,经洗涤去除融合剂后加入所需量的细胞培养液,分种于96孔培养板孔内,每孔100L。2.3 杂交瘤细胞的筛选在接种96孔培养板时,每孔加入HAT培养液100L,23 d换液1/2,经过2周的培养后,骨髓瘤细胞与B淋巴细胞的杂交瘤细胞即被选择培养出,32中国生化药物杂志Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics 2010年第31卷第1期然后进行单克隆化。克隆化方法用有限稀释法,按实验室常规方法进行,一般克隆化34次,直至克隆细胞生长的各个孔检测100%抗体阳性为止。2.4 单克隆抗体的制备及其性质的鉴定体内诱生法制备腹水,按实验室常规方法进行。间接ELISA测抗体效价。将hCG抗原1.25 U/孔包被酶标板,设置空白对照孔,37 包被过夜;PBS2T(含有吐温20的磷酸盐缓冲液)浸洗3次,每孔加入封闭液(含1%BSA的PBS2T)200L,37 孵育2 h;PBS2T浸洗3次,每孔加入200L待测样,以封闭液梯度稀释(10-110-8),37 孵育1 h;PBS2T浸洗3次,每孔加入用封闭液按13 000稀释的羊抗小鼠IgG2HRP 100L,37 孵育1 h;PBS2T浸洗3次,双蒸水浸洗3次,每孔加入邻苯二胺底物溶液100L,置暗处反应5 min,阳性孔变为棕黄色,每孔加入2mol/L H2SO4溶液100L终止反应。2.5 抗体的纯化选择HiTrap rProtein A FF 5 mL预装色谱柱纯化抗体。取适量腹水,10 000 r/min离心15 min,取上清,经过0.22m微孔滤膜过滤后,用20 mmol/L磷酸缓冲液上样,用0.1 mol/L柠檬酸缓冲液洗脱。考察选择上样缓冲液的pH值和离子强度、洗脱缓冲液的pH值,控制样品流速。SDS2PAGE法 鉴 定 单 抗 纯 度。分 离 胶 浓 度12%,浓缩胶浓度4%,还原状态下处理样品,电泳后以考马斯亮蓝R250染色,然后经凝胶成像仪扫描鉴定纯度。3 结 果3.1hCG杂交瘤细胞株的建立3.1.1 小鼠血清抗体效价检测 hCG抗原免疫的BALB/c小鼠共6只,眼眶取血检测效价(表1)。6只小鼠的血清抗体效价都达到了10-7以上,免疫效果较好,可进行细胞融合。表1 免疫小鼠血清抗体效价Tab.1Antibody titers in the sera of the mice immunized with hCG小鼠编号效价10-110-210-310-410-510-610-710-81+-2+-3+-4+-5+-6+-3.1.2 杂交瘤细胞株的建立 细胞融合后铺3块96孔板,经HAT培养液筛选后,测出7个阳性孔,取上清效价最高(10-3)的两孔细胞株(1C1,2G12)单克隆化4次。从表2看出,第24次单克隆时,2株细胞的阳性率均为100%。杂交瘤细胞株经15周的培养后依旧能稳定分泌单克隆抗体。经液氮冻存复苏后仍能稳定分泌抗hCG抗体。表22株杂交瘤细胞株单克隆化实验结果Tab.2Result of hybridoma cell cloning of 2 hybridoma cells细胞株克隆次数有生长孔阳性孔阳性率1C11676089.6%24040100%35151100%45252100%2G121625690.3%23434100%34040100%45959100%3.2 单克隆抗体的制备及其性质的鉴定3.2.1 杂交瘤细胞上清蛋白含量及抗体效价的检测 细胞上清抗体效价达到了10-3以上(表3)。3.2.2 腹水蛋白含量及抗体效价的检测 2株杂交瘤细胞株注射小鼠腹腔均能产生较高浓度的蛋白,且抗体效价均在10-7以上(表3)。表3 细胞上清和腹水中的蛋白含量及抗体效价Tab.3Protein concentration and antibody titer of cell culture su2pernate and obtained ascites蛋白/(mg/mL)效价1C1细胞上清5.2710-32G12细胞上清5.1310-31C1腹水31.0810-72G12腹水30.9510-73.3 抗体的纯化在上样缓冲液pH 6.5,7.0,7.5和8.0条件下,目的单抗基本保留在色谱介质上。在pH 7.0的上样条件下,洗脱的目的蛋白峰中杂蛋白含量较少,回收率略高。上样缓冲液的离子强度为4 mol/L以上时会产生盐析效应,影响抗体的稳定性。在03.0 mol/LNaCl的离子强度下,目的单抗均能较好地与色谱介质结合,在3.0 mol/L NaCl的离子强度下,洗脱的目的蛋白峰中杂蛋白含量较少,回收率较高。采用pH为3.0的0.1 mol/L柠檬酸缓冲液进行洗脱时,洗脱峰为单一峰,而且峰形较好,洗脱较完全,回收率高。随着pH的增加,洗脱时间越长,洗脱也越不完全,抗体回收率降低。当pH为6时,无明显的洗脱峰。42中国生化药物杂志Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics 2010年第31卷第1期样品在各个流速下进行上样和洗脱,都可以得到较高的纯度和回收率,流速对其影响较小。因此为了提高效率,可以采用5.0 mL/min的流速进行上样和洗脱。本实验确定pH 7.0,20 mmol/L磷酸缓冲液+3.0 mol/L NaCl为最佳上样条件;pH 3.0,0.1 mol/L柠檬酸为最佳洗脱条件。纯化后抗体纯度达98%以上,回收率达75%。色谱结果如图1所示。电泳鉴定结果如图2所示。4 讨 论本文采用hCG免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨艘瘤细胞SP2/0融合,经反复筛选和单克隆化后得到2株稳定分泌单克隆抗体细胞株。所获得的单克隆抗体细胞株为将来有关早孕、癌症检测、激素本身相关研究及疫苗研制等领域打下基础。hCG与来自脑垂体的一些糖蛋白如促黄体生成素(LH)、促卵泡激素(FSH)和促甲状腺激素(TSH)等结构相似,链的氨基酸排列顺序基本相同,而代表hCG特异性的仅是 链羧基末端约30个氨基酸的片段。故用完整的hCG分子作为免疫原制备单克隆抗体,或多或少地会和LH、FSH、TSH发生交叉反应,抗 2hCG的抗体无法识别 2hCG和甾体糖蛋白之间的差异7。因此我们设想下一步采用新型的基因免疫法来制备针对hCG亚基羧基末端37肽(hCG2CTP)的单克隆抗体,避免交叉反应。随着单抗在诊断与治疗中应用的快速发展,对单抗的种类及数量的需求越来越多8,同时也对相应的下游纯化技术提出更高的要求。纯化抗体的方法多种多样,硫酸铵沉淀法纯化后的纯度很有限;辛酸提取法的操作时间太长,效果也不是很理想;离子交换色谱和凝胶过滤法纯化效果不错,但是过程太繁琐;疏水色谱能够影响蛋白的活性,柱子的再生也比较困难。所以寻找具有高效、快速、纯度高的纯化方法是有重要意义的。本文采用蛋白A亲和色谱纯化单抗,仅一次纯化即可得到良好的分离效果,获得纯度高,特异性强,生物活性好的单抗,而且这种方法操作简便,快速(通常在2 h即可完成纯化过程),重复性好,色谱柱可反复多次使用,为今后单抗用于基础研究及临床诊疗过程中的质量控制提供了保证。参考文献:1 杨廷富.人绒毛膜促性腺激素的临床意义及检测进展J.检验医学与临床,2007,4(10):9762978.2Michael G,Gregory W,Annete G,et al.Genetic immunization with thefree human chorionic gonadotrophinsubunit elicit cytotoxic Tlympho2cyte responses and protects against tumor formation in miceJ.Lab In2vest,1997,76(7):8592871.3Manzke O,Tesch H,Diehl V,et al.Single2step purificationof bispecificmonoclonal antibodies for immunotherapeutic use by hydrophobic inter2action chromatography J.J Immunol Methods,1997,208:65273.4 谢竞,石明隽,张国忠,等.不同pH值和盐浓度对柱色谱提取抗2D抗体的影响J.中国生化药物杂志,2005,26(4):2082210.5Mccue J T,Kemp G,LowD,et al.Evaluationof protein2A chromatogra2phy media J.J Chromatogr A,2003,989(1):1392153.6Hahn R,Kazumichi S,Steindl F,et al.Comparison of protein A affinitysorbents:Life time study J.J Chromatogr A,2006,1102(122):2242231.7Steven V C,Powell J E,Lee A C,et al.Antifertility effectsfrom immu2nization of female baboons with C2terminal peptides of human chorionicgnadotropinJ.Fertil Steril,1981,36:982105.8 潘萌,孔蕴,陈畅.单克隆抗体药物的研究进展J.中国生化药物杂志,2008,29(1):62264.52中国生化药物杂志Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics 2010年第31卷第1期