墨兰AP3基因过表达载体构建及遗传转化铁皮石斛.pdf

兰科（Orchidaceae）作为被子植物第二大科，其花型特异、品种众多、分布广泛，深受民众喜爱，是中国最大的花卉资源之一1。墨兰（Cymbidium sinense）又名“报岁兰”，兰科兰属地生植物，多分布于热带、亚热带地区，因独特的花型、花色及花香，具有较高的观赏性。近年来，墨兰出口量不断上升，经济价值也越来越高2，3。然而，墨兰花发育机理仍不清晰，探索其花器官形成的分子机理，对推动兰科植物分子育种及中国兰花产业的发展具有重要意义4。近年来，为了揭示兰科植物花发育的遗传机理，研究人员从多种兰科植物中分离得到与花发育相关的功能基因，即 MADS-box 基因家族成员5。在“ABCDE”花器官发育的模型中，B类基因最受关注，其相关研究也最广泛6，7。AP3基因为MADS-box基因家族 B 类基因，在模式植物拟南芥（Arabidopsisthaliana）中，主要参与调控花瓣及雄蕊的发育，而且在整个发育变化进程中都有表达8，9。大量研究表明，在不同的植物中，AP3 基因的表达模式各不相同10，11，尤其是兰科植物花型复杂，其表达模式差异较大。在文心兰（Oncidium hybridum）中，AP3 基因主要作用于萼片及合蕊柱12；在大花蕙兰（Cymbidium hybrid）中，AP3基因在子房、花等器官中均有表达13；在蝴蝶兰（Phalaenopsis amabilis）中，AP3基因在营养及花器官中均有较高的表达量14；在木石斛墨兰AP3基因过表达载体构建及遗传转化铁皮石斛何玲a，孙博b，王义琴b，臧睿b，陈宇b，和凤美b，朱永平a（云南农业大学，a.农学与生物技术学院；b.园林园艺学院，昆明650201）摘要：为探讨墨兰（Cymbidium sinense）AP3基因在兰花唇瓣中的功能，基于前期从墨兰转录组中得到的AP3 基因序列，通过 PCR 技术构建墨兰 AP3 基因过表达载体，利用农杆菌 EHA105 转化铁皮石斛（Dendrobium officinale）原球茎，建立遗传转化体系。经PCR验证，20棵抗性苗中获得9棵阳性苗，其阳性苗率达45%，成功将墨兰AP3 基因导入铁皮石斛。关键词：墨兰（Cymbidium sinense）；AP3基因；过表达载体；铁皮石斛（Dendrobium officinale）；遗传转化中图分类号：S682.31文献标识码：A文章编号：0439-8114（2023）07-0157-06DOI:10.14088/ki.issn0439-8114.2023.07.027开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Construction of Cymbidium sinense AP3 gene overexpression vector and genetictransformation of Dendrobium officinaleHE Linga，SUN Bob，WANG Yi-qinb，ZANG Ruib，CHEN Yub，HE Feng-meib，ZHU Yong-pinga（a.College of Agronomy and Biotechnolog；b.College of Landscape and Horticulture，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China）Abstract：In order to explore the function of the Cymbidium sinense AP3 gene in the orchid lip，based on the AP3 gene sequence obtained from the Cymbidium sinense transcriptome in the earlier stage，the overexpression vector of the Cymbidium sinense AP3 genethrough PCR technology was constructed，and the protocorm of Dendrobium officinale was transformed using Agrobacterium EHA105to establish a genetic transformation system.After PCR verification，9 out of 20 resistant seedlings were found to be positive，with apositive seedling rate of 45%.The Cymbidium sinense AP3 gene was successfully introduced into Dendrobium officinale.Key words：Cymbidium sinense；AP3 gene；overexpression vector；Dendrobium officinale；genetic transformation湖北农业科学2023 年（Dendrobium crumenatum）中，AP3 基因仅在花瓣中表达量较高15，16。然而，有关墨兰 AP3基因的表达模式及功能研究报道较少。本实验室前期从墨兰的花蕾转录组中分离获得了 AP3 基因，经过荧光定量组织特异性分析发现，AP3基因在捧瓣、舌瓣中高表达，推测AP3基因可能与捧瓣和舌瓣的形成有关17。为了进一步探索AP3基因对墨兰花型形成的分子机理，本研究构建墨兰AP3基因的过表达载体，试图通过过表达植株花型变化探究AP3基因的功能。由于墨兰组织培养有一定难度，其遗传转化体系报道较少，构建难度较大，而铁皮石斛（Dendrobium officinale）除组织培养技术成熟外，还能在瓶内开花，能缩短观察转基因植株开花表型时间，因此，本研究拟通过农杆菌介导法将墨兰 AP3基因转化到铁皮石斛原球茎，优化铁皮石斛遗传转化体系，提高遗传转化效率，获得阳性植株。研究结果可为兰科植物基因工程育种和研究AP3基因的分子机理提供有用信息，为下一步的遗传操作改变兰花花型、培育兰花新品种和兰花的保育等方面提供参考，在观赏园艺和资源保护等领域具有广阔的应用前景。1材料与方法1.1材料墨兰花蕾、大肠杆菌感受态细胞DH5、农杆菌EHA105 及铁皮石斛原球茎均由本实验室提供；载体 pBWA（V）HU购自武汉伯远生物科技有限公司，植物总 RNA 提取试剂盒和 Quantscript RT Kit 购自天根生化科技（北京）有限公司，凝胶DNA回收试剂盒购自TaKaRa公司，引物合成及测序均由北京擎科生物科技有限公司完成。1.2方法1.2.1引物设计基于墨兰AP3基因cDNA序列和pBWA（V）HU-ccdB-GUS载体多克隆位点上的限制性内切酶位点信息，应用 Premier 5.0 软件，设计在5末端带有 EcoR I酶切位点的引物，用于扩增墨兰AP3 基因 cDNA 编码区序列（CDS 序列）；基于载体 pBWA（V）HU-ccdB-GUS 上潮霉素序列，设计用于转基因铁皮石斛的 PCR 检测引物。引物序列见表1。表 1PCR引物信息引物名称CsAP3（F）CsAP3（R）Hyg-B（F）Hyg-B（R）引物序列（53）CAGTGGATCCACAACATGATGGAGCCAAAGGAAAAGATGCAGTGGATCCATACAAGAAAAGGTCATCTCCATCAATGCACGCGTCGACATGTCTAAGGGCGAGGAACTCGGACTAGTTTATTTATAGAGTTCGTCCAT用途目的基因克隆潮霉素基因检测产物长度/bp1 000650注：斜体部分为酶切位点1.2.2墨兰AP3基因编码区的克隆以墨兰新鲜花蕾为材料，提取总RNA，用Quantscript RT Kit试剂盒反 转 录 为 cDNA，以 cDNA 为 模 板，CsAP3（F）和CsAP3（R）为引物，利用 PCR扩增 AP3基因编码区。反应程序为：98 预变性 10 min；98 下 30 s，58 30 s，72 1 min，32个循环；72 延伸 15 min，14 保温10 min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，使用 DNA 凝胶回收试剂盒切胶回收，纯化目的片段。1.2.3墨兰 AP3 基因过表达载体的构建采用EcoR I酶分别对回收的目的基因片段和载体pBWA（V）HU-ccdB-GUS 进行酶切，回收酶切产物，将酶切后的目的基因片段用T4连接酶连接到载体上，通过热激法转化大肠杆菌感受态细胞DH5a，将菌液涂抹在含 Kan抗性的 YM 平板上，于 28 培养后挑选出白色单菌落，菌落PCR验证，挑选阳性克隆，提取重组质粒，使用EcoR I进行酶切检验，随后将质粒送往武汉伯远生物科技有限公司测序，分析获得正确的 pBWA（V）HU-ccdB-GUS-AP3过表达载体，采用热激法将过表达载体转入农杆菌 EHA105 菌株中，摇菌，保存于-80，备用。1.2.4农杆菌介导的铁皮石斛遗传转化体系建立取保存的阳性农杆菌 EHA105菌液 600 L，加入到100 mL 的 LB 液体培养基（含 50 mg/L Kan）中，于28，150 r/min 恒温振荡过夜培养。待 OD600 nm为1.2 时，将菌液 4 4 000 r/min 离心 12 min，倒掉上清液，用悬浮液将菌体重悬，分别制备 OD600 nm为0.4、0.6、0.8、1.0 和 1.2 的梯度重悬菌液，并加入100 mol/L乙酰丁香酮（AS），混匀备用；将长势较好的原球茎切块分别接到含有 10、20、30、40、50、60 mg/L潮霉素B的筛选培养基上，设置1组对照，切面朝上，用移液枪吸取少量农杆菌乙酰丁香酮混合溶液，涂抹到原球茎的切口面上进行侵染，注意尽量不要将菌液挤到原球茎创面以外。随后将侵染后的原球茎放在光照培养室，白天 25 培养 16 h，夜间16 培养8 h，培养3060 d。在此期间，将长有农杆158第 7 期菌的原球茎浸泡在含有 200 mg/L头孢（Cefadroxil）、200 mg/L 特美汀（Timentin）及 200 mg/L 羧苄青霉素（Carboxybenzylpenicillin）混合溶液中，震荡 30 min，再用无菌去离子水冲洗 34次，接入新的筛选培养基上。1.2.5铁皮石斛阳性植株检测铁皮石斛原球茎经过60 d的培养，将生长良好的植株进行阳性检测，使用 T5 Direct PCR Kit 试 剂 盒，采 用 Hyg-B（F）和Hyg-B（R）进行引物 PCR 扩增，检测潮霉素基因片段，将检测后的阳性苗转到增殖培养基中，30 d后转入分化培养基中。2结果与分析2.1墨兰AP3基因编码区的克隆以墨兰 AP3基因 cDNA为模板，利用 CsAP3（F）和 CsAP3（R）引物进行 PCR 扩增，琼脂糖凝胶电泳检测，获得大小约 1 000 bp的条带（图 1），符合预期结果；获得带有 EcoR I 酶切位点的墨兰 AP3 基因cDNA编码区序列（CDS序列）；回收目的片段可用于后续墨兰AP3基因过表达载体的构建。M15 000 bp3 000 bp2 000 bp1 000 bp750 bp500 bp250 bp100 bpM：Marker；1：PCR扩增产物图1AP3基因CDS PCR扩增电泳2.2墨兰AP3基因过表达载体的构建PCR扩增目的基因，酶切目的基因和载体，将目的基因连接到载体上，转入大肠杆菌，经Kan筛选后随机挑取克隆单菌落，菌落 PCR 扩增出约 1 000 bp的目的基因片段（图2），与目的基因片段大小一致；阳性克隆菌液的质粒经酶切检验，条带大小分别为1 283、2 567、5 324 bp（图3），符合预期结果；对重组质粒测序比对分析，序列正确，表明目的基因片段已插入到载体 pBWA（V）HU-ccdB-GUS 上，载体图谱见图4。2.2.1农杆菌侵染菌液在不同 OD600 nm下铁皮石斛原球茎死亡情况由图 5可知，当农杆菌侵染菌液的 OD600 nm为 0.4 时，铁 皮 石 斛 原 球 茎 死 亡 率 为87.5%；当农杆菌侵染菌液的 OD600 nm为 0.6 时，死亡率达 92.8%；当农杆菌侵染菌液的 OD600 nm为 0.8时，死亡率为 95.6%；之后，随着农杆菌侵染菌液的OD600 nm增大，铁皮石斛原球茎的死亡率也随之增高，当农杆菌侵染菌液的 OD600 nm达 1.2 时，铁皮石斛原球茎死亡率达100%。原球茎死亡率过低，不利于阳性苗的筛选，易产生假阳性和嵌合体，死亡率过高，不易获得阳性苗，因此，当农杆菌侵染菌液的OD600 nm为0.60.8时，有利于铁皮石斛遗传转化。原球茎生长情况见图6。2.2.2不同筛选浓度潮霉素B对铁皮石斛原球茎生长的影响设置 6个潮霉素 B 的筛选浓度梯度，由图7可知，随着潮霉素B筛选浓度升高，铁皮石斛原球茎死亡率升高。当潮霉素B的筛选浓度为10 mg/L时，大部分原球茎能够存活，死亡率较低，仅为26.8%；当潮霉素B的筛选浓度为20 mg/L时，原球茎出现大量死亡，死亡率为73.5%；当潮霉素B的筛选浓度持续升高，到达30 mg/L时，死亡率高达85.6%；M12345 000 bp3 000 bp2 000 bp1 000 bp750 bp500 bp250 bp100 bpM：Marker；14：PCR扩增产物图2菌落PCR电泳M15 000 bp3 000 bp2 000 bp1 000 bp750 bp500 bp250 bp100 bpM：Marker；1：质粒酶切产物图3酶切条带验证何玲等：墨兰AP3基因过表达载体构建及遗传转化铁皮石斛159湖北农业科学2023 年当潮霉素 B 的筛选浓度超过 40 mg/L，死亡率达100%。因此，区分转化和未转化原球茎的潮霉素B有效筛选浓度为10 mg/L，潮霉素B适宜筛选浓度为30 mg/L。原球茎在不同筛选浓度潮霉素 B 的生长情况见图8。图7不同筛选浓度潮霉素B对铁皮石斛原球茎死亡率的影响2.3抗性植株鉴定经潮霉素 B 筛选 60 d 后，获得抗性植株（阳性苗），以 Hyg-B（F）和 Hyg-B（R）为引物，通过 T5 Direct PCR Kit试剂盒验证其中20颗苗，PCR产物电泳结果见图9，20棵抗性苗中有9颗苗扩增出潮霉素基因（650 bp），初步鉴定这9颗苗为阳性苗。最后，将阳性苗转入增殖及分化培养基，培养60 d后，阳性苗株高为35 cm（图10）。（13 639）Sac IIPsp X I（421）AsiS I（1 122）（13 035）Blp I（11 252）EcoN I（10 347）Not I（9 864）Acl I（9 270）Pas I（8 820）Sph I（8 450）I-Ppo I（8 392）Avr II（8 390）I-Sce I（7 674）Mlu I（7 176）PluT I（7 173）Nar I（7 172）Kas IBsrG I（6 630）BstB I（6 534）BamH I（4 973）Sac I（4 447）EcoR I（3 718）SgrD I（2 922）Pst I-Sbf I（2 340）BstX I（2 302）pVS1 RepAM13 fwdT7 terminatorNOS terminatorAP3目的基因片段pBWA（V）HU-Unigene0021946-GUS（13 803 bP）Unigene0021946CaMV 355S promoter（enhanced）2 0004 0006 0008 00010 00012 000oriKanRCaMVpoly（A）signalLBT-DNArepeatbomoriVpVS1RBT-DNArepeat6xHispVS1StaAIoxPGUSPlusTMCaMV35Spromotercat1intronHygR图4AP3基因过表达载体图谱图5农杆菌菌液在不同OD600 nm下铁皮石斛原球茎死亡情况abcdea.OD600 nm=0.4；b.OD600 nm=0.6，c.OD600 nm=0.8；d.OD600 nm=1.0；e.OD600 nm=1.2图6农杆菌菌液在不同OD600 nm下铁皮石斛原球茎生长情况160第 7 期abcdefga.0 mg/L潮霉素B；b.10 mg/L潮霉素B；c.20 mg/L潮霉素B；d.30 mg/L潮霉素B；e.40 mg/L潮霉素B；f.50 mg/L潮霉素B；g.60 mg/L潮霉素B图8不同筛选浓度潮霉素B对铁皮石斛原球茎生长的影响M12345678910115 000 bp3 000 bp2 000 bp1 000 bp750 bp500 bp250 bp100 bpM为Marker；1为阳性对照；2为阴性对照；311为阳性苗图9潮霉素基因PCR检测结果aba.PCR检测后的阳性苗；b.阳性苗分化培养后的植株图10阳性苗分化培养3小结与讨论墨兰花型独特、花香浓郁、叶枝挺拔18，在兰花中备受关注，其独特花形具有较高的经济价值及观赏价值19。由于兰花花型复杂，越来越多的研究者致力于兰花的花发育研究，但有关墨兰奇花产生的遗传机制报道较少。有研究表明，AP3基因对兰花的花发育起到至关重要的作用20。为了揭示墨兰奇花的形成机理，本研究基于实验室前期转录组分析，发现AP3基因在捧瓣和唇瓣上高表达，因此将研究重点放在 AP3基因上，拟探讨 AP3基因在墨兰的捧瓣和唇瓣形成中发挥的作用。由于兰科的遗传转化起步较晚，加之墨兰的组织培养困难及遗传转化再生体系没有建立21，目前只能通过异源转化研究其基因功能。1997年，Nan等22采用农杆菌介导法成功将外源基因导入石斛，获得转化植物，使得农杆菌介导的遗传转化在兰科植物中成为可能，然而，兰花遗传转化率仍然较低。本研究构建了墨兰AP3基因过表达载体并导入铁皮石斛，结果表明，原球茎死亡率过低，不利于阳性苗的筛选，易产生假阳性和嵌合体，死亡率过高，不易获得阳性苗，当农杆菌侵染菌液的OD600 nm为0.8时，抗性筛选效果最好，铁皮石斛原球茎死亡率相对较高，与冯莹23在石斛兰的遗传转化结果一致；当潮霉素B的筛选浓度为30 mg/L时，铁皮石斛抗性筛选效果较好，原球茎存活率为14.4%，当潮霉素B筛选浓度超过40 mg/L时，原球茎全部死亡。因此，当潮霉素B的筛选浓度为30 mg/L时，有利于铁皮石斛原球茎的筛选，与陈之林等24研究选定的石斛品种紫蝶 的潮霉素 B筛选浓度相同；尤超25发现潮霉素B筛选浓度超过10 mg/L时，石斛的类原球茎全部白化死亡，而本研究中，大部分铁皮石斛原球茎能够在筛选浓度为10 mg/L的潮霉素B下存活；陈璐等26将筛选浓度为 55 mg/L的潮霉素 B作为铁皮石斛最适筛选剂，其转化苗存活率为12.5%。本研究成功将墨兰AP3基因导入铁皮石斛原球茎中，经分化培养和PCR验证，20棵抗性苗中获得9棵阳性苗，其阳性苗率达 45%。后续将进行阳性植株瓶内开花的研究，观察其花型变化。本研究可为研究兰花花发育相关基因的生物学功能验证提供前期试验条件，也为兰花分子育种奠定一定的理论基础。参考文献：1钟佳丽.兰科植物研究进展 J.广东蚕业，2020，54（10）：29-30.2程芬芳，陈新荣，陈莹莹，等.墨兰的组织培养研究进展 J.黑龙江农业科学，2015（3）：155-159.3陈剑东，黄刚，张金显，等.中越兰花产业化科技创新研究墨兰高效栽培技术 J.大众科技，2019，21（8）：97-99.4孙崇波，向林，施季森，等.春兰AGL6基因的克隆及实时定量表达分析 J.分子植物育种，2010，8（5）：939-944.5李成儒，董钠，李笑平，等.兰科植物花发育调控MADS-box基何玲等：墨兰AP3基因过表达载体构建及遗传转化铁皮石斛161湖北农业科学2023 年因家族研究进展 J.园艺学报，2020，47（10）：2047-2062.6张浩.蝴蝶兰花发育相关 B族和 C族 MADS盒基因的功能研究 D.上海：复旦大学，2009.7CAUSIER B，SCHWARZ-SOMMER Z，DAVIES B.Floral organidentity：20 years of ABCs J.Seminars in cell and developmentalbiology，2010（21）：73-79.8王力娜，范术丽，宋美珍，等.植物MADS-box基因的研究进展 J.生物技术通报，2010（8）：12-19.9冯垒，王义琴，韩欣妤，等.墨兰 PI基因过表达载体构建及功能初步分析 J.分子植物育种，2023，21（9）：2941-2947.10向林，秦德辉，李小白，等.蕙兰 B类 MADS-box基因的克隆及表达分析 J.园艺学报，2011，38（12）：2333-2341.11张婷，邢妮，王超，等.小花草玉梅正常和自然变异植株的AP3-3基因研究 J.西北植物学报，2016，36（2）：231-240.12徐小雁.文心兰 AP3-like基因的克隆与表达分析研究 D.南宁：广西大学，2011.13陈 小 强，王 春 国，李 秀 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