苦杏仁苷测定前处理条件的比较优化.pdf

为填补苦杏仁中苦杏仁苷测定的前处理条件研究的空白，通过比较不同去皮工艺下对苦杏仁苷含量的影响，确定了苦杏仁苷测定过程中宜选用的去皮方法。“杀酶保”作为前处理过程的核心工艺，对比不同灭酶工艺对苦杏仁中-葡萄糖苔酶的灭酶效果，确定苦杏仁苷测定前处理中宜采用的灭酶工艺，利用响应面试验进一步优化。结果表明：浸泡去皮为苦杏仁苷测定的最佳去皮方法，苦杏仁的损失最低，蒸汽灭酶工艺能够最好地达到“杀酶保苷”的效果。响应面试验确定了蒸汽灭酶的最佳工艺参数为：蒸汽温度117，蒸汽时间31min，蒸汽流量12 m/h，可将苦杏仁中-葡萄糖苷酶活性降低为0.6 5510 U/g，苦杏仁苷含量为5.0 3%。本研究为苦杏仁的测定过程安全性评价和苦杏仁菩含量测定提供重要的理论依据。关键词：苦杏仁苷；前处理条件；蒸汽灭酶中图分类号：TS201.1文献标志码：A文章编号：16 7 4-4942(2 0 2 3)0 2-0 2 0 5-0 7Comparative Optimization of Pretreatment Conditions for theDetermination of AmygdalinGUO Penghui,ZHANG Qingan,LONG Feifei,SONG Lei(School of Food Engineering and Nutrition Sciences,Shaanxi Normal University,Xian 710119,China)Abstract:In order to fll the blank of the pretreatment conditions of amygdalin in apricot kernel,the suitable peeling meth-od for the determination of apricot kernel were confirmed by comparing the content change of amygdalin in different peelingprocesses.Enzyme killing and glycoside protection was the core technology in the pretreatment process of apricot kernel.By comparing the effects of different enzyme killing processes on-Glucosidase in apricot kernel,the appropriate enzymeinactivation process in the pretreatment of amygdalin determination were confirmed,and the further optimization was con-ducted by response surface experiment.The results showed that soaking peeling was the most suitable method for the deter-mination of amygdalin.The decrease of amygdalin was the lowest,and the steam sterilization process could achieve the ef-fect of killing enzyme and protecting glycoside.The best process parameters for steam inactivation of enzyme were deter-mined by response test.The experiment results showed the optimal conditions of steam temperature 117 C,steam time 31min and steam flow 12 m/h,-Glucosidase activity decreased to 0.655x105 U/g,and the content of amygdalin was 5.03%.It provides an important theoretical basis for the safety evaluation of the determination process of apricot kernel and the truecontent of amygdalin.Keywords:amygdalin;pretreatment conditions;steam inactivation收稿日期：2 0 2 3-0 3-0 1基金项目：内蒙古鄂尔多斯市科技重大专项（2 0 2 2 EEDSKJZDZX022）第一作者：郭鹏辉（1999一），河南三门峡人，硕士研究生，研究方向为农副产品深加工及资源化利用。E-mail：*通信作者：张清安（197 6 一），河南南阳人，教授，研究方向为农副产品深加工及资源化利用。E-mail：q i n g a n z h a n g s n n LXO2062023年海南师范大学学报（自然科学版）苦杏仁苷是一种常见的氰苷类物质，又名维生素B17，广泛存在于李子、桃仁、杏仁等蔷薇科果实籽粒中，尤其在苦杏仁和扁桃仁中含量较多1-2。作为苦杏仁中特有的成分，除了含量较多的苦杏仁苷，还有具有活性特性的酶(-葡萄糖苷酶),以及野樱苷和与其关联的异构体等3。张馨予研究-葡萄糖苷酶在苦杏仁脱苦及增香作用中发现,该酶可将苦杏仁苷分解生成氢氰酸和苯甲醛,从而影响苦杏仁苷含量的变化4。在传统的中国药典中采用银量法，以硝酸银滴定液滴定吸收的氢氰酸含量计算得出苦杏仁苷含量5。目前使用较多的测定方法为色谱法或光谱法，如高效液相色谱法6 、紫外分光光度法7 、薄层扫描法8 及酶联免疫法等9。这些方法分离效率高，分析速度快，检测限度低，已经取代传统的银量法为苦杏仁苷的主要检测手段。吴迪采用HPLC法与电泳色谱法测定苦杏仁苷7 ,测定结果较为准确，操作简单、快捷，因此HPLC法作为本研究测定苦杏仁苷的方法。在现有的苦杏仁苷的检测方法中尚无统一的标准方法，虽然采取的检测手段众多，但对于苦杏仁的前处理方法很少具体描述。在可查询到的诸多文献中，测定苦杏仁苷的前处理操作各不相同9-12 。市售的苦杏仁都含有皮，在测定过程中应用的去皮方法是否会对苦杏仁苷的含量造成影响没有文献特别提及。为了避免内源酶对苦杏仁苷的分解，传统中药学中苦杏仁在人药时要先炮制3，炮制方法众多，现代炮制原理是“杀酶保苷”14,但在测定苦杏仁苷的过程中并没有涉及到测定前对苦杏仁中内源酶的考量。通过对比分析不同检测方法发现，苦杏仁苷的测定方法前处理工艺中，不同去皮和处理条件对苦杏仁中酶活性的影响和苦杏仁苷的含量有显著差异。因此，有必要系统研究样品处理方法对苦杏仁苷含量测定的影响，从而为苦杏仁苷含量的测定方法的构建提供依据。本研究旨在确定最适合苦杏仁苷测定的去皮和灭酶工艺，为测定苦杏仁苷的前处理提供指导。1材料与方法1.1原料与试剂原料：苦杏仁，购于西安市西北药材市场同盛恒祥药材行，4冷藏保存。试剂：甲醇(色谱级),美国FisherScientific公司；苦杏仁苷标准品，成都普菲德生物技术有限公司;纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司；-葡萄糖苷酶试剂盒，咸阳市秦都区博生商行1.2仪器与设备BS224S电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；10 1电热鼓风干燥箱，北京科伟永兴仪器有限公司；P230分析型高效液相色谱仪，大连依利特分析仪器有限公司；SB-500DTY超声波多频清洗机，江苏省昆山市超声仪器有限公司；JYL-CO2OE九阳料理机，山东九阳股份有限公司；SHZ-D(）循环水式多用真空泵，杭州仪表电机有限公司；HH-S4型电热恒温水浴锅，上海安亭科学仪器厂；SK2INUSE28TROIA蒸汽烤箱，德国CONVOTHERM公司；TGL-16冷冻离心机，广东志高精密机械有限公司；TU-1810紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司2实验方法2.1去皮方法的选择选取4组颗粒饱满的杏仁（每组50 粒），烘箱干燥至恒重后，分别进行如下处理：A（浸泡去皮法）：1:2(w:)的料液比加水浸渍5h，手动揉搓去皮。B(热烫去皮法）：1:10(w:v)的料液比加水烫漂5min，手动揉搓去皮15C（饱和热蒸汽去皮法）：1:2（w:)料液比加水浸渍2 0 min，放入蒸汽烤箱中进行蒸汽处理，6 min后取出，手工揉搓去皮16 D.不主皮2.2灭酶工艺的选择对于去皮后的苦杏仁，选用如下方法处理：I（婵法）：苦杏仁于10 倍沸水中煮沸5min，?水浸泡l17)图207第2 期郭鹏辉，等：苦杏仁苷测定前处理条件的比较优化I（蒸汽法）：将杏仁均匀放置汽烤箱中，95开始计时，蒸汽温度到达10 0 后维持30 min，取出即可13。（热压蒸汽法）：将苦杏仁置于热压灭菌柜中，内抽真空，压强达到0.1MPa迅速升温将酶灭掉，取出冷却8 IV（微波法）：将苦杏仁放置于容器中，微波炉中高火档加热4min（炉内温度约为95 110），取出后冷却92.3苦杏仁苷检测标准方法的建立苦杏仁苷含量的测定条件参照文献4,-葡萄糖苷酶活性测定参照文献2 0 ,根据对上述前处理操作的分析与处理，在探究合适的去皮方法、灭酶工艺后，经高效液相色谱仪检测，建立准确合理、安全可靠的苦杏仁苷分析方法，得到测定平均值与相对标准偏差(RSD),并与理论添加值比对，分析苦杏仁苷测定方法的重复性、精密度和加标回收率。2.4数据处理使用SPSS(SPSS26.0)通过Duncan检验确定显著性水平（P0.05）。使用Origin2021（O r i g i n L a b）绘3结果与分析3.1不同去皮方法和灭酶方式对苦杏仁中苦杏仁苷含量和-葡萄糖苷酶活性的影响如图1所示，带皮苦杏仁中苦杏仁苷含量为5.10 3%，与高颖等所测的全国各地苦杏仁中苦杏仁苷的含量几乎一致。在未经过处理的苦杏仁中，除了特殊产地外，中国所产苦杏仁中苦杏仁苷含量为4%6%1,苦杏仁中的-葡萄糖苷酶活性为3.5410 5U/g。采用浸泡去皮法去皮时，苦杏仁苷含量为4.8 0 7%,-葡萄糖苷酶的活性也减少至2.98 x105U/g，苦杏仁中苦杏仁苷会部分迁移到水中。此外，苦杏仁皮中含有部分苦杏仁苷2 2)。相较于热烫去皮法和饱和热蒸汽法去皮，浸泡去皮法造成的苦杏仁苷损失最少，浸泡去皮法的缺点为去皮率相对较低，耗时时间较长。热烫去皮后的苦杏仁苷含量为3.197%,-葡萄糖苷酶的活性为2.98 10 U/g。高温不仅会导致苦杏仁苷的分解，也会加速苦杏仁苷的迁移过程，加快-葡萄糖苷酶的失活，这一结论与申辉的研究结果一致5)。而经过饱和热蒸汽法去皮的苦杏仁，苦杏仁苷含量为4.6 43%，-葡萄糖苷酶的活性为2.6 910 5U/g，酶活性和苦杏仁苷含量的损失对比热烫去皮的苦杏仁有所下降，这可能是因为水蒸气的穿透作用小于热水烫漂带来的分子迁移2 3。为了最大程度地减少苦杏仁苷的损失，在测定苦杏仁苷含量时，宜选择浸泡去皮方法，在工业生产中，可以考虑饱和热蒸汽法和热烫去皮法进行工业去皮。66苦杏仁苷苦杏仁苷含量5.103(8/501x)/县-8-葡萄糖苷酶活性54.807-葡萄糖苷酶活性4.6434.644.22443.93.542.983.1973.233.0632.692.4421.8821.5610.530.520.70不去皮浸泡去皮法热烫去皮法饱和热蒸汽去皮0煮沸灭煮沸灭酶蒸汽灭酶微波灭酶热压蒸汽灭酶去皮方式5min10min灭酶方式图1不同去皮方式和灭酶方式对苦杏仁苷含量和-葡萄糖苷酶活性的影响Figure1EEffect of different peeling and enzyme killing methods on amygdalin content and-Glucosidaseenzymeactivity无论是测定苦杏仁苷的含量，还是发挥苦杏仁平喘止咳的功效，得到一种灭酶方法能够最大程度钝化苦杏仁中-葡萄糖苷酶活性的同时又不造成苦杏仁苷自身损失至关重要。在木薯的研究中2 41,测定完木薯的氰化物后，热处理致木薯的-葡萄糖苷酶失活，再加入橡胶籽的-葡萄糖苷酶仍能检出氰化物，此结果说)21B+0.029C,2082023年海南师范大学学报（自然科学版）明杏仁、高梁、木薯、亚麻籽、利马豆等含氰苷类食品的氰化物含量与自身可以酶解氰苷类物质的-葡萄糖苷酶有密不可分的关系2 5,所以在传统中药学中苦杏仁入药前，需要对苦杏仁进行“炮制”。如图1所示，对比苦杏仁灭酶方式可知,煮沸灭酶作为最简单的操作,5min的热烫处理即可使酶的活性稳定到一个低值,且灭酶效果很好，但苦杏仁苷的损失较大，对后续测定过程中苦杏仁苷测定结果的准确性有很大误导。微波法灭酶，苦杏仁苷的热分解损失并不大，但是灭酶效果最差。热压蒸汽法灭酶相较于此前2 种方法苦杏仁苷损失并不多,并且酶的活性也大幅度降低，但此方法每次处理苦杏仁量较少，高压灭菌操作难度大，所需设备昂贵。使用蒸汽灭酶方法，苦杏仁苷含量可以稳定在4.6 4%,灭酶效果同样十分出色。时登龙对苦杏仁炮制方法的研究同样指出，热汽热压炮制法的杀酶效果好13。王均秀等指出，在实际炮制过程中要注意热变温度抑制酶的活性的同时,也要防止非酶褐变2 6 ;而蒸汽灭酶适用于绿色蔬菜和茶的快速干燥,对燕麦、养麦、小麦等内部酶活性灭酶失方面具有显著作用2 7 ,因此拟将蒸汽灭酶作为苦杏仁苷测定和加工过程中的灭酶方法。3.2响应面优化实验参照上述试验结果，根据Design-Expert软件设计原理，分别以(A)蒸汽灭酶时间、（B)蒸汽灭酶温度以及(C)蒸汽流量3因素为响应面试验因素水平,-葡萄糖苷酶活性和苦杏仁苷含量为响应值,因素及水平的编码如表1所示。表1响应面优化试验因素及水平表Table1Response surface optimization test factors and levels因素水平蒸汽灭酶时间（A)/min蒸汽灭酶温度（B)/蒸汽流量(C)/(m/h)-12811590301201213212515如表2 所示，该优化具有17 个试验点，包括5个零点和12 个分析点，利用DesignExpert10.0.3软件进行多元回归分析，建立-葡萄糖苷酶活性（Y）苦杏仁苷含量（Y,)对蒸汽灭酶时间（A）、蒸汽灭酶温度（B）、蒸汽流量（C）编码水平的二次回归模型Y,=0.66+7.510-3A-0.019B-4.62510-3C+7.510-AB-7.510-AC+1.510-3BC+0.019A?+0.0Y,=4.99-0.11A+0.073B+0.031C-0.027AB-0.040AC-0.022BC-0.093A?-0.13B2-0.23CY,和Y,响应面模型的P值分别为 0.0 0 0 1和0.0 0 0 9（表3），表明试验中建立的2 个模型均具有显著性差异（PF平方和自由度均方F值PrF模型0.1191.25510-31002.620.0001*0.5190.05714.790.000 9*A4.5010-414.5010-4368.420.0001*0.09010.09023.380.0019*B2.75510-312.75510-32.272.030.000 1*0.04210.04210.880.0131*C1.71110-411.71110-4141.100.000 1*7.83110-317.831x10-32.020.198 0AB2.250 x10-612.2501061.840.216 83.025x10-313.02510-30.780.405 6AC2.25010-612.25010-61.840.216 86.40010-316.40010-31.660.239 0BC9x10-619x10-67.370.03*:2.02510-312.02510-30.520.492 6A21.50410-311.504x10-31 231.380.000 1*0.03610.0369.430.018 1*B21.88310-311.88310-31 542.020.000 1*0.06610.06617.160.004 3*C3.45610-313.45610-32.829.550.0001*0.2310.2359.160.0001*残值8.550 x10-671.22110-60.02773.86410-3失拟项5.57010-631.9171062.740.177 60.02738.97510-3299.170.104 3纯误差2.8x10-64710-71.210-443.0010-5总残差0.011160.5416注：*表示差异显著（P0.05)，*表示差异极其显著（P0.01)。3.4精密度试验取苦杏仁样品，按1:2（w:u）的料液比加水浸泡5h后手动去皮，蒸汽温度117、蒸汽流量12 m/h条件下蒸汽灭酶31min。粉碎提取后，取对照品溶液，重复进样5次测定，每次进样2 0 L,经HPLC测定色谱峰峰面积分别为8 58 6.90、92 37.90、917 1.90、8 6 2 0.2 4、8 7 44.7 5,RSD为3.56%，表明液相色谱法的工作条件适合此前处理方法得到苦杏仁苷，精密度良好。2102023年海南师范自然科学版）0.740.740.74(8/n.01x)(3/0.01x)0.69(8/n,01x)0.690.690.640.640.643212515125153230120121201230B:时间/min28115A:温度/C:流量/(m/h)9115A:温度/C:流量/(m/h)928B:时间/min5.115.115.1%/惠号具二早果%/惠易县二早呆4.84.84.84.54.54.53212515125153230120121201230B:时间/minA:温度/C:流量/(m/h)A:温度/C:流量/(m/h)B:时间/min281159115928图2温度、时间、蒸汽流量交互影响对-葡萄糖苷酶活性(a)和苦杏仁苷含量(b)响应面图Figure2FResponse surface plots of the interactive effects of the temperature,time and steam flow on-glucosidase activity(a)and amygdalin content(b)3.5加样回收率试验精密称取5份已知苦杏仁苷含量为4.16%的同批苦杏仁0.5g，每份加人对照品贮备液(10 mg/mL)1mL，参照2.3进行苦杏仁苷含量检测，结果见表4。由实验结果可知，采用2 mg左右已知浓度苦杏仁苷样品加10mg固定浓度苦杏仁苷，测得的平均加标回收率在94%99%之间，平均回收率为97.3%，RSD为2.2 0%，说明此前处理方法能够得到较好的加标回收率。表4加样回收率试验表Table4Samplingrecoverytesttable样品苦杏仁苷浓度/（mg/g）加苦杏仁苷浓度/mg/g）测得总量/(mg/g)回收率/%平均回收率/%RSD/%2.071011.5394.62.181012.0398.52.271012.2599.897.32.202.081011.9098.22.081011.6295.44结论本研究以苦杏仁中苦杏仁苷为研究对象，比较了不同的去皮方式和灭酶工艺,综合分析了不同前处理操作对苦杏仁苷含量和-葡萄糖苷酶活性的影响，结果显示：浸泡去皮宜作为测定苦杏仁苷最合适的去皮方式;在粉碎前,有必要对去皮后的苦杏仁进行灭酶,蒸汽灭酶得到的灭酶效果最佳；在蒸汽灭酶温度117 和蒸汽流量12 m/h条件下蒸汽灭酶31min，能将苦杏仁中-葡萄糖苷酶活性降低至0.6 5510 U/g，得到的苦杏仁苷含量为5.0 3%；从重复性试验、精密度试验和加标回收率实验结果来看，重复性好，精密度高，加标回收率准确可靠。实验表明，不同前处理方法在最终的苦杏仁苷测定结果上有显著性差异,在HPLC测定苦杏仁苷的日常检测中，推荐使用此方法处理苦杏仁以获得准确的苦杏仁苷含量。参考文献：1肖雄，魏惠珍，张丹，等.HPLC测定苦杏仁、桃仁、郁李仁中D-苦杏仁苔的含量J.江西中医药大学学报,2 0 19,31(3)：76-79.211第2 期郭鹏辉，等：苦杏仁苷测定前处理条件的比较优化2 PAVLOVIC N,VIDOVIC S,VLADIC J,et al.Recovery of tocopherols,mygdalin,and fatty acids from apricot kernel oil:cold press-ing versus supercritical carbon dioxide J 1.European Journal of Lipid Science and Technology,2018,120(11):1800043.3邢国秀，李楠，杨美燕，等.天然苦杏仁苷的研究进展J.中成药，2 0 0 3,2 5(12)：10 0 7-10 0 9.4张宁，张馨允，范学辉，等.苦杏仁超声辅助快速脱苦工艺优化J.食品与机械，2 0 18,34(12)：18 9-194.5苗兴军.山杏苦杏仁苷含量差异及苦杏仁油安全性评价D.杨凌：西北农林科技大学,2 0 14.6ZHANG N,ZHANG Q G,YAO J L,et al.Changes of amygdalin and volatile components of apricot kernels during the ultrasonical-ly-accelerated debitterizingl J J.Ultrasonics Sonochemistry,2019,58:104614.7吴迪，王建中，赵云霞，等.苦杏仁苷几种测定方法的比较研究J.食品工业科技，2 0 0 6,2 7(2)：18 4-18 5，18 9.8夏其乐，王涛，陆胜民，等.苦杏仁苷的分析、提取纯化及药理作用研究进展J.食品科学，2 0 13,34(2 1)：40 3-40 7.9 CHO A Y,YI K S,RHIM J H,et al.Detection of abnormally high amygdalin content in food by an enzyme immunoassayl JJ.Mole-cules and Cells,2006,21(2):308-313.10李海龙，王静，张英春，等.HPLC-ELSD法测定苦杏仁中苦杏仁苷的含量J.食品与发酵工业,2 0 0 7,33(1)：10 9-112.11高颖，高文远，董玄.不同产地桃仁药材中苦杏仁苷的含量测定CJ/中华中医药学会第九届中药鉴定学术会议论文集祝贺中华中医药学会中药鉴定分会成立二十周年.建德：中华中医药学会，2 0 0 8：399-40 1.12邹小娟，谢和兵，钱芳，等.HPLC法测定苦杏仁中苦杏仁苷含量的方法研究J.中国药事，2 0 0 9,2 3(1):33-36.13时登龙，刘代缓，曹喆，等.苦杏仁药理作用及炮制工艺研究进展J.亚太传统医药,2 0 18,14(12)：10 6-10 9.14包国林，杨益，刘梅，等.苦杏仁炮制方法探讨J1.陕西中医，2 0 0 1,2 2(12)：7 58-7 59.15申辉.苦杏仁去皮过程中品质变化及其原因探究D.西安：陕西师范大学,2 0 15.16吴东栋.饱和热空气法去皮工艺优化及其对苦杏仁和皮理化指标的影响D.西安：陕西师范大学,2 0 19.17吕秉森，胡云川.破坏苦杏仁酶的方法比较J.中国药学杂志,198 1,16(4)：2 3-2 4.18胡友栋.超高压处理对胡柚汁的杀菌灭酶效果及品质影响D.杭州：浙江工商大学,2 0 0 9.19陈俊怡，贾天柱.苦杏仁微波炮制研究C/中华中医药学会中药炮制分会2 0 11年学术年会论文集.贵阳：中华中医药学会,2 0 11:153-156.20赵丽莹,拱健婷，米文娟，等.苦杏仁中-葡萄糖苷酶活性测定条件的研究J.中南药学,2 0 17,15(2)：16 6-16 9.21吴月亮，许森，董胜君，等.不同产区苦杏仁营养成分分析J.食品工业科技，2 0 19,40(2 3)：30 0-30 5.22刘策，曹清明，屠焰，等.杏仁皮的苦杏仁苷含量测定及脱毒工艺探究J.食品研究与开发,2 0 15,36(3)：59-6 3.23吕建珍，邓家刚.苦杏仁的药理作用研究进展J.现代药物与临床,2 0 12,2 7(5)：530-535.24刘畅，陈宇，刘石生.不同处理方法对木薯中氰化物残留的影响J.食品科技,2 0 14,39(12)：190-193.25郭忠，张文德.食品中的氰化物来源及其安全性的研究进展J.中国食品卫生杂志,2 0 14,2 6(4)：40 4-40 8.26王均秀，张学兰，王秋红，等.苦杏仁不同炮制品HPLC指纹图谱的比较J.中国实验方剂学杂志,2 0 17,2 3（6):32-34.27胡月明.过热蒸汽处理对小麦及小麦粉品质的影响研究D.北京：中国农业大学,2 0 18.