肾脏间质纤维化动物模型的研究进展_赖灿.pdf

DOI:10.12300/j.issn.1674-5817.2022.171实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative MedicineApr.2023,43(2)肾脏间质纤维化动物模型的研究进展赖灿1,李乐乐1,胡塔拉1,孟 彦2(1.内蒙古医科大学研究生院,呼和浩特 010110;2.内蒙古医科大学附属医院肾内科,呼和浩特 010050)摘要 肾脏间质纤维化是许多肾脏疾病不断进展的共同路径。不管是各种慢性肾脏病，或是各种因素所引起的无法完全恢复的急性肾损伤，其进展过程多数是在经过肾脏间质纤维化后进入终末期肾功能衰竭。肾脏间质纤维化的动物模型是探索肾脏间质纤维化发生机制和新诊断治疗方法的主要研究工具。不同的动物模型各有特色，研究者可依据个人经验及实验目的建立不同的模型，并以此为基础开展科学研究，为肾脏疾病的防治提供更多新方法、新思路。本文着重综合阐述目前常见的几种肾脏间质纤维化动物模型，包括单侧输尿管梗阻、缺血再灌注损伤、肾大部切除、微栓塞诱导形成的手术模型，环孢素A、阿霉素、马兜铃酸、氯化汞、庆大霉素、马兜铃酸、顺铂、腺嘌呤诱导形成的化学模型，转基因杂交、肾损伤因子1诱导形成的转基因修饰模型，双侧缺血再灌注损伤术联合庆大霉素、单侧肾切除联合血管紧张素、单侧缺血再灌注损伤术联合pLVX-shTNC质粒诱导形成的复合模型，以供相关研究人员了解和借鉴。关键词 肾脏间质纤维化；动物模型；慢性肾脏病；急性肾损伤中图分类号 R-332；Q95-33 文献标志码 A 文章编号 1674-5817（2023）02-0163-10Recent Advances of Animal Models of Renal Interstitial FibrosisLAI Can1,LI Lele1,HU Tala1,MENG Yan2(1.Graduate School of Inner Mongolia Medical University,Hohhot 010110,China;2.Division of Nephrology,the Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University,Hohhot 010050,China)Correspondence to:MENG Yan(ORCID:0000-0002-9236-5546),E-mail:ABSTRACT Renal interstitial fibrosis is a common pathway in the progression of many renal diseases.Whether it is chronic kidney disease or acute kidney injury that cannot be fully recovered,the progression process mostly enters end-stage renal failure after renal interstitial fibrosis.The animal model of renal interstitial fibrosis is an important research tool for exploring the pathogenesis of renal interstitial fibrosis and new diagnostic and treatment methods.Different animal models have their own characteristics.Researchers can establish different models based on their own experience and experimental purposes,and carry out scientific research on this basis to provide more new methods for the prevention and treatment of kidney diseases.The authors focused on several common animal models of renal interstitial fibrosis to provide the reference for related researchers,including surgical models induced by unilateral ureteral obstruction,ischemia-reperfusion injury,5/6 nephrectomy,and microembolization;chemical models induced by cyclosporine A,adriamycin,aristolochic acid,mercuric chloride（HgCl2）,gentamicin,cisplatin,and adenine;transgenic hybridization and kidney injury molecule 1(KIM-1)induced transgenic modification model;composite model induced by bilateral ischemia-reperfusion injury(BIRI)combined with gentamicin,unilateral nephrectomy combined with angiotensin II(Ang II),and unilateral ischemia-reperfusion injury(UIRI)combined with pLVX-shTNC plasmid.Key words Renal interstitial fibrosis;Animal model;Chronic kidney disease;Acute kidney injury 人类疾病动物模型 Animal Models of Human Diseases基金项目 国家自然科学基金资助项目“组蛋白去乙酰化酶Sirt6通过Wnt/-Catenin信号通路对慢性肾脏病肾性骨病的控制作用及机制研究”（81960143）；内蒙古自治区自然科学基金项目“RNA m6A 甲基化在慢性肾脏病肾小管间质纤维化中的作用及机制研究”（2022MS08063）；内蒙古医科大学“致远”人才计划-“治学”人才项目（ZY0130015）第一作者 赖 灿（1993），男，硕士研究生，研究方向：胃肠疾病、慢性肾脏病。E-mail：通信作者 孟彦（1983），男，博士，副教授，副主任医师，研究方向：慢性肾脏病、血液透析。E-mail：。ORCID：0000-0002-9236-5546163实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative MedicineApr.2023,43(2)肾脏间质纤维化（renal interstitial fibrosis）是各种慢性肾脏病（chronic kidney disease）进展，或急性肾损伤（acute kidney injury）后在肾脏损伤未能完全恢复时转化为慢性肾脏病并进一步发展的重要病理过程之一。人们普遍认为，肾脏间质纤维化是慢性肾脏病进行性进展的关键因素之一，并逐渐改变肾脏基础生理结构1-2。细胞外基质在肾间质中过度聚集、肾小管的萎缩，以及各种炎性细胞浸润、肾小管上皮细胞和肾脏间质成纤维细胞向肌成纤维细胞的转分化，都是肾脏损伤的典型病变特征，并且肾脏纤维化过程不可逆转1，3-5，最终患者不可逆地走向肾功能衰竭，正常工作生活被严重干扰，社会经济负担也因此增加。慢性肾脏病是导致非传染性疾病发病和死亡的重要因素6，据 全 球 疾 病 负 担（global burden of disease，GBD）数据统计，2017 年全球慢性肾脏病患病率达9.1%。肾脏间质纤维化产生机制复杂，一直以来各种动物实验研究对于揭示肾脏间质纤维化的病理特征和分子机制都起到至关重要的作用。因此，选择构建较理想的肾脏间质纤维化动物模型，对研究肾脏间质纤维化的发生机制、诊断、防治以及延缓其进一步发展等都有着非常重大的意义。目前，肾脏间质纤维化主要动物模型包括手术诱导模型、药物诱导模型、转基因修饰模型、复合模型。每个模型各有其特点，以适用不同的实验要求，下文就其特点逐一展开描述分析。1手术诱导的肾脏间质纤维化模型手术类诱导的动物模型是通过手术方式减少或阻断肾脏组织参与正常的代谢过程，使肾脏组织被动失代偿，从而构建肾脏间质纤维化动物模型。其主要有三种经典模型，即单侧输尿管梗阻模型、缺血-再灌注模型和肾大部切除模型，以及它们的一些改进型。除此之外，还有肾微栓塞加部分肾切除的手术模型。1.1单侧输尿管梗阻模型单侧输尿管梗阻模型广泛应用于梗阻性肾脏疾病的研究，是目前研究肾脏间质纤维化的经典模型之一。造模方法：大鼠腹腔注射麻醉，在左肾门附近切开腹腔，分离并结扎左输尿管，然后闭合腹腔。结扎术后2周，检测发现其血肌酐（blood creatinine，Scr）和血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）水平较对照组明显升高7。结扎肾因尿流受阻、压力升高引起缺血缺氧，导致肾小管间质损伤。单侧输尿管梗阻模型的主要特点是肾小管扩张、间质增生、近端肾小管大量损伤、肾脏积水、白细胞浸润、肾小管上皮细胞死亡以及成纤维细胞增生8，从而导致肾脏瘢痕形成，间质纤维化。单侧输尿管梗阻模型建立的优势是：操作较为简单，技术成熟；周期短，肾结扎术后一周可发生肾脏间质纤维化；存活率高，可操作空间大。除经典的单侧输尿管梗阻模型外，可逆性单侧输尿 管 梗 阻（reversible unilateral ureteral obstruction，RUUO）模型9-13以及改进型RUUO模型9，12也有研究者在探索应用。如Song等9，12用小鼠先建立单侧输尿管梗阻模型，术后37 d通过再植方式构建RUUO模型。建立单侧输尿管梗阻模型时，从下腹中线开腹，暴露左输尿管，并在膀胱上方不远处结扎左输尿管两次，两次结扎间隔一段距离，然后离断，关腹；术后3 d或7 d再次从原切口进入腹腔，找到之前左输尿管用7/0黑线结扎的粗大梗阻端，用带侧孔的20 mL注射器针头从膀胱前壁穿透到后壁，同时将之前连接在左输尿管中的线固定在针头侧孔中，然后注射器针头以相反的方向从膀胱中取出；输尿管的末端使用微血管钳固定在膀胱前壁，再用10/0黑线将输尿管末端间断缝合到膀胱后壁，缝合后在其结扎线下方5 mm处的输尿管壁切开一个小口，使尿液从中流出。用输尿管再植加置管方式构建改进型RUUO模型：缝合输尿管到膀胱后壁，并开口见尿液流出，与上述RUUO相同；随后在胰岛素针的引导下，将直径为69 mm的PTFE管推入输尿管腔，其中管口暴露12 mm，在输尿管和聚四氟乙烯管的末端作为一个整体放回膀胱，然后缝合膀胱前壁，用盐水冲洗腹腔后关腹。RUUO模型即在建立单侧输尿管梗阻模型一段时间后解除梗阻，恢复尿路通畅再进行相关研究。RUUO模型主要用于研究尿路梗阻缓解后肾脏结构和功能的恢复情况，更接近临床尿路梗阻疾病的特点9；该模型构建也不复杂，可重复，可靠性高。梗阻后再通的间隔时间需要研究人员根据自己的经验及研究内容进行摸索调整。但近期有研究认为，RUUO后肾功能的快速恢复不能反映肾组织的实际恢复情况，梗阻后诱导形成的慢性肾脏病在恢复时具有组织持续损伤、纤维化和肾单位丢失的特征，但不能反映在肾功能的测量标准中11。1.2缺血-再灌注模型各种因素所致的急性肾损伤是一种可迁延发展为慢性肾脏病却易被忽略的慢性肾脏病病因。缺血性急性肾损伤（ischemic acute kidney injury，IAKI）是急性164实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative MedicineApr.2023,43(2)肾损伤的主要分型，其可致肾脏毛细血管永久性损伤，并向慢性肾衰竭方向进展14，也是导致肾脏缺血-再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）的主要原因之一。IRI 模型包括双侧缺血-再灌注损伤（bilateral ischemia-reperfusion injury，BIRI）模型、单侧缺血-再灌注损伤（unilateral ischemia-reperfusion injury，UIRI）模型、单侧 IRI 加对侧肾切除术（unilateral IRI with contralateral nephrectomy，uIRIx）模型。建立 UIRI 和BIRI模型时，不同实验目的和不同造模动物的具体造模时间差异较大，但其基本路径相同。造模方法：使用血管夹，夹闭小鼠或大鼠的单侧或双侧肾蒂至少10 min，随后松开血管夹以诱导缺血-再灌注损伤，术后16周可成模。Yang等15通过UIRI手术（夹闭左侧肾蒂30 min）2 d后再切除810周雄性BALB/c小鼠对侧肾脏，术后23 d建立uIRIx模型，用以模拟急性肾损伤。其研究表明，肾损伤后近端肾小管G2/M细胞周期的停滞导致促纤维化因子的异常扩增，也是急性肾损伤与慢性进行性纤维化肾病之间的机制联系。短时间夹闭肾蒂可模拟急性肾损伤，以及急性肾损伤后向慢性肾脏病的演化探究。长时间夹闭肾蒂可直接形成肾脏纤维化，如左侧肾蒂夹闭50 min后松开恢复血供，术后10周肉眼可见SD大鼠肾脏体积增大，肾脏表面不再光滑，粗糙呈颗粒样、凹凸不平，肾脏组织明显纤维化16。目前有学者认为，急性肾损伤后肾脏功能不能完全恢复，也称适应性不良修复，可导致肾脏长期功能缺陷并逐渐演化成慢性肾脏病17-19。研究表明，UIRI可用作研究急性肾损伤发展为慢性肾脏病过程的合适动物模型，纤维化相关基因（如ColI、TGF、CCN2、CCN3）的表达量随着缺血持续时间和实验中动物核心体温的增加而增多20。无论哪种模型，严格控制肾缺血的时间至关重要。研究者可依据研究对象及目的进行调整，模拟出相似病情的肾脏纤维化演化路径及其结果并对之进行研究。但IRI模型操作复杂20-21，可重复性差，尤其是BIRI模型控制难度大。uIRIx模型对缺血程度有较高的耐受性，常用于长期模型的建立。1.3肾大部切除模型肾大部切除（5/6 nephrectomy，5/6Nx）模型造模方法：小鼠或大鼠麻醉后，切去左肾外缘及其上下两极共约2/3组织，约1周后再切除右肾，术后残留约1/6肾组织。由于术后残肾血流量骤降，肾间质代偿性增殖，系膜细胞和系膜基质增生，从而引起肾小球硬化，以及相应的肾小管灶状萎缩减少，最后形成肾脏间质纤维化22，其Scr、BUN和尿蛋白水平均显著升高。该模型的建立技术已经比较成熟，成功率较高，故目前5/6 Nx模拟人类肾功能损失后的肾衰竭动物模型已广泛应用于慢性肾脏病研究。此外，改良的5/6 Nx模型23-24也有应用，具体造模方法：手术结扎左肾上下极，1周后切除右肾。相较于传统的5/6 Nx模型，该方法具有更省时、出血少、存活率更高、重复性好的特点24。近期有研究者探究出存活率更高的基于结扎的 5/6 肾切除手术（5/6 nephrectomy based on ligation，l-PNx）新模型，具体的造模方法：手术切除小鼠右肾1周后直接结扎左肾上下极，导致结扎的左肾上下极坏死25。l-PNx模型术后4周及12周的总体病理表现比传统的5/6Nx模型更严重，大鼠肾脏-平滑肌肌动蛋白（-smooth muscle actin，-SMA）、转 化 生 长 因 子-（transforming growth factor-，TGF-）、胶原蛋白和胶原蛋白表达水平更高，在研究慢性肾脏病的肾纤维化方面更有优势25。1.4其他手术模型除上述较为经典的3种模型外，Kimura等26在1999年建立了微栓塞导致的进行性慢性肾衰竭大鼠模型，其造模方法：戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉12周龄大鼠后取下右肾，随后通过左肾动脉尾部注射丙烯酸微球（直径2030 m），注射时夹闭主动脉尾部、肠系膜前动脉和腹腔动脉，以确保微球流入左肾动脉；这些丙烯酸微球阻塞了血管极附近的肾小球前小动脉和肾小球内毛细血管，导致血压升高，术后212周可诱导尿白蛋白排泄量、Scr和血总胆固醇浓度增加，血清白蛋白则降低，后期可见肾小管基底膜增厚、管腔扩张和肾脏间质纤维化等病理改变26。近期Bersani等 27 修改了Kimura等 26 的模型，其造模方法：110120日龄大鼠经腹膜内注射硫喷妥钠（45 mg/kg）麻醉后进行腹腔镜手术，夹闭腹腔、肠系膜、对侧肾脏和主动脉远端区域，以保证血流仅在左肾动脉中流动，在左肾动脉口前的区域滴注含有聚甲基丙烯酸甲酯微球（直径 2027 m）的生理盐水（0.8 mg/0.2 mL），随后切除右肾；术后30、60、90 d进行验证，分析不同肾病进展阶段血管、肾小球、肾小管和间质的表现。在此基础上，可发展用于评价药物的长期效果及其不良反应。肾微栓塞引起的早期血管损伤可能是实验模165实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative MedicineApr.2023,43(2)型中慢性肾脏病进展的重要触发阶段，且该模型有很好的重复性27。2药物诱导的肾脏间质纤维化模型在生活与医疗环境中接触和使用环孢素A、阿霉素、庆大霉素、马兜铃酸、顺铂、腺嘌呤、汞及其化合物，以及血管紧张素（angiotensin，Ang）、叶酸、镇痛药、酪氨酸等一系列化学物质均可使肾脏间质产生不同程度的纤维化。因此，药物诱导的肾脏间质纤维化模型主要有环孢素A模型、阿霉素模型、马兜铃酸模型、氯化汞模型、庆大霉素模型、顺铂模型、腺嘌呤诱导高尿酸肾病模型等。下文具体描述各模型特征。2.1环孢素A模型环孢素 A（cyclosporine A）模型是由 Rosen 等28用皮下注射环孢素A的方式所构建的一种慢性肾脏毒性动物模型。造模方法：大鼠或小鼠腹腔注射环孢素A（1540 mgkg-1d-1），持续约24周29-30。用药后可通过检测大鼠肾病理改变及其BUN、Scr等水平变化来检验造模情况。环孢素A是由十一个氨基酸组成的环状多肽，其作为一种强效免疫抑制剂，目前在临床上多使用于肝脏、心脏、肺、肾等器官移植术后，在一定程度上可提高患者的生存率。肾脏毒性是环孢素A最主要的不良反应，长期使用环孢素A后可表现为肾脏机能的进行性降低，以及肾小管和肾血管等组织的不可逆损伤29-31。环孢素A引起肾脏间质纤维化的主要过程是肾小血管收缩，肾小管基底膜萎缩，上皮细胞损伤变性、坏死等，肾间质炎症，肾慢性缺血，成纤维细胞迁移并释放出大量的细胞外基质，从而促使纤维化的发生发展29-35。但该模型制作费用昂贵，且环孢素A具有肝毒性，在一定程度上影响了该模型的可靠性，限制了其应用，故环孢素A模型更适用于肝肾纤维化复合损伤模型。2.2阿霉素模型阿霉素（adriamycin）造模方法：大鼠尾静脉注射阿霉素（212 mgkg-1d-1），约27周。有部分研究者在该模型上对药物作用进行评估36-37，但由于阿霉素的毒性高，若注射时有溢出或渗透出血管外，易导致周边组织损伤坏死、溃烂、炎症等，影响数据的判断。而且目前对于阿霉素模型缺乏较为统一的评判标准，各研究者使用的造模方法及其评价指标不太一致。阿霉素是一种抗瘤谱广泛的含醌的蒽环类化学治疗药物。它经由肾脏代谢后被还原成半醌型自由基，并在各类脂质介质影响下引发肾小球损伤，逐渐发展形成肾病综合征，并逐步恶化，导致肾小管萎缩、肾间质炎症，最终形成肾纤维化。研究表明，阿霉素模型在用于模拟人类罹患微小病变性肾病综合征和局灶节段性肾小球硬化型肾病综合征后所发展的肾脏纤维化模型具有比较高的可靠性36-39。目前有研究者在阿霉素模型的基础上，结合代谢组学、生物信息学、网络药理学等，探索肾脏疾病的可能作用机制及其潜在生物学靶点36，40-41。其研究结果 表 明，左 旋 肉 碱、溶 血 磷 脂 酰 胆 碱（lysophosphatidylcholine，LysoPC）（203）、鞘磷脂（sphingomyelin，SM）（d181/160）等22种代谢物与肾损伤相关41；修复性脂质介质合成中间体（14S-hydroxy-docosahexaenoic acid，14S-HDHA）、二吡啶甲酸（dipicolinic acid，DPA）、二 十 二 碳 六 烯 酸（docosahexaenoic acid，DHA）等7种代谢物与早期肾损伤有关，而色氨酸、亚油酰肉碱、LysoPC（183）等12种代谢物则反映了晚期肾病36。2.3马兜铃酸模型马兜铃酸（aristolochic acid）造模方法：小鼠腹腔注射马兜铃酸（2.53 mg/kg），每周 12 次，持续410周42-43。小鼠腹腔注射马兜铃酸后，体质量显著减少，出现肾萎缩、肾功能下降和肾小管间质纤维化，并且诱导肾纤维化相关基因的表达水平升高，加快细胞衰老、线粒体功能障碍及其肾脏中活性氧（reactive oxygen species，ROS）的积累，降低肾脏抗衰老基因Klotho的表达42。马兜铃酸是一种硝基菲羧酸，2017年被世界卫生组织列入致癌清单中。这类有机化合物天然存在于马兜铃科植物中，其中有些植物曾被作为中药材参与中药的炮制。不合理或长期服用此类药材可导致肾脏进行性损伤、肾间质炎症、肾间质纤维化等，即马兜铃酸肾病（aristolochic acid nephropathy，AAN）。因此，用马兜铃酸建立的肾病模型用以研究以上病变更符合临床病理特点。马兜铃酸构建的各种肾脏毒性模型，多用以诱导慢性肾脏间质纤维化，也可诱导急性肾损伤疾病、肾间质炎症等。如Wang等44通过连续给C57BL/6小鼠腹腔注射马兜铃酸钠盐（10 mgkg-1d-1）5 d诱导建立以急性肾小管损伤为主要特征的AAN模型。但用马兜铃酸建立的肾脏间质纤维化模型普遍需要8周，造模周期较长，费用较为昂贵。166实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative MedicineApr.2023,43(2)2.4氯化汞模型氯化汞（HgCl2）造模方法：大鼠口服 HgCl2（8 mgkg-1d-1），持续9周45。汞及其化合物的主要靶器官之一是肾脏，除了生活中接触外，人类等高层食物链中也容易聚集，摄入后累积造成肾脏损伤。长期接触或使用HgCl2会产生肾皮质毒性作用，主要表现为肾小球硬化、急性肾小管坏死和肾间质炎性细胞浸润，最终导致肾间质纤维化46。但由于HgCl2的高毒性，剂量把握不当易致大鼠死亡，故造模前进行不同浓度梯度的预实验极为重要。短时间使用高剂量的HgCl2造模可以引起急性肾损伤47，后期可进展为肾脏间质纤维化。2.5庆大霉素模型庆大霉素（gentamicin）造模方法：小鼠或大鼠皮下注射庆大霉素（80 mgkg-1d-1），约 79 d48-49。造模后检测发现大鼠尿量显著增加至对照值的2倍，尿渗透压降低至一半，尿液浓缩功能明显受损，其Scr为6 mg/L，较对照组的2 mg/L明显升高48。庆大霉素是一种氨基糖苷类抗生素，其不良反应主要表现为肾脏毒性，故目前在临床上很少使用，早期多表现为急性肾损伤，尤其在短期大剂量使用庆大霉素时，后期可逐渐进展为肾脏间质纤维化及肾功能障碍等。目前研究认为，大部分急性肾损伤患者临床治愈或病情缓解后会出现肾间质胶原蛋白积累的隐匿过程，部分迁延为慢性肾脏病并最终进展至慢性肾功能衰竭。故现在庆大霉素多用于建立以急性肾损伤为基础的动物模型，并在其基础上进行肾脏间质纤维化及慢性肾脏病的研究。如Huang等48给C57BL/6J小鼠腹膜注射庆大霉素（80 mgkg-1d-1）7 d建立急性肾损伤模型，发现急性肾损伤涉及集合管的程序性坏死，并介导肾功能障碍、炎症和纤维化。Albino等49给雄性Wistar大鼠皮下注射庆大霉素（80 mgkg-1d-1）9 d建立急性肾损伤模型，庆大霉素建模后分别在第1、30和180 d对大鼠进行研究，观察急性肾损伤后向肾纤维化和慢性肾脏病演化过程。2.6顺铂模型顺铂造模方法：小鼠腹腔注射顺铂（18 mg/kg），共一次，3 d后检测发现其Scr、BUN较对照组明显升高50。顺铂作为一种广谱强效抗癌药物，广泛应用于各种肿瘤的联合化疗中。该药物溶于水后，水分子取代其氯离子，从而激活其细胞内生物活化，随后与DNA结合，引起交叉联结，破坏DNA的功能，并抑制细胞有丝分裂，是一种细胞非特异性药物。但顺铂的抗癌作用缺乏特异性，肾毒性是限制顺铂临床应用的关键因素之一。顺铂诱导急性肾损伤产生的标志是近端肾小管细胞的死亡和炎症。癌症患者经过顺铂治疗后有20%40%出现急性肾损伤51。顺铂在肾脏中主要通过线粒体氧化应激、炎症、直接损伤等多种途径促进近端肾小管细胞的损伤、死亡以及凋亡52，其中膜转运蛋白（CTR1、CTR2、ATP7A、ATP7B和OCT2等）在介导细胞摄取顺铂的过程中发挥重要作用53，这种作用因肾脏的排泄功能而被放大。顺铂的肾毒性具有累积性和剂量依赖性54。高剂量或多次累积较大剂量的用药方式均会产生不可逆的肾功能损伤，严重时 甚 至 出 现 急 性 肾 小 管 坏 死、尿 毒 症、肾 衰竭50-51，55。顺铂的毒性较强，且缺乏特异性；因此，该种造模方式难度较大，较难把控剂量，致死率高。2.7腺嘌呤诱导高尿酸肾病模型造模方法：大鼠灌胃腺嘌呤（200 mgkg-1d-1）共4周，随后检测发现其Scr、BUN水平明显较对照组升高；并且肉眼可见肾脏颜色暗黄，表面有明显结晶颗粒状，HE染色见肾小管无序排列56。腺嘌呤是4种核酸碱基之一，广泛存在于体内，其分解代谢终产物是水溶性较差的尿酸。尿酸可影响内皮功能，减少一氧化氮的生成，是诱发高血压的重要介质57。高尿酸血症（hyperuricemia，HUA）诱导的近端肾小管上皮细 胞 中 乳 腺 癌 耐 药 蛋 白（breast cancer resistance protein，BCRP）/三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员 2（adenosine triphosphate combined transport protein G superfamily member 2，ABCG2）表达降低，这可能促进肾小管上皮细胞和肾间质中的尿酸单钠晶体沉积，导致严重的肾脏损伤58。高血压可能是导致亚临床肾损伤的初始触发因素，后续诱发HUA，形成高血压、尿酸升高和肾脏损害的恶性循环59。研究认为慢性肾脏病可提高HUA发生的风险，而HUA又可加速慢性肾脏病的进展60。但Sellmayr等61研究显示，无症状的HUA不会影响慢性肾脏病的进展，除非尿酸在肾脏中结晶，导致慢性尿酸晶体性肾病，后期可形成尿酸晶体性肉芽肿。该晶体会触发M1样巨噬细胞相关的间质炎症和纤维化，加速慢性肾脏病进展。因此，在一定程度上尿酸晶体肉芽肿的形成可作为肾脏间质纤维化模型成功的标志，对应的腺嘌呤摄入剂量与时间是模型制备成功的关键。2.8其他化学诱导模型除了上述这些化学物质诱导模型外，还有血管紧张素模型。血管紧张素作为肾素-血管紧张素-醛167实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative MedicineApr.2023,43(2)固酮系统（renin-angiotensin-aldosterone system，RASS）的关键因子之一，多用以建立高血压肾病相关模型。另外，还有用叶酸、镇痛药、酪氨酸等诱导的肾脏间质纤维化动物模型。3转基因修饰的肾脏间质纤维化模型肾脏间质纤维化往往伴随着一些因子不同程度的异常表达，故研究时可以直接介入相关基因表达通路而验证、模拟类似环境，探索其机制及相关治疗方法。这也是当今表观遗传研究的关键方法。3.1转基因杂交模型Lim 等62利用白喉毒素受体（diphtheria toxin receptor，DTR）在近端肾小管上表达的特点白喉毒素（diphtheria toxin，DT）可介导细胞消融，从而诱导近端肾小管细胞特异性损伤，建立DTR+转基因小鼠；同时利用改良毒素LMB2介导人CD25对肾小球足细胞选择性损伤的特性 其中CD25由肾病蛋白启动子25（nephrin promotor 25，Nep25）驱动，建立 Nep25+转基因小鼠；将两种转基因小鼠杂交后可获得双转基因小鼠（Nep25+/DTR+）和仅具有 Nep25 转基因的小鼠（Nep25+/DTR-）模 型。随 后 Nep25+/DTR+小 鼠 和Nep25+/DTR-小鼠均在第 10、17 周龄先后注射 DT、LMB2，结果发现Nep25+/DTR+小鼠模型具有明显连续的肾小管和肾小球损伤的特点，提示这是一种可用于探究肾小管损伤后肾小球损伤敏感性的新方法。进一步的实验分析表明，即使是轻微的肾小管损伤也会增加随后肾小球损伤的敏感性，肾小管间质损伤和轻微的纤维化在新一轮纤维化启动以及恶化进展中起着关键作用62。3.2肾损伤因子-1(kidney injury molecule 1，KIM-1)模型KIM-1造模方法：转基因诱导肾小管上皮细胞内特异性表达KIM-1的转基因KIM-1RECtg小鼠，共4周。结果显示 KIM-1 可增加促炎性细胞因子（MCP-1、TGF-和IL-6等）、纤连蛋白等的表达，其中MCP-1是KIM-1促进肾脏间质纤维化的重要介质。肾脏损伤后不完全愈合，慢性KIM-1表达将进一步促进肾小管间质炎症发生、毛细血管丢失和缺氧，进一步诱导KIM-1产生，形成缺氧和炎症的恶性循环，最终导致肾小管间质纤维化63-64。KIM-1是一种由肾缺血上调的型跨膜糖蛋白，其持续表达是急性肾损伤转化为慢性肾脏病的标志物，与肾脏间质纤维化的严重程度密切相关。它在健康受试者的尿液中几乎检测不到，但在急性肾小管坏死（acute tubular necrosis，ATN）患者中显著增加65。肾脏损伤后，从急性肾损伤到慢性肾脏病的进展过程中KIM-1、MCP-1等都起着重要作用，这些因子可作为防治及延缓该进程的重要靶点。4肾脏间质纤维化复合模型单纯化学药物或单一手术等方法有时难以建立研究者想要的理想模型，无法模拟较为复杂的疾病环境。一些研究者进而探索多因素作用下的复合动物模型。4.1BIRI术联合庆大霉素模型造模方法：用大鼠先建立BIRI模型（夹闭双侧肾蒂60 min），术后2周，皮下注射庆大霉素（100 mgkg-1d-1）5 d，最终构建肾缺血和肾毒性双重损伤的慢性肾脏病复合模型。造模后检测Scr水平，每2周收集一次血液和尿液样本计算肾小球滤过率（glomeruar filtration rate，GFR），成模1周后即可见Scr明显升高，GFR显著降低。成模20周后免疫细胞化学检测结果显示肾小球硬化和扩张、萎缩性小管66。该模型适合各种因素导致肾缺血后，经肾代偿、失代偿所致的慢性肾脏病研究。该建模方法的观测周期长，但造模难度也大，死亡率高。4.2单侧肾切除联合 Ang模型造模方法：结扎切除小鼠左肾，术后1周再行右肾微渗透泵（内置Ang溶液）植入手术，持续泵入4周；检测发现其Scr、BUN升高，24 h尿蛋白定量明显升高；组织染色可见近曲小管上皮细胞浑浊肿胀，大量的间质细胞浸润，胶原纤维明显增多；结果提示肾脏损伤以及肾脏纤维化67。该模型在高血压与肾损伤的双重作用下，通过单侧肾切除联合AngII加快成模，可作为高血压肾损伤后肾脏间质纤维化模型。研究者可在此基础上探索改进方法，如调整药物剂量与种类、作用时间等，以模拟相似的疾病发展路径。4.3UIRI术联合pLVX-shTNC质粒模型造模方法：小鼠UIRI（夹闭左侧肾蒂2630 min）术后4 d向其尾静脉注射pLVX-shTNC，术后第10天可成模68-69。检测发现其Scr、BUN水平明显升高，肾纤维化相关蛋白（如-SMA、成纤维细胞特异性蛋白-1、波形蛋白、纤连蛋白）表达明显增多，免疫组织化学检测可见明显胶原沉积。研究发现，腱糖蛋白C（tenascin-C，TNC）在正常人的肾脏中检测不到，168实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative MedicineApr.2023,43(2)但它可在各种慢性肾脏病患者的肾组织活检中检测到，证明TNC是致肾纤维化的关键致病因素。TNC可促进急性肾损伤上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT），通过整合素 v6/FAK/ERK-1/2 信号级联激活EMT，从而损害肾小管的完整性68。这是急性肾损伤进展到慢性肾脏病的模型，靶向这种信号级联反应可能是肾纤维化干预治疗的新策略。5结语肾脏疾病是人类常见疾病，其中大部分与肾脏间质纤维化密切相关，构建一个较为理想的肾脏间质纤维化动物模型对于探讨肾脏疾病的发生、发展机制极为重要。近年来随着技术的进步与应用，研究者对肾脏间质纤维化动物模型的构建方法越来越成熟，除了构建经典的手术、化学模型外，还偏向于结合研究对象的特征设计构造出有一定特异性的新模型。目前，各种复合模型、基因表达修饰模型等新型模型越来越多，每种模型各有其特点以及一定的适用范围。2009 年，单 细 胞 RNA 测 序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）技术首次问世，近年获得了爆炸式的发展。与传统的二代测序技术如RNA-seq等仅能检测一群细胞转录组的平均水平不同，scRNA-seq技术可在细胞水平上对基因组、转录组及表观基因组水平进行测序分析。scRNA-seq技术更能发现细胞在不同时间（生长周期）、空间（细胞位置）环境下的基因表达特性，对细胞生理与病理的机制探究更深刻。以上模型建立后，检测验证相关基因表达水平相较于scRNA-seq缺乏相关模型演变进展的层次分析，若能结合该技术检测动物模型在不同病变阶段的表达特异性，将更能发现其内在病变机制，扩大其研究成果的深度。肾脏疾病的复杂的病情及病理生理机制促使研究者不断改进已有的各种动物模型，研究探索新模型，以建立更为稳定可控、与疾病环境更相似的模型。这将促进对肾脏间质纤维化治疗药物的疗效评价、发生发展机制的探索以及新药研发。作者贡献 Author Contribution 赖灿负责方案策划、初稿写作；李乐乐负责提供资源；胡塔拉负责项目管理；孟彦负责论文把关和修订。利益声明 Declaration of Interest 所有作者均声明本文不存在利益冲突。参考文献References1LIU X Y,ZHANG X B,ZHAO Y F,et al.Research progress of Chinese herbal medicine intervention in renal interstitial fibrosisJ.Front Pharmacol,2022,13:900491.DOI:10.3389/fphar.2022.900491.2SZETO H H.Pharmacologic approaches to improve mitochondrial function in AKI and CKDJ.J Am Soc Nephrol,2017,28(10):2856-2865.DOI:10.1681/ASN.2017030247.3ZEISBERG M,KALLURI R.Physiology of the renal interstitiumJ.Clin J Am Soc Nephrol,2015,10(10):1831-1840.DOI:10.2215/CJN.00640114.4