红景天苷对近视豚鼠脉络膜厚度及HIF-1α和多巴胺及其受体表达的影响.pdf

实验论著红景天苷对近视豚鼠脉络膜厚度及 和多巴胺及其受体表达的影响赵 爽房祥杰张娟美赵 军许莞菁郑凌方付艺璇引用:赵爽房祥杰张娟美等.红景天苷对近视豚鼠脉络膜厚度及 和多巴胺及其受体表达的影响.国际眼科杂志():基金 项 目:临 沂 市 人 民 医 院 研 究 生 培 养 基 金 项 目(.)作者单位:()中国山东省济南市山东第一医科大学()中国山东省临沂市人民医院眼科()中国山东省青岛市青岛大学()中国山东省潍坊市潍坊医学院()中国辽宁省锦州市锦州医科大学作者简介:赵爽在读硕士研究生研究方向:白内障、玻璃体视网膜疾病通讯作者:张娟美博士副主任医师硕士研究生导师研究方向:白内障、玻璃体视网膜疾病.收稿日期:修回日期:摘要目的:探讨红景天苷()对透镜诱导型近视()豚鼠脉络膜厚度及缺氧诱导因子()、多巴胺及其 受体表达的影响方法:将 只 周龄豚鼠随机分为正常对照()组、组和透镜诱导型近视红景天苷()组每组 只 组正常饲养给予/生理盐水灌胃 组豚鼠右眼前配戴 透镜建立近视模型给予/生理盐水灌胃 组豚鼠右眼前配戴 透镜同时给予/红景天苷(/)灌胃 造模 后测量各组豚鼠右眼屈光度、眼轴长度及脉络膜厚度通过实时荧光定量()和免疫组织化学()检测各组豚鼠右眼脉络膜视网膜 及蛋白表达量通过酶联免疫吸附实验()和 法检测多巴胺浓度及其 受体表达量结果:造模 后与 组比较 组和 组豚鼠右眼屈光度均负向增加眼轴均延长脉络膜厚度均减小脉络膜视网膜 和蛋白表达量均增加多巴胺浓度及其 受体表达量均降低与 组比较 组豚鼠右眼近视屈光度明显减小眼轴长度较短脉络膜厚度增加脉络膜视网膜 和蛋白表达量均降低多巴胺浓度及其 受体表达量均增加结论:红景天苷干预近视豚鼠可通过影响脉络膜厚度及、多巴胺及其 受体的表达延缓近视进展关键词:红景天苷透镜诱导型近视脉络膜缺氧诱导因子()多巴胺:./.:(.):.:()()().:()()././.()().国际眼科杂志 年 月 第 卷第 期 :/.电话:电子信箱:.().:.:.:():.()():引言近视作为一种最常见的屈光不正主要表现为远视力下降近年来发病率不断上升到 年 等预计全球将有.亿近视患者和.亿高度近视患者基因和环境两大因素通过控制眼轴增长影响近视的形成和发展 目前研究显示在近视发展过程中巩膜组织缺氧引起缺氧诱导因子 ()等表达增加促进巩膜重塑及眼轴增长而多巴胺()及其受体在调节眼球屈光状态发育中也起到重要作用 因此抗氧化应激药物和针对多巴胺及其受体的药物可能是未来控制近视进展的有效选择 红景天苷是一种从传统中药大株红景天中提取出的化合物具有抗氧化应激及下调 表达等作用主要应用于心血管系统、神经系统和肿瘤等疾病 目前国内学者使用红景天苷对形觉剥夺型近视豚鼠模型进行干预结果证明红景天苷可抑制近视模型豚鼠 表达的上调减缓实验性近视进展而不影响豚鼠正常眼的生长 红景天苷对近视的具体作用机制尚不明确需要进一步实验进行验证 本研究旨在探讨红景天苷对透镜诱导型近视豚鼠脉络膜厚度及、多巴胺及其 受体表达的影响 材料和方法.材料.实验动物 选取 周龄雌性健康三色豚鼠 只体质量 购自湖北中医药高等专科学校实验动物中心许可证号:(鄂)入组前实验动物进行双眼检查排除角膜病变、白内障、眼底病变等 饲养条件:室温 空气相对湿度 予 光照光照强度 黑暗循环 实验期间所有豚鼠自由摄食、进水并提供富含维生素的饲料及新鲜蔬菜等以补充维生素 本研究动物使用经临沂市人民医院伦理委员会审批同意(伦审号:)实验中严格遵守视觉与眼科动物研究协会()关于动物的处理原则.主要试剂及仪器主要试剂:复方托吡卡胺滴眼液(沈阳兴齐眼药股份有限公司).盐酸丙美卡因滴眼液(比利时.公司)体积分数.戊二醛溶液(国美集团化学试剂有限公司)抗体()免疫显色试剂 羊抗鼠/兔二抗试剂(通灵生物)显色试剂盒()多巴胺检测试剂盒(优尔生)兔单抗()()红 景 天 苷(源 叶)主要仪器:眼科/型超声测量仪(天津迈达)带状光检影镜(苏州六六视觉科技股份有限公司)镜片箱(丹阳医疗器械厂)病理切片机(德国 公 司)生 物 组 织 摊 烤 片 机(武 汉 俊 杰)抗原修复用电陶炉()显微镜(奥林巴斯)包埋机(武汉俊杰).方法.模型建立及分组将 只 周龄健康三色雌性豚鼠随机分为正常对照()组、透镜诱导型近视()组、红景天苷透镜诱导型近视()组 组每组 只适应性饲养 后开始豚鼠 模型的建立剃除右眼眶周体毛在右眼前粘贴镜片实验过程中每天检查镜片是否脱落及模糊如果脱落则及时粘贴上并进行镜片清洗护理 组不做特殊干预仅给予/生理盐水灌胃 组在右眼前粘贴 透镜诱导给予/生理盐水灌胃 组在右眼前粘贴 透镜诱导的同时给予/红景天苷药剂灌胃剂量为/干预持续 随后腹腔注射过量戊巴比妥钠实施安乐死各组随机选取 只豚鼠取右眼眼球进行石蜡包埋切片另外 只豚鼠取右眼眼球置于冰块上沿角膜缘环形剪开眼球去除眼前节组织、玻璃体及巩膜后于冰箱中保存.各组豚鼠屈光度及眼轴长度测量 所有豚鼠在造模前造模 后使用复方托吡卡胺滴眼液充分散大右眼瞳孔采用带状光检影镜在暗室条件下行检影验光取水平和垂直两条主子午线检验的平均值作为屈光度每只眼连续测量 次取平均值记录每只豚鼠右眼的屈光度 以.盐酸丙美卡因滴眼液进行双眼表面麻醉使用眼科 型超声诊断仪测量右眼眼轴长度仪器参数设置为前房传播速度/玻璃体传播速度/晶状体传播速度/测量时探头对准瞳孔垂直于角膜平面不对角膜造成压迫得到清晰稳定且晶状体后囊膜和视网膜双峰均高于基线的图像时记录确认测量 次取平均值.各组豚鼠脉络膜厚度测量 选取每组已经制作出的部分眼球石蜡包埋切片依次行苏木素染液染色、返蓝和伊红染液染色接着梯度乙醇脱水、二甲苯透明风干后中性树胶封片固定显微镜下观察切片染色情况 每张切片于光镜下从后极部中央向两边连续取 个视野在 .:/.:.图像分析系统下测量脉络膜厚度每个视野测量 次取平均值.检测脉络膜视网膜 相对表达水平 从已冻存的每只眼的脉络膜视网膜组织中提取部分组织采用 法提取 逆转录得到 通过实时荧光定量()技术检测 的相对表达量选取 为内参基因 引物序列:上游引物:下游引物:大小为 上游引物:下游引物:大 小 为 采 用法计算目的基因的相对表达量将 组目的基因的相对表达量设置为.检测脉络膜视网膜 蛋白表达选取每组已经制作出的部分眼球石蜡包埋切片抗原修复后行脉络膜视网膜 免疫组织化学()检测一抗为()二抗为免疫显色试剂 羊抗鼠/兔二抗试剂 使用相同来源的样品做不加抗体的空白对照实验过程中控制染色时间一致减少染色程度不同引起的差异 染色后的切片显微镜下观察拍照使用 .软件对 照片进行光密度分析每张切片选取 张 倍照片分析光密度.检测脉络膜视网膜多巴胺浓度 从已冻存的每只眼的脉络膜视网膜组织中提取部分组织用预冷的./(.)冲洗称重后将组织剪碎然后按 的重量体积比加入 到研磨器中充分冰浴研磨 最后将匀浆液 /离心 取上清检测组织样本采用多巴胺检测试剂盒进行酶联免疫吸附实验()检测酶标仪测定吸光度(值)使用 软件进行拟合制作标准曲线按照标准曲线的公式结合检测结果计算多巴胺表达水平.检测多巴胺 受体蛋白相对表达水平 从已冻存的每只眼的脉络膜视网膜组织中提取部分组织剪碎匀浆加裂解液后于冰上裂解提取总蛋白采用 试剂盒测定各样本蛋白浓度将提取的蛋白上清按照 体积比与蛋白上样缓冲液混合沸水浴 变性变性完后冷却至室温再放入冰箱保存 使用 制备电泳胶电泳分离蛋白先恒压 电泳至溴酚蓝指示剂在浓缩胶与分离胶交界处成线状再改为恒压 直至溴酚蓝到凝胶底部随后转移到 膜上用含 脱脂奶粉的(封闭液)浸泡 膜室温摇床封闭 不同的目的蛋白条带用对应的一抗稀释液(小鼠单抗 以 稀释兔单抗 以 稀释)中孵育过夜 稀释相应的 标记二抗()室温摇床孵育 洗去多余二抗后进行显影曝光用 .软件分析胶片灰度值统计学分析:应用 .软件进行统计学分析符合正态分布且方差齐的计量资料采用均数标准差()表示各组变量间的比较采用单因素方差分析()不同组间两两比较采用 检验 当.)造模 后与 组比较 组和 组豚鼠右眼近视屈光度均明显增加(均.)且与 组比较 组豚鼠右眼近视屈光度减小(.)造模 后与 组比较 组和 组豚鼠右眼眼轴长度均延长差异均有统计学意义(均.)且与 组比较 组豚鼠右眼眼轴长度较短(.)见表.各组豚鼠脉络膜厚度比较 染色结果显示造模 后 组、组和 组豚鼠右眼脉络膜厚度分别为.、.、.差异有统计学意义(.)与 组比较 组豚鼠右眼脉络膜厚度减小差异有统计学意义(.)与 组比较 组豚鼠脉络膜厚度增加差异有统计学意义(.)见图.各组豚鼠脉络膜视网膜 相对表达量 检测结果显示造模 后 组、组和组豚鼠右眼脉络膜视网膜 相对表达量分别为.、.、.差异有统计学意义(.)与 组比较组和 组豚鼠右眼脉络膜视网膜 相对表达水平均增加差异有统计学意义(均.)与 组比较 组豚鼠右眼脉络膜视网膜 相对表达水平减少差异有统计学意义(.).各组豚鼠脉络膜视网膜 表达比较 染色结果显示造模 后 组、组和 组豚鼠右眼脉络膜视网膜 平均光密度值分别为.、.、.差异有统计学意义(.)与 组比较 组和 组豚鼠右眼脉络膜视网膜 表达均明显增加差异有统计学意义(均.)与 组比较 组豚鼠右眼脉络膜视网膜 表达降低差异有统计学意义(.)见图 表 各组豚鼠造模前后屈光度和眼轴长度比较组别造模前屈光度()眼轴长度()造模 后屈光度()眼轴长度()组.组.组.注:.组.组国际眼科杂志 年 月 第 卷第 期 :/.电话:电子信箱:.各组豚鼠脉络膜视网膜多巴胺浓度比较 检测结果显示造模 后 组、组和 组豚鼠右眼脉络膜视网膜多巴胺浓度分别为.、.、./差异有统计学意义(.)与 组比较 组和 组豚鼠右眼脉络膜视网膜多巴胺浓度均明显降低差异有统计学意义(均.)与 组比较 组豚鼠右眼脉络膜视网膜多巴胺浓度增加差异有统计学意义(.).各组豚鼠脉络膜视网膜多巴胺 受体相对表达量 检测结果显示造模 后 组、组和 组豚鼠右眼脉络膜视网膜多巴胺 受体相对表达量分别为.、.、.差异有统计学意义(.)见图 与 组比较 组和 组豚鼠右眼脉络膜视网膜多巴胺 受体表达均明显降低差异有统计学意义(均 .)与 组比较 组豚鼠右眼脉络膜视网膜多巴胺 受体表达增加差异有统计学意义(.)讨论由于豚鼠屈光状态及近视化机制与人类相似出生时为远视眼出生后前 眼轴增长迅速直至 时屈光状态趋于稳定因此常用于近视模型的制作豚鼠 模型已在近视实验研究中得到广泛应用 目前研究认为巩膜缺氧重塑、视网膜多巴胺含量和脉络膜血流及厚度在近视的进展中发挥重要作用 脉络膜是位于视网膜和巩膜间的血管化组织除了为视网膜外层供应营养、调节眼压及眼部温度、分泌生长因子外还可以通过厚度的改变 影响近视的发生发展进程 本研究参考既往实验设计针对红景天苷剂量进行了预实验分别应用、/不同剂量的红景天苷以灌胃方式给药经摸索后发现/()浓度在具有较理想实验效果的同时无明显副作用 正式实验在近视诱导过程中给予/()红景天苷灌胃进行干预结果显示与 组相比 组眼轴长度增加屈光度负向增加脉络膜厚度降低这与既往研究结果一致而 组相较于 组眼轴长度和屈光度降低、脉络膜厚度增加差异具有统计学意义表明红景天苷可以通过延缓眼轴增长及增加脉络膜厚度影响近视的发生发展进程缺氧诱导因子()是一种有转录活性的核蛋白具有相当广泛的靶基因谱包括与缺氧适应、炎症发展及肿瘤生长等相关的近 种靶基因 亚基作为 的活性亚基受缺氧信号的调控并能调节的活性 实验性近视能选择性地诱导 表达增加而抗氧化应激药物可下调 延缓近视进展 信号通路在超高度近视患者中显著富集因此可以认为近视的发展是通过 信号通路的激活来启动的 多巴胺的含量与近视高度相关其变化规律与近视转归程度高度一致 多巴胺、类受体具有相互拮抗、共同平衡调节眼球屈光状态发育的作用 在眼球发育过程中多巴胺信号发挥重要作用动物实验发现向玻璃体内注射多巴胺受体激动剂可以抑制近视进展 因此本研究选择、多巴胺及其 受体作为主要观察指标结果显示随近视程度进展与 组相比 组豚鼠右眼脉络膜视网膜 和蛋白 图 光学显微镜下观察各组豚鼠脉络膜厚度:组:组:组图 各组豚鼠脉络膜视网膜 表达:组:组:组 蓝色为细胞核棕黄色或棕褐色为目标蛋白阳性表达图 检测多巴胺 受体蛋白相对表达量 .:/.:.表达水平明显增高多巴胺浓度及其 受体蛋白表达水平降低 目前近视的控制手段多样户外活动能有效减缓近视的发生更有效的方法还有角膜塑形术、配戴软性双焦点角膜接触镜和使用抗胆碱药物阿托品等 然而迄今为止尚无具有足够的安全性和临床可接受性的方法能有效预防和控制近视 红景天苷具有抗氧化应激、抗炎及抑制凋亡等药理活性临床研究主要集中于阿尔茨海默病、帕金森病等神经系统疾病及肺动脉高压等呼吸系统疾病在护肝、抗肿瘤、抗病毒等方面也有应用 红景天苷抗氧化应激机制主要作用于/通路临床上应用红景天复方制剂多血康治疗高原红细胞增多症的疗效确切其有效性在大鼠模型中也得到了证实可能与下调促红细胞生成素()、表达有关 关于阿尔茨海默病的研究显示红景天苷通过降低 蛋白水平减少淀粉样前体蛋白的异常加工 帕金森病是一种中枢神经系统退行性疾病在疾病进展过程中神经细胞氧化与抗氧化平衡被打破大量活性氧生成进而诱导细胞凋亡主要特点为脑黑质致密部的多巴胺能神经元功能下降红景天苷除了减轻细胞内氧化反应、抑制细胞凋亡外还能刺激间充质干细胞分化为多巴胺能神经元对帕金森病进程起改善作用 国内学者通过在豚鼠眼周注射红景天苷观察到高剂量的红景天苷可显著抑制眼轴和玻璃体腔的延长抑制近视模型组 表达上调减缓实验性近视进展而不影响正常眼的生长故认为红景天苷可通过抗氧化应激机制抑制近视进展 本研究中红景天苷采用灌胃方式在近视造模过程中连续给药 研究红景天苷的抗缺氧机制同时进一步对造模后各组豚鼠脉络膜视网膜中多巴胺含量进行比较 红景天苷对近视作用的具体机制尚不明确需要进一步实验进行验证推测红景天苷可通过抗氧化应激机制控制近视进展也可通过提高多巴胺及其 受体表达对眼球屈光状态发育起调节作用 此外本研究结果证实红景天苷可减缓近视过程中脉络膜厚度的下降下调脉络膜视网膜 和蛋白表达水平增加多巴胺浓度及其 受体的表达从而延缓近视的发展进程 然而红景天苷干预改善缺氧的具体机制尚未明确脉络膜和视网膜各组织中 及多巴胺相关因子的差异性表达尚不明确对多巴胺及其受体的作用通路仍需进一步探索 关于红景天苷对豚鼠近视模型作用的研究可能为近视的预防和控制提供新的思路与方法参考文献 .():.:邓宇 訾迎新 秦亚丽 等.多巴胺及其受体对形觉剥夺近视发展的影响.国际眼科杂志():.:.:.:.():.():.:.():.():.():.():.().():瞿佳 李瑾.近视眼发生和发展机制研究的新进展.中华眼科杂志():韩聪 杨义 张文芳.近视与脉络膜厚度的相关性.国际眼科杂志():郑涛.红景天苷改善胰岛素抵抗的作用及其机制.华中科技大学 .:.:.():.:.():.:.():./.():.:.:国际眼科杂志 年 月 第 卷第 期 :/.电话:电子信箱:.