脑动脉瘤破裂出血后脑脊液中miRNA-3177-3p与脑血管痉挛的发病关系及临床意义.pdf

2023 年 6 月Vol.50 No.3第 50 卷 第 3 期Jun.2023国际神经病学神经外科学杂志Journal of International Neurology and Neurosurgery脑动脉瘤破裂出血后脑脊液中miRNA-3177-3p与脑血管痉挛的发病关系及临床意义翁传波1,2，江涛1,2,3，张洋4，刘师林4，江录伟1,2，王绪扣1,21.安徽医科大学第一附属医院神经外科，安徽 合肥 2300412.安徽省公共卫生临床中心神经外科，安徽 合肥 2300413.安徽省转化医学研究院，安徽 合肥 2300314.安徽医科大学第二附属医院神经外科，安徽 合肥 230031摘要：目的测定动脉瘤性蛛网膜下腔出血（aSAH）后脑血管痉挛（CV）患者与脑血管未痉挛患者脑脊液中miRNA-3177-3p的表达情况，探讨其与CV的发病关系及临床意义。方法将29例aSAH患者分成脑血管痉挛组（CV组）与脑血管未痉挛组（non-CV组）。比较两组患者的一般临床资料；通过生物信息数据分析确定miRNA-3177-3p作为研究对象，测定两组患者脑脊液中miRNA-3177-3p实际表达情况并比较差异；预测miRNA-3177-3p下游靶基因ATP1B3，构建ATP1B3质粒，双萤光素酶报告实验验证miRNA-3177-3p与ATP1B3靶向关系；最后，ELISA法测定两组患者脑脊液中ATP1B3转录产物ATP13含量并比较差异。结果CV组患者Hunt评级高于non-CV组（P0.05）；CV组脑脊液中miRNA-3177-3p表达丰度为（0.8730.044），与non-CV组（0.9080.034）比较，差异有统计学意义（t=2.157，P=0.040）；双萤光素酶报告实验结果显示，与miRNA-3177-3p作用后，ATP1B3-3UTR 区相较对照组活性降低 15%（P0.05）；将 ATP1B3-3UTR 区进行突变，ATP1B3-3UTR 区相较突变前活性上升 14%（P0.05）；ELISA法证实表达产物ATP13在CV组脑脊液中（1.7760.013）ng/mL高于non-CV组（1.7220.016）ng/mL（t=7.778，P=0.000）。结论CV患者脑脊液中miRNA-3177-3p表达下调，ATP1B3高表达可能参与了CV的发病过程，该机制可能在预测与治疗CV上具有一定临床意义。国际神经病学神经外科学杂志,2023,50(3):6-11关键词：动脉瘤破裂出血；脑血管痉挛；微小核糖核苷酸；脑脊液中图分类号：R651.1 DOI:10.16636/ki.jinn.1673-2642.2023.03.002Association of miRNA-3177-3p in cerebrospinal fluid with cerebral vasospasm after aneurysmal subarachnoid hemorrhage and its clinical significanceWENG Chuanbo1,2，JIANG Tao1,2,3，ZHANG Yang4，LIU Shilin4，JIANG Luwei1,2，WANG Xukou1,21.Department of Neurosurgery，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei，Anhui 230041，China2.Department of Neurosurgery，Anhui Public Health Clinical Center，Hefei，Anhui 230041，China3.Anhui Provincial Institute of Translational Medicine，Hefei，Anhui 230031，China4.Department of Neurosurgery，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei，Anhui 230031，ChinaCorresponding author：JIANG Tao，Email：jiangtao_Abstract：ObjectiveTo investigate the association of miRNA-3177-3p with cerebral vasospasm（CV）and its clinical significance by measuring the expression of miRNA-3177-3p in cerebrospinal fluid（CSF）in patients with or without CV after aneurysmal subarachnoid hemorrhage（aSAH）.MethodsA total of 29 aSAH patients were divided into CV group and non-CV group.General clinical data were compared between the two groups；miRNA-3177-3p was determined as the 论著 基金项目：安徽医科大学校科研基金项目（2019xkj067）；安徽省转化医学研究院科研基金项目（2021zhyx-C72）。收稿日期：2022-05-17；修回日期：2023-03-23作者简介：翁传波（1988），男，神经外科主治医师，硕士学位，主要从事神经外科基础与临床相关研究，Email:。通信作者：江涛（1976），男，神经外科主任医师，博士学位，主要从事神经外科（特别是脑血管病）基础与临床相关研究，Email:jiangtao_。电子、语音版62023，50（3）翁传波，等：脑动脉瘤破裂出血后脑脊液中miRNA-3177-3p与脑血管痉挛的发病关系及临床意义http:/target miRNA after integrated bioinformatics analysis，and the expression of miRNA-3177-3p in CSF was measured and compared between the two groups；after ATP1B3 was predicted as the downstream target gene of miRNA-3177-3p，ATP1B3 plasmids were constructed and the dual-luciferase reporter gene assay was used to verify the targeting relationship between miRNA-3177-3p and ATP1B3；finally，ELISA was used to measure the content of ATP13，a transcription product of ATP1B3，in CSF，which was then compared between the two groups.ResultsThe CV group had a significantly higher Hunt grade than the non-CV group（P 0.05）.There was a significant difference in the expression level of miRNA-3177-3p in CSF between the CV group and the non-CV group（0.8730.044 vs 0.9080.034，t=2.157，P=0.040）.The dual-luciferase reporter gene assay showed that after interaction with miRNA-3177-3p，the activity of ATP1B3-3UTR region was reduced by 15%compared with the control group（P 0.05），while the activity of ATP1B3-3UTR region was increased by 14%after mutation（P 2，P0.01的差异表达miRNA（differentially expressed miRNA，DE-miRNA）。DE-miRNA 下游靶基因的预测，我 们 借 助 了 TargetSan（http：/www.targetscan.org）与miRDB（http：/mirdb.org/）工具，在2种工具中均有预测且功能高度相关的靶mRNA筛选为研究对象。1.2一般资料选择 2018年 10月2021年 8月在安徽医科大学第四附属医院（现改名为安徽医科大学第一附属医院）神经外科住院治疗的 aSAH患者 29例。平均年龄（58.09.7）岁；男性15例，女性14例。aSAH患者依据自身病情采取了全脑血管造影术、脑动脉瘤介入栓塞术、开颅脑动脉瘤夹闭术、脑室穿刺外引流术及药物等诊治手段，危重患者予重症监护治疗。所有患者住院期间每日进行经颅多普勒血管超声检查，将任何一侧大脑中动脉血流速率大于120 cm/s并且Lindegaard比率（同侧大脑中动脉平均血流速率/同侧颅外颈内动脉平均血流速率）大于3.0者诊断为CV1，并依此将患者分为脑血管痉挛组（CV组）及脑血管未痉挛组（non-CV组）。本研究取得全部受试患者知情同意并签署知情同意书，并经原安徽医科大学第四附属 医 院 医 学 伦 理 委 员 会 批 准（PJ-Q2018-011，PJ-YX2022-001）。1.3脑脊液标本采集两组患者脑脊液标本采集过程均严格遵照无菌原则，放置脑室外引流管患者从引流管中直接收集，未放置脑室外引流管且无腰椎穿刺禁忌者则通过腰椎穿刺术获取，每位患者脑脊液采集量为10.0 mL。脑脊液采集后立即4.0 下3 000 r/min离心5.0 min，取上清液-80.0 保存。1.4miRNA-3177-3p检测脑脊液样本中总 RNA提取采用 Trizol法，逆转录获得cDNA，以cDNA为模板进行实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）分析。茎环法逆转录 引物序列 miRNA-3177-3p：5-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACGTGT-3。实时定量PCR引物序列miRNA-3177-3p正向引物序列：5-TACACGGCACTGGGGACAC-3，miRNA-3177-3p反向引物序列：5-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3。反应条件，95.0变性5.0 s，60.0退火30.0 s，共40个循7http:/2023，50（3）翁传波，等：脑动脉瘤破裂出血后脑脊液中miRNA-3177-3p与脑血管痉挛的发病关系及临床意义环。各基因相对表达水平采用2-Ct法计算。1.5双萤光素酶报告实验基因质粒构建及检测检索ATP1B3-3UTR与miRNA-3177-3p种子序列核酸匹配位点，PCR体外扩增包含结合位点的核酸片段，按Xho（CTCGAG）/Not（GCGGCCGC）酶切位点对核酸片段进行酶切，琼脂凝胶电泳酶切产物获得目的基因片段，将目的基因片段与载体相连构建ATP1B3野生型基因质粒（ATP1B3-wt）。同法构建 ATP1B3 突变型基因质粒（ATP1B3-mut），其 突 变 位 点 设 计：结 合 位 点 TCTAAAGCTTAATATGCCGTGCT/突变点GTGCTCATCGGCACCATATCATG。挑取测序正确的重组质粒单克隆菌落扩增并培养，无内毒素质粒提取试剂盒提取质粒并保存备用。复苏 293T 细胞，接种于 24-well 培养板中，37.0、5.0%二氧化碳环境下培养至细胞融合度达到约60.0%。将 miRNA-3177-3p 与 ATP1B3（野生型或突变型结合位点）3UTR荧光素酶报告基因共转染293T细胞，转染48 h后荧光素酶系统检测荧光素酶活性，评估目的基因表达情况。1.6Na+/K+-ATP酶3肽检测两组脑脊液样本中ATP1B3转录产物Na+/K+-ATP酶3肽（ATP13）水平测定采用酶联免疫分析法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）。各待测样品加入相应的酶标试剂温浴，洗涤拍干后加入显色剂，酶标仪450 nm波长下测定各样本光密度（optical density，OD）值。1.7统计学方法采用 SPSS 10.0软件进行统计分析。计数资料以例表示，比较采用2检验或Fisher确切概率法；计量资料采用均数标准差（-x s）表示，比较采用两独立样本t检验，以P2，P0.05）。但反映两组患者aSAH病情严重程度的Hunt-Hess分级比较，CV组高于non-CV组，差异具有统计学意义（P0.05）。见表1。2.3miRNA-3177-3p的qRT-PCR与双萤光素酶报告实验结果生物信息数据分析发现miRNA-3177-3p在CV患者脑脊液中表达下调。采集两组患者脑脊液并检测各患者脑脊液中 miRNA-3177-3p 表达情况，结果显示 CV 组图 1纳入研究所有样本中miRNA表达情况图2CV组与non-CV脑脊液样本中miRNA差异表达情况hsa-miRNA-146b-5phsa-miRNA-3177-3phsa-miRNA-23a-3phsa-miRNA-24-3phsa-miRNA-27a-3phsa-miRNA-29a-3pGSM5046526GSM5046577GSM5046628100-10hsa-miRNA-1337-3pP.ValueP.Value-downlog2/FC-5 0 5-log10/p-value4321082023，50（3）翁传波，等：脑动脉瘤破裂出血后脑脊液中miRNA-3177-3p与脑血管痉挛的发病关系及临床意义http:/miRNA-3177-3p表达丰度为（0.8730.044）与 non-CV组的（0.9080.034）比较，差异有统计学意义（t=2.157，P=0.040），CV 组 miRNA-3177-3p 表达丰度低于 non-CV 组患者（见图 4A）。靶基因筛选发现 ATP1B3 的 3UTR 有miRNA-3177-3p 结合位点，qRT-PCR 结果显示，CV 组ATP1B3（1.2460.076）与non-CV组（1.1450.051）比较，差异有统计学意义（t=3.867，P=0.000）（见图 4B）。miRNA-3177-3p作用后，ATP1B3-3UTR区相较对照组活性降低15%（t=4.616，P=0.000）；将 ATP1B3-3UTR 区进行突变后，ATP1B3-3UTR 区相较其突变前活性上升 14%（t=5.650，P=0.000）（见图4C）。2.4两组患者脑脊液中ATP13表达情况结果显示，CV组ATP13（1.7760.013）ng/mL与non-CV 组（1.7220.016）ng/mL 比较，差异有统计学意义（t=7.778，P=0.000）（见图4D）。3讨论动脉血管壁平滑肌收缩而引起的暂时性血管口径狭窄称为CV，在神经外科其是aSAH最严重的并发症之一，10%23%的 aSAH 患者死于 CV。CV 可在 aSAH 后立即图 3富集分析CV发生可能涉及的信号通路表1两组患者一般资料比较项目年龄/（岁，-x s）性别（男/女）/例动脉瘤位置/例 前交通动脉瘤 后交通动脉瘤 大脑中动脉瘤 基底动脉瘤 小脑前下动脉瘤Hunt-Hess分级/例、V脑室外引流术/例高血压/例糖尿病/例脑梗死/例CV组(n=6)64.1672.2423/33214225non-CV组(n=23)56.43510.00812/11134411156211512t/2值1.8061.14416.463P值0.0821.0000.8870.0020.1000.6331.0001.000A：两组miRNA-3177-3p表达情况；B：两组ATP1B3表达情况；C：双萤光素酶报告实验；D：两组ATP13表达情况；*表示ATP1B3-3UTR区与对照组比较，差异有统计学意义（P0.05）；*表示ATP1B3-3UTR区与其突变前比较，差异有统计学意义（P0.05）。图4双萤光素酶报告实验基因质粒表达及转录产物Na+/K+-ATP13检测hsa04960_Aldosterone-regulated_sodium_reabsorptionhsa04929_GnRH_secretionhsa01521_EGFR_tyrosine_kinase_inhibitor_resistancehsa04115_p53_signaling_pathwayhsa05210_Colorectal_cancerhsa04211_Longevity_regulating_pathwayhsa04068_FoxO_signaling_pathwayhsa04933_AGE-RAGE_signaling_pathway_in_diabetic_complicationshsa04722_Neurotrophin_signaling_pathwayhsa04152_AMPK_signaling_pathwayhsa04550_Signaling_pathways_regulating_pluripotency_of_stem_cellshsa04150_mTOR_signaling_pathwayhsa05200_Pathways_in_cancerPathwayGene amount0 10 20 30CV组 non-CV组1.000.950.900.850.80hsa-miRNA-3177-3p levelt=2.157，P=0.040ABt=3.867，P=0.0001.41.31.21.11.0CV组non-CV组mRNA-ATP1B3 levelATP1B3-3UTR-WTC1.801.751.701.65ATP1B3-3UTR-MUT5UCUAAAGCUUAAUAUGCCGUGCUWT ATP1B3 3UTR3UGCACAGGGGUCACGGCACGU5 hsa-miRNA-3177-3p3UGCACAGGGGUCACGGCACGU5 hsa-miRNA-3177-3p*Negative controlhsa-miRNA-3177-3p1.51.00.50.0Relative luciferase ratioATP13含量（ng/mL）Dt=7.778，P=0.000CV组non-CV组9http:/2023，50（3）翁传波，等：脑动脉瘤破裂出血后脑脊液中miRNA-3177-3p与脑血管痉挛的发病关系及临床意义发生，但更多是发生在aSAH后47 d，故早期预测CV具有重要意义。影像学检查结合临床表现虽能明确CV诊断，但无法对CV做早期预测。现有研究认为，参与CV病理生理学过程的生物标志物可能早于CV发生改变，在预测 CV 发生上可能存在一定价值2，而高龄、吸烟及高Hunt 评级（更严重病情）是 aSAH 后发生 CV 的高危因素3。本研究通过对CV患者脑脊液中miRNA-3177-3p检测及分析，发现 miRNA-3177-3p在 CV患者脑脊液中表达下调，证实其与 ATP1B3 基因存在结合位点，致ATP1B3表达上调、表达产物ATP13增高。miRNAs是一类约22个核苷酸长度的小分子非编码序列，能与互补mRNA3-UTR（非编码区）结合实现基因转录后水平负性调控作用，参与约 1/3人类基因表达过程。miRNA能在中枢神经系统稳定表达并参与到大脑生理活动中，而在脑肿瘤4、阿尔茨海默病5及脑梗死6患者血清或脑脊液中亦能检测到与上述疾病发病密切相关的循环miRNA。还有学者发现脑血管平滑肌细胞中miRNA-24对一氧化氮（NO）合成酶负性调控作用是导致aSAH患者血管内NO水平下降的原因，而NO是调节血管张力的重要物质，其水平下降与 CV 的发生直接相关7。Stylli等8在对aSAH患者脑脊液miRNA表达谱分析过程中，发现合并CV的aSAH患者脑脊液miRNA表达情况与未合并 CV 的 aSAH 者存在区别，因此指出这些差异表达的miRNA可能参与CV的病理生理过程。通过初步生物信息数据分析，笔者发现 miRNA-3177-3p在 CV患者脑脊液中存在差异，通过qRT-PCR及双萤光素酶检测，笔者证实 CV患者脑脊液中 miRNA-3177-3p表达下调，这与现有的研究结论一致，同时验证了其与ATP1B3存在结合位点，而随后的ELISA检测佐证了CV患者脑脊液中miRNA-3177-3p 下调与 ATP1B3 翻译表达产物 ATP13 增高有关。miRNA参与神经系统疾病发生过程的确凿证据，及其可分泌至细胞外液的事实，增加了miRNA-3177-3p作为预测CV生物标志物的吸引力。虽然miRNA在细胞外液中相对稳定9，并对核糖核酸酶（RNase）具有一定耐受力10，但在实际临床工作中，大家更倾向将稳定性更高的ATP13作为预测CV的生物标志物。脑动脉血管壁平滑肌细胞膜上的Ca2+电闸门控通道开放，大量Ca2+内流，钙离子依赖的肌球蛋白轻链激酶磷酸化导致血管平滑肌细胞的收缩，这是目前解释CV发生的经典理论。而Ca2+通道的开放，受控于ATP非选择性结合血管平滑肌细胞膜上的 P2X 受体 是一个由 7 个（P2X1RP2X7R）阳 离 子 可 渗 透 配 体 门 控 离 子 通 道（LGIC）组成的家族，它们响应胞外配体腺苷 5-三磷酸（ATP）的结合而打开，这是ATP参与CV过程的普遍观点11。既往认为aSAH患者脑脊液中ATP源于血管内皮细胞分泌，而动物模型研究结果更倾向于蛛网膜下腔中的血凝块释放了大部分的ATP。例如在一项猴大脑中动脉破裂的aSAH动物实验中，脑动脉破裂出血后第7天，蛛网膜下腔中凝集的血凝块所含ATP量达到峰值，而该时期亦是迟发性CV的高发期 12。Na+-K+-ATP酶是镶嵌在细胞膜上用于建立与维持细胞内外Na+-K+电化学梯度的特殊蛋白质，其建立的细胞膜静息电位在阈刺激下产生动作电位，后者广泛参与了各种细胞活动如神经元细胞电信号转导及继发性主动转运等 13。Na+-K+-ATP酶主要由、2个亚基组成，目前已知人类拥有4种亚基，3种亚基，而不同/亚基组合的Na+-K+-ATP酶功能存在差异。目前已知亚基是Na+、K+结合位点并兼具ATP酶活性，而亚基具体功能尚不清楚。现有研究发现，敲除小鼠亚基编码基因将导致小鼠运动障碍并致小鼠出生后数周内死亡14，此外2亚基在与平衡及协调动作上有特殊功能的小脑颗粒细胞中含量高于1与315，从而推测不同亚基决定了Na+-K+-ATP泵与K+的亲和力，并参与哺乳动物运动生理活动。Takheaw 等16研究发现，单克隆抗体P-3E10能与单核细胞上Na+-K+-ATP酶3亚单位结合抑制 Th1细胞因子（IL-2、IFN-和 TNF-）、Th2细胞因子（IL-4 和 IL-10）和 Th17 细胞因子（IL-17A）释放，从而削弱 T 细胞免疫应答能力，认为 Na+-K+-ATP 酶3亚单位可作为治疗超应答T细胞相关疾病的突破点，提供Na+-K+-ATP酶3亚单位参与免疫应答的证据。亦有研究认为3亚基是独立于亚基表达的，能在不干扰Na+-K+-ATP酶的功能下独立参与免疫应答17。CV显然不是一种血管炎症疾病，但有证据表明免疫炎症机制参与了CV的发病过程，例如CV患者脑脊液中IL-6、TNF-水平增高并与aSAH患者Hunt评分呈正相关，而IL-6与TNF-广泛参与人体各类免疫炎症反应过程18。另外，补体C3a及可溶性细胞间黏附因子-1亦与CV不良预后及病情进展相关19。上述免疫炎症应答参与CV发病过程的证据为本研究中发现CV患者脑脊液ATP13增高，推测3亚基可能通过免疫炎症途径参与CV的发病机制提供一定依据，并认为CV可能是由炎症因子介导的血管壁细胞外基质及平滑肌细胞收缩所造成的。CV组患者Hunt-Hess分级高于非CV组患者，与既往研究一致，提示病情更严重的aSAH患者较容易并发CV，高 Hunt-Hess分级是 CV发病的高危因素。但本研究中两组患者在年龄上的差异并不显著，这与既往研究结论不一致，考虑与本研究涉及的病例数较少有关。但本研究初步证实了miRNA-3177-3p在CV患者脑脊液中表达下调致其目标基因ATP1B3高表达，并在CV患者脑脊液中检测到翻译产物ATP13增高，笔者认为miRNA及其调控网络的分析有助于筛选出准确预测CV的生物标志物，因此研究仍具有一定临床意义。在CV治疗上，目前仍遵循密切监护、高脑灌注压、高血容量以及钙离子拮抗102023，50（3）翁传波，等：脑动脉瘤破裂出血后脑脊液中miRNA-3177-3p与脑血管痉挛的发病关系及临床意义http:/药物等预防及治疗CV的原则，虽然大部分患者能平稳过渡至安全期，但仍缺乏阻断CV进展的特效药物，若能开发出特定miRNA的激动剂或模拟物将使其成为治疗CV的新思路。总之，CV仍是临床上发病机制复杂、治疗棘手且可导致不良预后的疾病之一，亟需基础与临床研究的进一步深入以寻找新的诊疗思路。参 考 文 献1SNIDER SB,MIGDADY I,LAROSE SL,et al.Transcranial-doppler-measured vasospasm severity is associated with delayed cerebral infarction after subarachnoid hemorrhageJ.Neurocrit Care,2022,36(3):815-821.2毛群,张建宁.结合珠蛋白基因型与自发性蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛J.国际神经病学神经外科学杂志,2012,39(3):254-256.3RUMALLA K,LIN M,DING L,et al.Risk factors for cerebral vasospasm in aneurysmal subarachnoid hemorrhage:a population-based study of 8346 patientsJ.World Neurosurg,2021,145:e233-e241.4BURUIAN A,IFLORIAN SI,FLORIAN AI,et al.The roles of miRNA in glioblastoma tumor cell communication:diplomatic and aggressive negotiationsJ.Int J Mol Sci,2020,21(6):1950.5SU LN,LI RQ,ZHANG ZQ,et al.Identification of altered exosomal microRNAs and mRNAs in Alzheimers diseaseJ.Ageing Res Rev,2022,73:101497.6李效丽.进展型脑梗死患者miRNA的表达水平及临床意义J.国际神经病学神经外科学杂志,2020,47(2):127-131.7LI HT,WANG J,LI SF,et al.Upregulation of microRNA24 causes vasospasm following subarachnoid hemorrhage by suppressing the expression of endothelial nitric oxide synthaseJ.Mol Med Rep,2018,18(1):1181-1187.8STYLLI SS,ADAMIDES AA,KOLDEJ RM,et al.miRNA expression profiling of cerebrospinal fluid in patients with aneurysmal subarachnoid hemorrhageJ.J Neurosurg,2017,126(4):1131-1139.9MRAZ M,MALINOVA K,MAYER J,et al.MicroRNA isolation and stability in stored RNA samplesJ.Biochem Biophys Res Commun,2009,390(1):1-4.10LI M,YU B.Recent advances in the regulation of plant miRNA biogenesisJ.RNA Biol,2021,18(12):2087-2096.11WEN JL,CHEN ZH,ZHAO MM,et al.Cell deformation at the air-liquid interface evokes intracellular Ca2+increase and ATP release in 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