基于高通量测序技术研究非哺乳期乳腺炎患者肠道菌群结构特征.pdf

复旦学报（医学版）Fudan Univ J Med Sci2023 May，50（3）基于高通量测序技术研究非哺乳期乳腺炎患者肠道菌群结构特征代秋颖 周悦 程一凡 马丽娜 范奕伟 胡升芳 吴晶晶 孟畑 殷玉莲 叶媚娜 陈红风（上海中医药大学附属龙华医院中医乳腺科 上海 200032）【摘要】目的通过高通量测序技术分析非哺乳期乳腺炎（non-puerperal mastitis，NPM）患者肠道菌群结构变化特征。方法2020 年 8 月至 2022 年 3 月期间共纳入 NPM 组患者 40 例、健康对照组（healthy controls，HC）受试者 30例，采集粪便样本后进行高通量测序，根据测序结果进行生物信息学分析。结果Alpha多样性分析显示，NPM 组患者肠道菌群 sobs、ace、chao、shannon指数显著低于 HC 组（P3，P0.5），其 中 10 个 菌 属 包 括Faecalibacterium、Escherichia-Shigella 在 NPM 组 丰 度 富 集，Anaerostipes、Streptococcus、Christensenellaceae_R-7_group、Alistipes、UCG-002、Ruminococcus_torques_group、Corynebacterium、Neisseria 在 HC 组丰度富集，以上述10个菌属作为一个菌群组构建 ROC 曲线的 AUC 值为 0.73，单个菌属中 Anaerostipes、Ruminococcus_torques_group的 AUC 值分别为 0.72、0.70，提示具有诊断意义。结论NPM 患者肠道菌群丰富度、多样性显著低于 HC 组受试者，NPM 患者与健康受试者肠道菌群组成存在显著差异。菌群组或单个菌属可作为区别 NPM 患者与健康人群的潜在生物标志物。【关键词】非哺乳期乳腺炎（NPM）；肠道菌群；高通量测序【中图分类号】R583，R574.4 【文献标志码】A doi：10.3969/j.issn.1672-8467.2023.03.009The structural characteristics of gut microbiota in patients with non-puerperal mastitis via high-throughput sequencing technologyDAI Qiu-ying，ZHOU Yue，CHENG Yi-fan，MA Li-na，FAN Yi-wei，HU Sheng-fang，WU Jing-jing，MENG Tian，YIN Yu-lian，YE Mei-na，CHEN Hong-feng（Department of Breast Surgery of Traditional Chinese Medicine，Longhua Hospital，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200032，China）【Abstract】Objective High-throughput sequencing was used to study on the changes of structural characteristics of gut microbiota in patients with non-puerperal mastitis（NPM）.MethodsA total of 40 NPM patients and 30 healthy controls（HC）were enrolled from Aug 2020 to Mar 2022.Stool samples were collected and then subjected to high-throughput sequencing.Bioinformatics analyses were performed based on the sequencing results.ResultsAnalysis of Alpha diversity showed that the index of sobs，ace，chao and shannon of gut microbiota in NPM group were significantly lower than those in the healthy controls（HC）group（P3，P0.5），of which 10 genera including Faecalibacterium，Escherichia Shigella were enriched in the NPM group，and Anaerostipes，Streptococcus，Christensenellacea_R-7_group，Alistipes，UCG-002，Ruminococcus_torques_group，Corynebacterium and Neisseria were enriched in HC group.The area under the ROC curve（AUC）of the above 10 genera as a group of microbiota was 0.73.The AUC of Anaerostipes and Ruminococcus_torques_group as a single genus was 0.72 and 0.70，respectively，which indicated diagnostic significance.Conclusion The richness and diversity of gut microbiota in NPM patients was significantly lower than that in healthy control subjects.There are certain differences in the structure of the gut microbiota between the two groups.The microbiota group or single genus can be used as a potential biomarker to distinguish NPM patients from healthy people.【Key words】non-puerperal mastitis（NPM）；gut microbiota；high-throughput sequencing*This work was supported by the Innovation Training Program for Graduate Students of Shanghai University of Traditional Chinese Medicine（Y2020013）and the Major Clinical Research Project of Shanghai Shenkang Hospital Development Center（SHDC2020CR2051B）.非哺乳期乳腺炎（non-puerperal mastitis，NPM）是一种慢性、非特异性的乳房炎症性疾病，常发生于非妊娠期、非哺乳期的中青年女性1。近二十年来国内病例数显著增高，其临床表现以乳房部炎症性肿块形成，局部红、肿、疼痛为特点，病程慢性迁延、反复难愈，在炎性结块基础上可形成瘘管、窦道、溃疡。保守治疗无效者需行乳房区段切除，原发病灶与手术瘢痕严重破坏乳房外形，使患者承受长 期 的 精 神 压 力 与 经 济 负 担，影 响 生 活 质 量2。NPM 病因尚不明确，一定程度上阻碍其诊疗技术的发展，已有研究认为其发病可能与乳腺导管不畅、吸烟、肥胖、病原菌感染、免疫反应等因素有关3-5。研究显示，在 NPM 疾病进程中存在免疫应答类型的转化6-7，且多种免疫性疾病经研究发现与肠道菌群结构的改变有关8-10。肠道菌群的代谢活动被认为相当于机体的“虚拟器官”11-12，肠道中的微生物及其代谢产物是促进和发展宿主免疫系统的基础，可对宿主的免疫、代谢调节及大脑功能等产生影响13-15。肠道免疫与共生菌失调可导致慢性炎症以及自身免疫性疾病的发生14，16-17。目前，国内外对于乳腺炎症性疾病的肠道微生态特点研究十分有限。Ma等18通过动物实验发现患哺乳期乳腺炎的奶牛乳汁和粪便中菌群变化具有一致性，另一项实验将哺乳期乳腺炎奶牛的粪菌移植到无菌健康小鼠，结果显示无菌小鼠也产生了乳腺炎症状以及血液、脾脏、结肠的炎症19，说明肠道菌群失调或结构改变可能与乳腺炎症性疾病的发生有关。本研究将通过高通量测序技术首次从肠道微生态层面分析 NPM 的病理特征，探讨NPM患者肠道菌群的结构特点。资 料 和 方 法研究对象 本研究纳入来自上海中医药大学附属龙华医院门诊或住院治疗的 NPM 患者以及自社会招募的健康受试者。NPM 患者符合临床症状，经病理诊断为 NPM。所有患者及健康受试者年龄为 1860 岁。排除标准：（1）合并肝、肾、造血系统、内分泌系统等严重原发疾病；（2）受试前 3 个月内服用过抗生素或微生物制剂；（3）正在使用对胃肠功能可能有影响的药物；（4）既往有良、恶性肿瘤病史；（5）确定或怀疑有酒精或药物滥用史；（6）精神病患者。本研究经上海中医药大学附属龙 华 医 院 医 学 伦 理 委 员 会 批 准（批 准 号：2021LCSY047），从 2020 年 8 月 至 2022 年 3 月 共 纳 入NPM 组 患 者 40 例、健 康 对 照（healthy controls，HC）组受试者 30 例，所有患者及受试者均签署知情同意书。标本采集方法 向受试者详细讲解粪便标本采集方法：嘱受试者排便前排空尿液，避免污染；以无菌勺采集新鲜粪便内与空气和地面没有接触的380代秋颖，等.基于高通量测序技术研究非哺乳期乳腺炎患者肠道菌群结构特征部分，约黄豆大小（23 g），置入无菌管中，随后交由研究者转运至-80 冰箱冻存以备检测。高通量测序方法 应用 E.Z.N.A.soil DNA kit（美国 Omega Bio-tek 公司）进行微生物群落总DNA 抽提，1%的琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的提取质量，NanoDrop2000 测定 DNA 浓度和纯度；使用 338F（5-ACTCCTACGGGAGGCAG CAG-3）和 806R（5-GGACTACHVGGGTWTC TAAT-3）对 16S rRNA 基因 V3-V4 可变区进行 PCR 扩增，扩增程序如下：95 预变性 3 min，27 个循环（95 变性 30 s，55 退火 30 s，72 延伸 45 s），然后72 稳定延伸 10 min，最后在 10 进行保存（PCR仪：ABI GeneAmp9700 型）。使用 2%琼脂糖凝胶 回 收 PCR 产 物，利 用 AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（美国 Axygen Biosciences 公司）进行回收产物纯化，2%琼脂糖凝胶电泳检测，并应用Quantus Fluorometer（美国 Promega公司）对回收产 物 进 行 检 测 定 量。使 用 NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit 建 库。应 用 Miseq PE300/NovaSeq PE250平台（美国 Illumina公司）进行测序。生 物 信 息 分 析 方 法 应 用 fastp20软 件FLASH21软件对原始测序序列进行质控和拼接：（1）过滤 reads尾部质量值 20以下的碱基，过滤质控后 50 bp 以 下 的 reads；（2）将 成 对 reads 拼 接（merge），最小 overlap 长度为 10 bp，错配率不超过0.2；（3）根据序列首尾两端的 barcode和引物区分样品，调整序列方向，barcode 错配数为 0，最大引物错配数为 2。根据 97%22-23相似度，应用 UPARSE22软件进行操作分类单元（operational taxonomic unit，OUT）聚类并剔除嵌合体。利用 RDP classifier24对每条序列进行物种分类注释，比对 Silva 16S rRNA数据库（v138），将对比阈值设置为 70%。统计学方法 应用 R 语言软件（V.3.3.1）进行数据分析。若两组计量资料满足正态分布且方差齐，采用两独立样本 t检验，若方差不齐，采用校正 t检验；若不满足正态分布，采用秩和检验。计数资料采用 2检验。P0.05为差异有统计学意义。结 果样本基本信息 2020年 8月至 2022年 3月期间共采集粪便标本 70 例。其中 NPM 组 40 例，HC 组30例，年龄范围 2145岁。两组平均年龄、身高、体重及 BMI差异无统计学意义，具有可比性（表 1）。对 70 例粪便样本进行 Illumina MiSeq 测序，获得 3 496 238 条有效序列，包含 1 435 357 507 个碱基，序列长度集中在 401440 bp，序列平均长度为410 bp。应用 Uparse软件，以 97%的相似性对所有序列进行 OTU 聚类，按最小样本序列数抽平，结果显示共检出 1 062 个 OTU，NPM 组和 HC 组分别检出 968 个和 965 个 OTU，两组共有的 OTU 850 个（图 1A）。应 用 R 语 言 软 件 绘 制 稀 释 曲 线，包 括sobs、shannon 和 coverage 曲线，分别代表物种丰富度、多样性和覆盖度，以评估测序深度。由图 1B 可见，随着测序数据量逐渐增大，Sobs曲线趋向平缓，提示数据测序量合理；由图 1C、图 1D 可见，随着测序数据量增多，shannon曲线、coverage曲线平缓，提示测序量足够大，可以反映样本中绝大部分微生物的多样性信息，提示当前样本量相对充足。Alpha 多样性分析 Alpha 多样性指数差异检验结果显示，NPM 组 sobs（t=2.70，P0.05）、ace（t=2.37，P0.05）、chao（t=2.38，P0.05）、shannon（t=2.56，P0.05）指数差异无统计学意义（表 2）。偏最小二乘法判别分析 偏最小二乘法判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）结果显示，在 OTU 水平，NPM 组和 HC 组样本明显区分并聚成两个类群，各样本在图中位置的离散情况也说明了个体之间肠道菌群组成的差异程度（图 2）。NPM 组 与 HC 组 肠 道 菌 群 组 成 与 差 异 分 析 70 例受试者的粪便共检出 15 个菌门、22 个菌纲、55个菌目、105 个菌科、288 个菌属。NPM 组与 HC 组有 4 个 优 势 菌 门，分 别 为 Firmicutes（72.78%vs.72.39%，z=3.62，P=0.995 3）、Bacteroidota（13.39%表 1受试者基本临床特征Tab 1Basic clinical indicators of subjects（xs）Clinical indicatorsAge（y）Weight（kg）Height（cm）BMI（kg/m2）NPM31.634.6760.108.35160.734.3923.242.88HC29.205.3858.359.30162.534.3422.022.82t2.020.83-1.711.77P0.050.410.090.08NPM：Non-puerperal mastitis；HC：Healthy controls.381复旦学报（医学版）2023年 5月，50（3）vs.14.29%，z=3.41，P=0.656 3）、Actinobacteriota（8.23%vs.9.18%，z=3.17，P=0.351 5）、Proteobacteria（5.12%vs.2.99%，z=4.41，P=0.113 1）（图 3）。NPM组与 HC 组相比，1 个纲、5 个目、14 个科、28 个属存在显著差异。纲水平，NPM 组 Bacilli（z=2.65，P3，P3 的 10 个属水平差异物种构建ROC 曲线以进一步筛选生物标志物，结果显示该菌群组 AUC 为 0.73（图 5），具有较高诊断意义。对本菌群组中的物种逐个分析，其中 9个物种的 AUC0.5，具 有 诊 断 意 义（图 6），其 中 Anaerostipes、Ruminococcus_torques_group 的 AUC 值较高，分别为 0.72（95%CI：0.60.84）、0.70（95%CI：0.570.83）；其 余 物 种 按 AUC 值 从 高 到 低 分 别 为Streptococcus（AUC=0.69，95%CI：0.560.81）、Alistipes（AUC=0.68，95%CI：0.550.81）、Corynebacterium（AUC=0.66，95%CI：0.540.78）、Christensenellaceae_R-7_group（AUC=0.66，95%CI：0.530.79）、UCG-002（AUC=0.65，95%CI：0.520.78）、Faecalibacterium（AUC=0.63，图 2NPM 组与 HC组肠道菌群偏最小二乘法分析Fig 2Partial least squares discriminant analysis of gut microbiota in NPM group and HC group383复旦学报（医学版）2023年 5月，50（3）95%CI：0.490.76）、Escherichia-Shigella（AUC=0.63，95%CI：0.490.76）。Neisseria 的 AUC值较低（AUC=0.45，95%CI：0.40.5），不具有诊断意义。讨 论NPM 是一种病因不明的非特异性炎症性疾病，对病理标本及外周血检测的研究显示，其病程中存在免疫类型转化及免疫调节失衡，如由 Th1 型辅助细胞向 Th2 型转化以及 Th17 辅助细胞/调节性 T细胞失衡6-7，专家共识多认为其发病与自身免疫因素相关1-2。肠道菌群结构的改变可通过内分泌细胞影响屏障通透性，导致细菌及其代谢产物进入循环，进而影响宿主机能25。肠道菌群失调诱发的促炎因子表达、分子模拟机制启动、肠道代谢产物紊乱 被 认 为 与 肠 内 外 自 身 免 疫 性 疾 病 的 发 生 有图 3NPM 组与 HC组门水平肠道菌群结构Fig 3Structure of gut microbiota at phylum level in NPM group and HC group图 4NPM 组与 HC组肠道菌群进化分支图Fig 4Cladogram of gut microbiota in NPM group and HC group384代秋颖，等.基于高通量测序技术研究非哺乳期乳腺炎患者肠道菌群结构特征关26-28。另一方面，肠道共生菌可协助机体进行营养物质代谢、药物代谢、构建消化道免疫屏障以及促进肠道淋巴组织、T 细胞、B 细胞等免疫结构发育16，29。为探索 NPM 肠道微生态层面的发病机制，本研究收集了 40 例 NPM 患者以及 30 例健康受试者的粪便样本进行高通量测序分析。在疾病与健康人肠道菌群差异结果中，Alpha多样性分析的 sobs、ace、chao、shannon 指数在健康人群中显著较高，说明在 NPM 的疾病状态下，肠道菌群的丰富度和多样性均显著降低。PLS-DA 结果显示，在 OTU 水平，NPM 组和 HC 组样本分区并聚成两个类群，说明可通过肠道菌群结构的差异对NPM 患者与健康人群进行区别。本研究采用 LDA分析发现 16 个物种在 HC 组富集并对组间差异形成贡献较大（LDA值3，P0.5），以属水平的 10个物种作为菌群组进行 ROC 曲线构建，得到 AUC 值为 0.73，提示对疾病组与健康组肠道菌群差异有一定诊断意义，该菌群组可作为潜在的生物标志物。其中，Anaerostipes、Ruminococcus_torques_group 的AUC0.7，就单个物种而言具有较高诊断价值。Anaerostipes为严格厌氧菌，可将葡萄糖代谢为短链脂肪酸（short chain fatty acids，SCFA），如丁酸盐、醋酸盐30。研究显示，Anaerostipes在非酒精性脂肪性 肝 病 合 并 2 型 糖 尿 病 患 者、肠 易 激 综 合 征、Graves 病等患者肠道菌群中丰度相对较低31-33。Ruminococcus_torques_group 亦属于厚壁菌门，有限报道显示其在 Graves 病、溃疡性结肠炎患者肠道菌群中丰度相对减低33-34。另有 6 个在 HC 组富集的物种 AUC 值在 0.50.7 内，亦具有一定诊断意义。其中 Streptococcus 为厚壁菌门下菌属，其在肠道中的终末代谢产物为醋酸盐、乳酸盐、甲酸盐等35，被报道在特质焦虑患者、强直性脊柱炎、过敏性 紫 癜 肾 等 患 者 的 肠 道 菌 群 中 丰 度 富 集36-38。Alistipes 属于拟杆菌门、Rikenellaceae 科，为严格厌氧的革兰阴性菌属39，其代谢产物包括醋酸盐、丙酸盐等35，其丰度相对减少，可见于肝硬化患者、自闭症患者以及肥胖或非酒精性脂肪性肝炎的儿童、青少年40-42。Christensenellaceae_R-7_group、Christensenellaceae科、Christensenellales目属于厚壁菌门下同一分类树支。一项荟萃分析显示，肠道疾病 患 者 的 肠 道 菌 群 中 Christensenellaceae_R-7_group、Ruminococcaceae UCG-005、Alistipes 等物种相对丰度显著较低43。Christensenellaceae 是一类革兰氏阴性、厌氧菌44，其丰度减低可见于非特异性炎症性肠病患者45。Christensenellaceae 科下第一个分离物为 Christensella minuta，其特点为严格 厌 氧，可 将 糖 类 代 谢 为 醋 酸 盐 和 丁 酸 盐44。表 3NPM 组与 HC组肠道菌群结构线性判别分析Tab 3Linear discriminant analysis of gut microbiota structure between NPM group and HC groupGroupNPMHCCategorizeGenusClassOrderFamilyGenusSpeciesg_Faecalibacteriumg_Escherichia-Shigellac_Bacillio_Lactobacillaleso_Christensenellalesf_Streptococcaceaef_Oscillospiraceaef_Christensenellaceaef_Neisseriaceaef_Rikenellaceaeg_Anaerostipesg_Streptococcusg_Neisseriag_Christensenellaceae_R-7_groupg_Alistipesg_UCG-002g_Ruminococcus_torques_groupg_CorynebacteriumLDA value4.424.073.813.833.483.903.523.483.473.364.173.903.563.473.373.373.263.09P0.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.010.050.050.050.050.050.053）ROC曲线分析Fig 5ROC curve analysis of different species at genus level（LDA3）between NPM group and HC group385复旦学报（医学版）2023年 5月，50（3）UCG-002 属于 Oscillospiraceae 科，为厚壁菌门的梭菌纲所属，Oscillospiraceae亦为丁酸盐产生菌46，其下菌属 Oscillospira 被报道在儿童非酒精性脂肪性肝炎、非特异性炎症性肠病、强迫症患者肠道菌群中丰度减低47-48。在 NPM 组显著富集的菌属中，Faecalibacterium、Escherichia-Shigella 对 组 间 差 异影响显著（LDA3，P3 的属水平差异物种菌群组以及单个物种 Anaerostipes、Ruminococcus_torques_group 可以作为 NPM 这一疾病和健康人肠道菌群的区分的潜在生物标志物。肠道菌群结构和其代谢产物水平对 NPM 发生、发展的影响机制尚缺乏报道，本文初步分析了 NPM 患者肠道微生态层面病理特点，对潜在生物标志物进行筛选，为 NPM 的病因学研究及临床诊疗提供新思路。作者贡献声明代秋颖研究设计，标本收集，文献整理，论文撰写。周悦，程一凡，马丽娜，范奕伟标本收集，文献整理。胡升芳，叶媚娜可行性分析。吴晶晶，孟畑，殷玉莲论文修订。陈红风研究设计，论文审校。利益冲突声明所有作者均声明不存在利益冲突。参 考 文 献1 周飞，刘璐，余之刚.非哺乳期乳腺炎诊治专家共识 J.中国实用外科杂志，2016，36（7）：755-758.2 张超杰，胡金辉，赵希.肉芽肿性小叶性乳腺炎诊治湖南专家共识（2021版）J.中国普通外科杂志，2021，30（11）：1257-1273.3 屠道远，甄林林，李振，等.非哺乳期乳腺炎病因学研究进展 J.中华乳腺病杂志（电子版），2018，12（1）：55-59.4 DIXON JM，RAVISEKAR O，CHETTY U，et al.Periductal mastitis and duct ectasia：different conditions with different aetiologiesJ.Br J Surg，1996，83（6）：820-822.5 RAHAL RM，DE FREITAS-JNIOR R，PAULINELLI RR.Risk factors for duct ectasia J.Breast J，2005，11（4）：262-265.6 魏云龙.辅助 T 细胞 17、调节 T 细胞相关因子与浆细胞性乳腺炎的相关性分析 D.河北大学，2018.7 孙厚启.IL-2、IL-4 在浆细胞性乳腺炎组织中的表达及意义 D.石河子大学，2015.8 芦煜.祛风宁溃方对于溃疡性结肠炎大肠湿热证患者肠道菌群的影响 D.北京中医药大学，2019.9 ISHAQ HM，MOHAMMAD IS，GUO H，et al.Molecular estimation of alteration in intestinal microbial composition in Hashimotos thyroiditis patients J.Biomed Pharmacother，2017，95：865-874.10 刘晓飞，王志中，王勇，等.早期类风湿关节炎患者肠道微生物群落的分析 J.第三军医大学学报，2012，34（23）：2411-2415.11 BOCCI V.The neglected organ：bacterial flora has a crucial immunostimulatory roleJ.Perspect Biol Med，1992，35（2）：251-260.12 OHARA AM，SHANAHAN F.The gut flora as a forgotten organ J.EMBO Rep，2006，7（7）：688-693.13 SCHROEDER BO，BCKHED F.Signals from the gut microbiota to distant organs in physiology and diseaseJ.Nat Med，2016，22（10）：1079-1089.14 WANG L，ZHU L，QIN S.Gut microbiota modulation on intestinal mucosal adaptive immunityJ.J Immunol Res，2019，2019：4735040.15 GHAISAS S，MAHER J，KANTHASAMY A.Gut microbiome in health and disease：Linking the microbiome-gut-brain axis and environmental factors in the pathogenesis of systemic and neurodegenerative diseasesJ.Pharmacol Ther，2016，158：52-62.16 PICKARD JM，ZENG MY，CARUSO R，et al.Gut microbiota：Role in pathogen colonization，immune responses，and inflammatory diseaseJ.Immunol Rev，2017，279（1）：70-89.17 NISHIDA A，INOUE R，INATOMI O，et al.Gut microbiota in the pathogenesis of inflammatory bowel 387复旦学报（医学版）2023年 5月，50（3）disease J.Clin J Gastroenterol，2018，11（1）：1-10.18 MA C，ZHAO J，XI X，et al.Bovine mastitis may be associated with the deprivation of gut LactobacillusJ.Benef Microbes，2016，7（1）：95-102.19 MA C，SUN Z，ZENG B，et al.Cow-to-mouse fecal transplantations suggest intestinal microbiome as one cause of mastitis J.Microbiome，2018，6（1）：200.20 CHEN S，ZHOU Y，CHEN Y，et al.fastp：an ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessorJ.Bioinformatics，2018，34（17）：i884-i890.21 MAGO T，SALZBERG SL.FLASH：fast length adjustment of short reads to improve genome assembliesJ.Bioinformatics，2011，27（21）：2957-2963.22 EDGAR RC.UPARSE：highly accurate OTU sequences from microbial amplicon readsJ.Nat Methods，2013，10（10）：996-998.23 STACKEBRANDT E，GOEBEL BM.Taxonomic Note：a Place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology J.Int J Syst Bacteriol，1994，44（4）：846-849.24 WANG Q，GARRITY GM，TIEDJE JM，et al.Naive Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy J.Appl Environ Microbiol，2007，73（16）：5261-5267.25 CANI PD，EVERARD A，DUPARC T.Gut microbiota，enteroendocrine functions and metabolismJ.Curr Opin Pharmacol，2013，13（6）：935-940.26 ADAK A，KHAN MR.An insight into gut microbiota and its functionalitiesJ.Cell Mol Life Sci，2019，76（3）：473-493.27 SZYMULA A，ROSENTHAL J，SZCZERBA BM，et al.T cell epitope mimicry between Sjgrens syndrome Antigen A（SSA）/Ro60 and oral，gut，skin and vaginal bacteria J.Clin Immunol，2014，152（1-2）：1-9.28 赵丽丹，孟夏，徐浩杰，等.肠道菌群在自身免疫性疾病治疗中的前景 J.协和医学杂志，2022，13（5）：740-746.29 JANDHYALA SM，TALUKDAR R，SUBRAMANYAM C，et al.Role of the normal gut microbiotaJ.World J Gastroenterol，2015，21（29）：8787-803.30 SCHWIERTZ A，HOLD GL，DUNCAN SH，et al.Anaerostipes caccae gen.nov.，sp.nov.，a new saccharolytic，acetate-utilising，butyrate-producing bacterium from human faeces J.Syst Appl Microbiol，2002，25（1）：46-51.31 任士萌，梅璐，黄煌，等.非酒精性脂肪性肝病患者肠道菌群及生物化学指标相关性分析J.中华肝脏病杂志，2019，27（5）：369-375.32 PRESTI ALO，ZORZI F，DEL CHIERICO F，et al.Fecal and mucosal microbiota profiling in irritable bowel syndrome and inflammatory bowel disease J.Front Microbiol，2019，10：1655.33 JIANG W，YU X，KOSIK RO，et al.Gut microbiota may play a significant role in the pathogenesis of Graves diseaseJ.Thyroid，2021，31（5）：810-820.34 PALMIERI O，CASTELLANA S，BISCAGLIA G，et al.Microbiome analysis of mucosal ileoanal pouch in ulcerative colitis patients revealed impairment of the pouches immunometabolites J.Cells，202