麝鼠繁殖期和非繁殖期肠道微生物组成的比较分析.pdf

动物营养学报，（）：麝鼠繁殖期和非繁殖期肠道微生物组成的比较分析杨潇瀛 宋丰成 彭 芃 徐义舒 高福利 张浩林 韩莹莹 翁 强 袁峥嵘（北京林业大学生物科学与技术学院，北京）摘 要：肠道中存在的大量微生物在协同进化和相互选择下与宿主形成了一个动态稳定的环境，其组成受多方面因素影响。本试验旨在比较繁殖期与非繁殖期麝鼠肠道微生物组成的差异，为麝鼠的高效养殖提供理论参考。在繁殖期与非繁殖期各取 只麝鼠，基于 测序平台对盲肠内容物进行 基因测序。结果显示：多样性分析表明麝鼠非繁殖期肠道微生物丰富度和均匀度高于繁殖期，多样性分析表明麝鼠繁殖期与非繁殖期肠道微生物存在一定差异。物种组成分析表明麝鼠肠道微生物中优势菌门为拟杆菌门（）和厚壁菌门（），优势菌属为普氏菌属（）、巴恩斯氏菌属（）、梭菌属 簇（）和瘤胃球菌属（）。物种差异分析表明，相对于非繁殖期，麝鼠在繁殖期有 个菌群的相对丰度减少，有 个菌群的相对丰度增加；在非繁殖期毛螺菌科（）和梭菌目（）的相对丰度显著增加（），在繁殖期鞘脂杆菌科（）、梭菌科（）、消化链球菌科（）、弯曲菌科（）、肠杆菌科（）的相对丰度显著增加（）。功能预测显示麝鼠繁殖期多数差异菌群富集于代谢相关通路，包括氨基酸代谢、辅助因子和维生素代谢以及能量代谢。由此可见，与非繁殖期麝鼠相比，繁殖期麝鼠肠道微生物组成发生了改变，且差异菌群多富集于营养代谢相关通路，有利于保障麝鼠繁殖活动。关键词：麝鼠；肠道微生物；测序；季节性繁殖中图分类号：文献标识码：文章编号：（）收稿日期：基金项目：国家自然科学基金项目资金资助（）；大学生创新创业训练计划资助项目（，）作者简介：杨潇瀛（），女，河北张家口人，硕士研究生，从事肠道微生物与生殖生物学研究。：通信作者：袁峥嵘，副教授，硕士生导师，：在一年中特定时间开始的繁殖活动称为季节性繁殖，这代表了机体一种适应性能量分配策略，动物通过该策略调节繁殖和生存行为之间的权衡。冬季恶劣的环境和食物短缺促进了能量从非必要功能（包括繁殖）向对生存至关重要的功能（例如产热）转变。相比之下，春季气候温和、食物丰富，最适合母体的成功繁殖和后代的生存。脊椎动物的繁殖主要受下丘脑垂体性腺轴（，轴）的调节。促性腺激素释放激素从下丘脑释放，诱导垂体前叶分泌促性腺激素、促黄体生成素和促卵泡激素。反过来，促性腺激素激活性腺功能并引发繁殖活动。在这种情况下，季节性繁殖是可通过在一年中的适当时间激活 轴来实现的。除此之外，日照时间、雌激素、神经肽、亲吻素（）、促性腺激素抑制激素、甲状腺和许多其他环境因素（如食物、水、空间和气候）的变化也会对繁殖产生影响。近年来，越来越多的研究表明肠道微生物在繁殖中也发挥着重要的作用。肠道微生物是存在于消化系统内的数万亿微生物，包括细菌、病毒和一些在出生后就在消化道中定植的真核生物，具有高度多样化。肠道微生物群与 期杨潇瀛等：麝鼠繁殖期和非繁殖期肠道微生物组成的比较分析宿主相互作用，影响宿主的健康和适应性，可以通过各种复杂的机制与宿主的远端器官（包括大脑、肝脏、肌肉以及睾丸）进行交流。在生殖方面，雄激素可以通过复杂的途径显著重塑肠道微生物群。反过来，肠道微生物群也被发现可以调节雄激素的产生和代谢过程，甚至可以侵入血睾屏障（，）来调节精子发生。等通过代谢组将睾丸功能和肠道微生物群调节联系起来。等研究了胃肠道微生物群与男性生殖之间的关系，发现不育男性的直肠中厌氧球菌属（）的丰度降低，而毛螺菌科（）、柯林氏菌属（）和粪球菌属（）的丰度增加。麝鼠（）属于哺乳纲（），啮齿目（），仓鼠科（），麝鼠属（），是一种具有较高经济价值的农林经济动物，可进行人工养殖。麝鼠为草食性动物，食性广泛，主要以植物为主，在自然界中多喜食水生植物的嫩芽、枝叶、果实及鲜嫩的块根、块茎等，有时也食一些小鱼、蛙、蚌、虾等水生小动物。麝鼠具有季节性繁殖特点，繁殖期从 月末或 月初开始到 月中旬终止，之后开始为过冬做准备。麝鼠繁殖力很强，年产 胎左右，南方气候温和产胎数较多，北方严寒地区产胎数较少，平均每胎产仔 只，妊娠期 ，哺乳期 左右。然而，还没有相关研究报道麝鼠肠道微生物结构和功能在繁殖期如何改变以维持机体正常繁殖性能。因此，本研究旨在研究繁殖期和非繁殖期麝鼠肠道微生物组成差异，并探索其功能差异，为进一步确保麝鼠的高效养殖奠定基础。材料与方法 试验动物 分别于 年 月（非繁殖期）和 年 月（繁殖期）在河北省辛集市某麝香鼠养殖基地购买繁殖期和非繁殖期雄性成年麝鼠各 只。采用二氧化碳（）吸入法将试验动物处死后，用无菌解剖器具解剖，收集盲肠内容物立即置入液氮，随后保存在 冰箱，用于 扩增子测序。以上关于动物试验操作程序均严格按照北京林业大学动物伦理委员会动物处理和试验操作规范要求执行。试验方法 提取及测序 提取盲肠内容物总基因组 并评估 的质量和完整性。按 （，美国）说明书，使用正向引物（）和反向引物（）对细菌 基因 区进行第 轮 扩增。取 扩增产物进行 琼脂糖凝胶电泳检测目的片段，经 纯化后，进行第 轮 扩增。再次用凝胶电泳检测第 轮扩增产物，使用 （）试剂盒对目的片段进行切胶回收。分别使用 和 对文库 质量浓度和长度分布进行质检，使用 （，美国）对文库 摩尔浓度进行定量，以此作为文库混合的标准。对文库 进行质量评估和定量后，将文库混合变性后在 测序平台测序。生物信息学分析 使用 将下机后双端序列合并成单条序列，切除正反向引物，以错误率进行质控。设定 值为 去除低丰度噪音后，使用 对序列去噪（）获得单碱基精度扩增子序列变体（，），该步骤同时去除了嵌合体，使用 生成特征表。将序列比对到 数据库确定每个 的分类信息，并去除质体、非细菌和古菌。经等量抽样标准化后，用 软件包计算 多样性指数。取 序列中 的数量来计算稀释过程的丰富度变化。利用 距离计算 多样性，并用主坐标分析（，）进行可视化。在门水平和属水平分析物种组成，对物种信息进行注释。所有上述数据均使用 生成可视化图像。使用线性判别分析效应量（，）来确定不同分类层级的物种差异。基于高质量序列，使用 对微生物功能进行预测，得到 通路中的基因相对丰度。使用 分析具有显著差异的功能通路。动 物 营 养 学 报 卷 结果与分析 样本序列与 为得到高质量测序数据，对 条原始序列（）进行拼接，得到 序列，切除引物与质控后 个样品共得到 条序列，去除低 丰 度 噪 音 并 使 用 去 噪 后 共 获 得 个单碱基精度，去除 个嵌合体。其中繁殖期平均 为 个，非繁殖期平均 为 个。稀释曲线和 多样性分析 本研究采用物种丰富度稀释曲线评估样本测序深度是否足以稳定估计样本丰富度。如图 所示，繁殖期和非繁殖期的物种丰富度稀释曲线均逐渐趋于平坦，说明测序深度已经基本覆盖到样本中所有物种，更多的数据量对发现新的 的贡献很小，并且繁殖期与非繁殖期在物种丰富度上存在差异，条曲线存在分层，非繁殖期物种丰富度高于繁殖期。多样性是指一个特定区域或者生态系统内物种的丰富度及均匀度，其中香农（）指数同时考虑了物种丰富度及均匀度，与物种多样性呈正相关。由图 可以看出，非繁 殖 期 指 数 显 著 高 于 繁 殖 期（），说明非繁殖期麝鼠肠道微生物的丰富度和均匀度均显著增加。：繁殖期 ；：非繁殖期 。下图同 。：丰富度稀释曲线 ；：香农指数 。：繁殖期与非繁殖期存在显著差异（）（）。图 繁殖期与非繁殖期麝鼠肠道微生物丰富度稀释曲线及香农指数 多样性分析 本研究以 指数进行衡量，对繁殖期与非繁殖期麝鼠进行。如图 所示，繁殖期与非繁殖期样本各自可以很好的聚为一类，并且第 主坐标（）可以解释样本总差异的，第 主坐标（）可以解释样本总差异的，说明繁殖期与非繁殖期麝鼠肠道微生物群落存在一定差异。肠道菌群结构分析 门水平菌群结构 对在门水平上相对丰度前 的菌群分析作图，结果如图 所示。从图中可以看出，繁殖期和非繁殖期麝鼠肠道微生物中的优势菌门均为拟杆菌门（）和厚壁菌门（），所占平均比例分别为 和；同时，拟杆菌门的相对丰度在繁殖期高于非繁殖期，厚壁菌门的相对丰度在非繁殖期高于繁殖期；其余包括变形菌门（）、疣微菌门（）、螺旋体门（）、梭杆菌门（）等在内的菌群的相对丰度均不足。图 繁殖期与非繁殖期麝鼠肠道微生物 多样性 期杨潇瀛等：麝鼠繁殖期和非繁殖期肠道微生物组成的比较分析 属水平菌群结构 对在属水平上相对丰度前 的菌群分析作图，结果如 图 所 示。从 图 中 可 以 看 出，有的 序 列 未 能 归 类，被 列 为 未 分 类（），其余相对丰度大于 的菌属分别为普氏菌属（，）、巴恩斯氏菌属（，）、梭菌属 簇（，）和瘤胃球菌属（，）。：门水平菌群组成 ；：属水平菌群组成 。：门；：拟杆菌门；：厚壁菌门；：变形菌门；：疣微菌门；：螺旋体门；：梭杆菌门；：未分类；：放线菌门；：其他；：属；：普氏菌属；：阿克曼菌属；：拟杆菌属；：考拉杆菌属；：巴恩斯氏菌属；：梭菌属 簇；：瘤胃球菌属；：颤螺菌属；：黄杆菌属；：密螺旋体属。图 繁殖期与非繁殖期麝鼠肠道菌群组成 菌群结构差异分析 为在 水平检测繁殖期和非繁殖期麝鼠肠道微生物组成的差异，本研究使用火山图和曼哈顿图分析了差异表达的菌群数量及在门水平上差异表达的菌群。如图 所示，相对于非繁殖期，繁殖期有 个菌群的相对丰度减少，个菌群的相对丰度增加。在门水平上，相对于非繁殖期，繁殖期麝鼠肠道微生物中拟杆菌门、梭杆菌门和变形菌门的相对丰度升高，厚壁菌门的相对丰度降低（图）。：差异菌群火山图 ；：门水平差异菌群曼哈顿图 。：水平；：降低；：增加；：不显著；：倍数变化；：每百万数 ；：特征门；：值；：拟杆菌门；：厚壁菌门；：梭杆菌门；：变形菌门；：螺旋体门；：疣微菌门。图 繁殖期与非繁殖期差异菌群火山图和门水平差异菌群曼哈顿图（校正，秩和检验）（，）动 物 营 养 学 报 卷 为进一步探究繁殖期与非繁殖期麝鼠肠道差异菌群，本研究使用了 方法进行分析。由图 可知，在非繁殖期毛螺菌科（）和梭菌目（）的相对丰度显著增加（），在繁殖期鞘脂杆菌科（）、梭 菌 科（）、消 化 链 球 菌 科（）、弯 曲 菌 科（）、肠杆菌科（）的相对丰度显著增加（）。：纲；：目；：科；：属；：鞘脂杆菌科；：鞘脂杆菌目；：鞘脂杆菌纲；：梭菌科；：毛螺菌科；：消化链球菌科；：梭菌目；：梭菌纲；：弯曲菌科；：弯曲菌目；：变形菌纲；：肠杆菌科；：肠杆菌目；：变形菌纲；：瘤胃球菌属；：产醋菌属；：黄曲霉属；：梭菌属；：弯曲菌属；：狭义梭菌属；：埃希氏志贺氏菌属；：线性判别分析得分 。图 线性判别分析效应量鉴定繁殖期与非繁殖期麝鼠代表性差异菌群（得分，）（，）菌群功能预测 对代表性序列 第 层级通路功能预测结果如图 所示，在非繁殖期富集的差异显著的功能通路有 个，分别为神经系统（）、转录（）和膜运输（），在繁殖期富集的差异显著的功能通路有 个，分别为其他氨基酸代谢（）、细胞进程和信号（）、辅助因子和维生素代谢（）、萜类化合物和聚酮化合物的代谢（）、能量代谢（）、传染病（）以及折叠、分类和降解（，）。讨 论 动物的季节性繁殖是指繁殖只发生在特定季节的现象。麝鼠作为季节性繁殖动物，在每年 月进行交配、妊娠、产仔等一系列繁殖活动，从 月到次年 月为非繁殖期，不进行生殖行为。麝鼠采食的饲料中三大有机物（蛋白质、碳水化合物和脂肪）可在体内进行生物氧化，释放能量以维持机体生命活动。其中，碳水化合物在植物性饲料中占 左右，是麝鼠能量的主要来源。肠道微生物群严重依赖宿主饮食获得代谢底物，主要从膳食碳水化合物中获取营养。未经近端消化的碳水化合物和难以消化的寡糖可被拟杆菌属（）、罗斯氏菌属（）、双歧杆菌属（）、粪杆菌属（）和肠杆菌属（）等微生物发酵产生短链脂肪酸等代谢产物作为结肠上皮细胞的主要能量来源。此外，肠道微生物在肠上皮细胞分化和增殖、肠道血管生成、消化和维生素合成、预防病原体、增加脂肪储存效率、中枢神经系统调节、期杨潇瀛等：麝鼠繁殖期和非繁殖期肠道微生物组成的比较分析免疫系统发育和成熟等方面均有重要作用。为了探究肠道微生物对季节性繁殖的潜在作用，本研究使用 扩增子测序技术比较了繁殖期和非繁殖期麝鼠肠道微生物组成和功能的变化，结果表明麝鼠在非繁殖期肠道微生物的丰富度和均匀度显著高于繁殖期。基于 距离矩阵，多样性中 显示麝鼠肠道微生物的群落结构按繁殖季节分别聚为一类，说明繁殖期和非繁殖期的肠道微生物群落结构存在差异。饮食、系统发育、年龄、基因型和其他因素会影响宿主肠道微生物的组成，其中饮食被认为是最重要的因素。麝鼠在繁殖期对营养需求量不断增加，饲粮中蛋白质含量增加，而非繁殖期饲粮中不含有高蛋白质和高脂肪。麝鼠在不同繁殖季节摄入饲粮的差异可能与麝鼠繁殖期与非繁殖期肠道微生物结构的差异有关。：其他氨基酸代谢；：细胞进程和信号；：辅助因子和维生素代谢；：神经系统；：转录；：萜类化合物和聚酮化合物的代谢；：膜运输；：能量代谢；：传染病；，：折叠、分类和降解；：置信区间；：平均占比；：平均占比差异；（）：校正 值。图 繁殖期与非繁殖期麝鼠肠道微生物在 第 层级通路中的功能预测差异分析 对麝鼠肠道微生物群落组成的分析表明，其优势菌门为拟杆菌门和厚壁菌门，该结果与本实验室之前研究的啮齿类动物达乌尔黄鼠（）肠道微生物组成中优势菌门一致。除此以外，等在北极地松鼠（）盲肠内容物中鉴定出 个菌门，大多数操作分类单元（，）被分配给拟杆菌门和厚壁菌门。等对十三线地松鼠（）盲肠内容物的 基因测序也表明微生物群以拟杆菌门、厚壁菌门和疣微菌门的成员为主。拟杆菌门和厚壁菌门之间有着共生关系，占所有肠道微生物的，这有益于宿主的能量吸收或储存，且在维持肠上皮细胞结构、促进代谢等方面具有重要作用。而厚壁菌门与拟杆菌门的比值升高也与某些疾病的流行有关，最常见的是由于能量收集效率提高而导致的肥胖。肠道微生物在门水平总体概况保持不变，但在属水平上的分布存在差异。本研究表明麝鼠肠道微生物在属水平的优势菌群为普氏菌属、巴恩斯氏菌属、梭菌属 簇和瘤胃球菌属，与其他啮齿类哺乳动物如小林姬鼠和野生达乌尔黄鼠的肠道优势菌属，不同。对麝鼠肠道菌群的差异分析表明，与非繁殖期相比，繁殖期有 个菌群的相对丰度减少，个菌群的相对丰度增加。在门水平上，相对于非繁殖期，繁殖期拟杆菌门、梭杆菌门和变形菌门的相对丰度升高，厚壁菌门的相对丰度降低。繁殖期厚壁菌门与拟杆菌门比值降低，保证了能量收集的稳定。除此以外，变形菌门具有多种生理学功能和形态变化，与厚壁菌门和拟杆菌门相比是最不稳定的菌门。根据 序列，变形菌门可分为 类，分别为 变形菌纲（）、变形菌纲（）、变形菌动 物 营 养 学 报 卷纲（）、变形菌纲（）、变形菌纲（）和变形菌纲（），可灵活调节新陈代谢，耐受低营养食物。结果同时表明非繁殖期毛螺菌科和梭菌目的相对丰度显著增加，在繁殖期鞘脂杆菌科、梭菌科、消化链球菌科、弯曲菌科和肠杆菌科的相对丰度显著增加，其中非繁殖期相对丰度显著增加的毛螺菌科属于厚壁菌门的梭菌属 簇，从出生开始就在肠道内定植，在物种丰富度及其在宿主一生中的相对丰度方面不断增加。肠道菌群对碳水化合物的代谢是向宿主提供营养和能量的关键过程。毛螺菌科的成员是短链脂肪酸的主要生产者之一，可以水解淀粉和其他糖以产生丁酸盐和其他短链脂肪酸，具有利用饮食衍生的多糖（包括淀粉、菊粉和阿拉伯木聚糖）的巨大能力。在繁殖期显著增加的肠杆菌科属于变形菌门变形菌纲肠杆菌目下的一科。可通过氧化多种简单有机化合物或发酵糖、有机酸或多元醇来获取能量。在肥胖个体肠道微生物中肠杆菌科的丰度显著增加，并与体重呈正相关。可见繁殖期与非繁殖期肠道微生物中菌群结构存在差异，有助于为繁殖提供良好保障。本研究还通过 预测了肠道微生物群的潜在功能，并确定在繁殖期和非繁殖期之间富集的显著差异的功能通路，结果表明在非繁殖期富集的显著差异的功能通路有 个，在繁殖期富集的显著差异的功能通路有 个，其中繁殖期多数富集于代谢相关通路，包括了氨基酸代谢、辅助因子和维生素代谢以及能量代谢。蛋白质、氨基酸、维生素等是人体正常生长、繁殖中所必需的化合物。麝鼠和其他单胃动物一样，能自动地调节采食量以满足对能量的需要。麝鼠在繁殖期对蛋白质的需要量较高，每 干物质中需含 左右的蛋白质，而冬季则需要 。饲粮中的能量蕴藏在营养物质之中，麝鼠对营养物质的代谢必然伴随着能量代谢。由于繁殖依赖于能量储存，饲粮能量水平在麝鼠饲养标准中占有很重要的地位，充足的能量储备对于 轴的正常运作是必要的，能够直接影响生产水平。肠道微生物作为代谢的调节剂，在能量和营养的吸收、代谢和储存中发挥着重要的作用。繁殖期与非繁殖期麝鼠肠道微生物结构和功能的差异有利于调节自身的能量平衡，以便更好的进行繁殖活动。结 论 麝鼠肠道微生物结构在繁殖期与非繁殖期存在差异，非繁殖期肠道微生物丰富度和均匀度均高于繁殖期。在门水平上，繁殖期麝鼠肠道微生物中拟杆菌门、梭杆菌门和变形菌门的相对丰度升高，厚壁菌门的相对丰度降低。在属水平上，非繁殖期毛螺菌科和梭菌目的相对丰度显著增加，在繁殖期鞘脂杆菌科、梭菌科、消化链球菌科、弯曲菌科、肠杆菌科的相对丰度显著增加。繁殖期麝鼠多数差异菌群富集于营养代谢相关通路，包括氨基酸代谢、辅助因子和维生素代谢和能量代谢等。参考文献：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，：期杨潇瀛等：麝鼠繁殖期和非繁殖期肠道微生物组成的比较分析，（）：，（）：徐鹏飞珍贵的毛皮动物 麝鼠科学种养，（）：，（）：（）金江 麝鼠的繁殖技术 毛皮动物饲养，（）：，（）：（）苏培祥有发展前途的经济动物麝鼠毛皮动物饲养，（）：，（）：（），：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：冯小鹿麝鼠营养代谢的需求特点与能量平衡当代畜禽养殖业，（）：，（）：（），：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（），（）：，（）：，（）：，：？，（）：，（）：，（）：，（），：，（）：，动 物 营 养 学 报 卷，（）：，：，（）：，（）：，：（责任编辑 菅景颖）（）（，）：，（），（）：，（），（），（）：；