酶蛋白的结构.pptx

酶蛋白的结构酶蛋白的结构酶蛋白的结构第1页酶蛋白的结构第2页酶蛋白的结构第3页酶蛋白的结构第4页蛋白质结构和功效关系蛋白质结构和功效关系v举例：举例：镰刀状细胞贫血病镰刀状细胞贫血病v镰镰刀刀状状细细胞胞贫贫血血病病是是最最早早被被认认识识一一个个分分子子病病，流流行行于于非非洲洲一一些些地地域域，患患者者红红细细胞胞形形态态异异常常，有有很很多多呈呈新新月月状状或或镰镰刀刀状状，在在红红细细胞胞脱脱氧氧时时镰镰刀刀状状细细胞胞数数量量增增加加，严严重重时时造造成成红红细细胞胞破破裂裂、溶溶血而致命。血而致命。v镰镰刀刀状状红红细细胞胞产产生生原原因因是是患患者者血血红红蛋蛋白白异异常常。血血红红蛋蛋白白是是红红细细胞胞内内起起携携带带氧氧气气功功效效一一个个主主要要蛋蛋白白质质，是是一一个个四四聚聚体体蛋蛋白白质质，由由两两个个亚亚基基和和两两个个亚亚基基组组成成（22），其其中中亚亚基基包包含含141个个氨氨基基酸酸残残基基，亚亚基基包包含含146个个氨氨基基酸酸残残基基。镰镰刀刀状状细细胞胞贫贫血血病病患患者者因因为为基基因因突突变变，其其血血红红蛋蛋白白（HbS）亚亚基基N末末端端第第6号号位位氨氨基基酸酸由由原原来来正正常常血血红红蛋蛋白白（HbA）高高度度极极性性Glu变变成成了了非非极极性性Val酶蛋白的结构第5页v这这种种改改变变造造成成血血红红蛋蛋白白表表面面电电荷荷降降低低，在在脱脱氧氧状状态态下下溶溶解解度度下下降降，发发生生不不正正常常聚聚集集，形形成成镰镰刀刀状状红红细细胞胞，严严重重时时造造成成红红细细胞胞破破裂裂。血血红红蛋蛋白白分分子子共共有有574个个氨氨基基酸酸残残基基组组成成，仅仅仅仅两两个个亚亚基基上上各各改改变变了了一一个个氨氨基基酸酸残残基基，生生理理功功效效就就发发生生了了如如此此大大改改变变，可见蛋白质一级结构对功效影响之大。可见蛋白质一级结构对功效影响之大。酶蛋白的结构第6页v牛胰核糖核酸酶复性试验牛胰核糖核酸酶复性试验v8个个CysSH形成形成4个二硫键组合方式有个二硫键组合方式有753=105种，种，因而重新形成正确配正确概率仅因而重新形成正确配正确概率仅1/105，酶蛋白的结构第7页第一节第一节 蛋白质一级结构研究方法蛋白质一级结构研究方法 v1.蛋白质分离纯化和相对分子质量测定蛋白质分离纯化和相对分子质量测定v2.2.确定蛋白质分子中多肽链数目确定蛋白质分子中多肽链数目v3.拆分并分离蛋白质分子多肽链拆分并分离蛋白质分子多肽链v4.测定每条多肽链氨基酸组成测定每条多肽链氨基酸组成v5.多肽链多肽链N末端和末端和C末端分析末端分析v6.6.多肽链局部断裂和肽段分离多肽链局部断裂和肽段分离v7.测定各个肽段氨基酸次序测定各个肽段氨基酸次序v8.8.确定肽段在多肽链中次序从而排列出多肽链氨基酸次序确定肽段在多肽链中次序从而排列出多肽链氨基酸次序v9.多肽链中二硫键位置确实定多肽链中二硫键位置确实定酶蛋白的结构第8页v1.蛋白质分离纯化和相对分子质量测定蛋白质分离纯化和相对分子质量测定v电泳单一带电泳单一带vSDSPAGE测分子量（质谱法）测分子量（质谱法）酶蛋白的结构第9页v2.2.确定蛋白质分子中多肽链数目确定蛋白质分子中多肽链数目v末端分析法末端分析法3.拆分并分离蛋白质分子多肽链拆分并分离蛋白质分子多肽链v氧化法氧化法v氧化法优点在于二硫键一旦拆开，不氧化法优点在于二硫键一旦拆开，不会重新形成连接，但在氧化过程中伴会重新形成连接，但在氧化过程中伴伴随一些副反应，伴随一些副反应，Met侧链被氧化生侧链被氧化生成亚砜，成亚砜，Trp侧链被破坏。侧链被破坏。v还原法还原法v为了预防游离巯基重新氧化，还需加为了预防游离巯基重新氧化，还需加入烷化剂如碘乙酸，使巯基上发生取入烷化剂如碘乙酸，使巯基上发生取代反应而不会重新被氧化代反应而不会重新被氧化酶蛋白的结构第10页酶蛋白的结构第11页4.测定每条多肽链氨基酸组成测定每条多肽链氨基酸组成v蛋白质完全水解：要求完全水解且不破坏氨基酸蛋白质完全水解：要求完全水解且不破坏氨基酸v1）酸水解：）酸水解：vv作水解程度时间图确定最正确时间作水解程度时间图确定最正确时间v110mg蛋白样品蛋白样品加加HCl抽真空抽真空封闭封闭烘箱烘箱v特点：特点：a）Trp完全破坏，生成不溶性物质完全破坏，生成不溶性物质vb）Ser、Thr、Tyr个个别别破破坏坏，Ser破破坏坏1015%，Thr、Tyr破破坏坏510%，应给予校正，应给予校正vc）AsnAspGluGlnvd）胱氨酸胱氨酸半胱氨酸半胱氨酸ve）大个别氨基酸不破坏大个别氨基酸不破坏酶蛋白的结构第12页v2）碱水解：）碱水解：v特点：特点：a)Trp不破坏不破坏b）大个别氨基酸破坏）大个别氨基酸破坏酶蛋白的结构第13页v分分离离检检测测：1）纸纸层层；2）薄薄层层；3）离离交交；4）氨基酸自动分析仪氨基酸自动分析仪酶蛋白的结构第14页5.多肽链多肽链N末端和末端和C末端分析末端分析v目标：有几条肽链；目标：有几条肽链；N N、C C末端是何氨基酸末端是何氨基酸v测测不不出出末末端端几几个个原原因因：蛋蛋白白质质分分子子为为环环肽肽；末末端端被被保保护试剂保护；末端是护试剂保护；末端是Prov51N端测定（介绍原理、分离检测方法和优缺点）端测定（介绍原理、分离检测方法和优缺点）v1）FDNB法（法（Sanger法；法；2.4二硝基氟苯法）二硝基氟苯法）va）原理：）原理：酶蛋白的结构第15页vb)分分离离检检测测：乙乙醚醚萃萃取取，DNPAa溶溶于于乙乙醚醚而而Aa不溶不溶v标准标准Aa+DNP反应反应纸层纸层喷茚三酮喷茚三酮v未知未知DNPAa纸层纸层喷茚三酮喷茚三酮v比比较较即即得得结结果果，若若结结果果是是两两点点以以上上则则证证实实是是有有几条肽链组成几条肽链组成vc）优点：反应条件温和，末端产物易分离）优点：反应条件温和，末端产物易分离v缺点：缺点：N端是端是Pro测不出；不能进行测不出；不能进行N端测序端测序vLys另另一一氨氨基基生生成成e-e-DNPLys，因因为为它它不不溶溶于于乙乙醚故不影响测定结果醚故不影响测定结果酶蛋白的结构第16页v2)2)丹磺酰氯法（丹磺酰氯法（DNS法）法）va)原理：酶蛋白的结构第17页vb）分离检测：）分离检测：DNSAa溶于乙酸乙酯，溶于乙酸乙酯，Aa不溶不溶v标准标准Aa+DNS反应反应纸层纸层荧光显色荧光显色v未知未知DNSAa纸层纸层荧光显色荧光显色v比比较较即即得得结结果果，若若结结果果是是两两点点以以上上则则证证实实是是有有几几条条肽链组成肽链组成vc）优优点点：灵灵敏敏度度高高；是是前前种种方方法法100倍倍；用用量量少少，样品量为样品量为0.12ngv缺缺点点：DNSPro、DNSTry被被破破坏坏；N端端是是Pro、Try测不出；不能进行测不出；不能进行N端测序端测序酶蛋白的结构第18页v3)Edman3)Edman降解法降解法 苯异硫氰酸酯法（苯异硫氰酸酯法（PITC法法)va)a)原理：原理：va）分离检测：）分离检测：PTHAa溶于乙酸乙酯、丁酸乙酯，溶于乙酸乙酯、丁酸乙酯，Aa不溶不溶vc）优点：）优点：N端是端是Pro可测；能进行可测；能进行N端测序端测序v缺点：灵敏度稍差缺点：灵敏度稍差酶蛋白的结构第19页v4）DansyClEdman法法v既可检测既可检测N端序列又有较高灵敏度端序列又有较高灵敏度酶蛋白的结构第20页v5)5)亮氨酸氨肽酶法亮氨酸氨肽酶法 v此此酶酶专专一一水水解解N端端羧羧基基形形成成肽肽键键，可可测测N端端序序列列，但不能测但不能测N端为端为Pro.酶蛋白的结构第21页v52C末端分析末端分析 vC末末端端分分析析方方法法也也有有很很多多，但但至至今今还还不不能能令令人人满意，常见有肼解法、还原法、羧肽酶法等。满意，常见有肼解法、还原法、羧肽酶法等。v1）肼解法）肼解法v原理：原理：酶蛋白的结构第22页vb）分离检测：）分离检测：v苯甲醛苯甲醛+酰肼酰肼沉淀沉淀离心离心v上清液中含游离基酸上清液中含游离基酸v2)还原法还原法v用用还还原原剂剂如如硼硼氢氢化化锂锂处处理理肽肽链链，则则C末末端端残残基基羧羧基基被被还还原原成成醇醇，将将肽肽链链完完全全水水解解后后，分分析析水水解解产产物物，其其中中氨氨基基醇醇对对应应即即为为C末末端端氨氨基基酸。酸。酶蛋白的结构第23页v3)羧肽酶法羧肽酶法v羧羧肽肽酶酶是是一一个个专专一一从从多多肽肽链链C末末端端开开始始逐逐一一水水解解氨氨基基酸酸残残基基蛋蛋白白水水解解酶酶。因因为为该该酶酶专专一一性性，当当它它作作用用于于多多肽肽链链时时，C末末端端残残基基首首先先被被水水解解下下来来，然然后后是是C末末端端第第二二个个氨氨基基酸酸残残基基，依依这这类类推推。依依据据氨氨基基酸酸释释放放动动力力学学曲曲线线，能能够够确确定定C末末端端氨氨基基酸酸以以及及靠靠近近C末末端端几几个个氨氨基基酸酸排排列列次次序序。不不过过这这是是理理想想情情况况，实实际际测测定定中中经经常常有有各各种种原原因因干干扰扰，极极难难确确定定C末末端端多多个个氨氨基基酸酸排排列列次次序。序。v羧肽酶羧肽酶A：a）Lys、His、Arg在在C末端不能水解末端不能水解vb）C末端是末端是Pro不能水解不能水解vc）C末端第二个是末端第二个是Pro，不论第一个是何氨基酸都不能水解，不论第一个是何氨基酸都不能水解v羧肽酶羧肽酶B：a）水解）水解C末端为末端为Lys、His、Argvb）C末端第二个是末端第二个是Pro，不论第一个是何氨基酸都不能水解，不论第一个是何氨基酸都不能水解酶蛋白的结构第24页v6.6.多肽链局部断裂和肽段分离多肽链局部断裂和肽段分离v在在氨氨基基酸酸次次序序测测定定时时，只只要要从从肽肽链链某某一一末末端端（通通常常是是N末末端端）起起逐逐一一将将氨氨基基酸酸残残基基断断裂裂下下来来，并并对对游游离离出出来来氨氨基基酸酸或或其其衍衍生生物物进进行行判判定定，就就能能够够确确定定氨氨基基酸酸序序列列。不不过过实实际际操操作作时时，因因为为每每次次末末端端氨氨基基酸酸残残基基发发生生断断裂裂效效率率不不能能到到达达100%，或或者者说说，在在大大多多数数肽肽段段在在断断裂裂第第二二个个氨氨基基酸酸残残基基时时，少少数数肽肽段段可可能能因因为为上上一一轮轮未未发发生生反反应应而而正正在在断断裂裂第第一一个个氨氨基基酸酸残残基基，这这么么势势必必给给测测定定带带来来干干扰扰。假假如如肽肽链链很很短短，这这么么干干扰扰不不会会对对测测定定产产生生重重大大影影响响；但但蛋蛋白白质质肽肽链链长长度度都都超超出出这这一一范范围围，这这么么测测定定将将无无法法进进行行下下去去。所所以以大大家家首首先先需需将将肽肽链链进进行行适适当当分分解解，将将其其断断裂裂成成若若干干长长度度适适当当肽肽段段，再再分分别别测测定定这这些些肽肽段段氨氨基酸次序。基酸次序。酶蛋白的结构第25页1 1溴化氰裂解法：溴化氰裂解法：vBrCNBrCN：专一水解：专一水解MetMet羧基形成键羧基形成键v优点：专一性强，切点少，产率高（优点：专一性强，切点少，产率高（85%85%）v*弱酸、弱碱也可使肽链水解但专一性不好弱酸、弱碱也可使肽链水解但专一性不好2 2酶解法：酶解法：v胰酶：水解碱性氨基酸羧基所形成键（胰酶：水解碱性氨基酸羧基所形成键（LysLys，ArgArg）v*碱性氨基酸羧基连接是碱性氨基酸羧基连接是ProPro则不能水解。则不能水解。v糜糜蛋蛋白白酶酶（胰胰凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶）：专专一一性性水水解解芳芳香香族族氨氨基基酸酸羧羧基基所所形成键（形成键（PhePhe，TryTry，TyrTyr）。）。v*若芳香族氨基酸羧基连接是若芳香族氨基酸羧基连接是ProPro则不能水解。则不能水解。v 分离肽链可用：分子筛；离子交换；等点聚焦（电泳法）分离肽链可用：分子筛；离子交换；等点聚焦（电泳法）酶蛋白的结构第26页酶蛋白的结构第27页7.测定各个肽段氨基酸次序测定各个肽段氨基酸次序v测测定定肽肽段段氨氨基基酸酸次次序序方方法法有有：Edman降降解解法法、酶酶解解法法、气气相相色色谱谱质质谱谱联联使使用用方方法法等等，其其中中最最常常使使用用是是Edman降解法。降解法。vEdman降降解解法法原原理理是是利利用用前前述述苯苯异异硫硫氰氰酸酸酯酯（PITC），又又称称Edman试试剂剂与与N末末端端氨氨基基酸酸残残基基氨氨基基之之间间特特异异性性反反应应，每每轮轮反反应应后后N末末端端氨氨基基酸酸脱脱落落，并并生生成成PTH氨氨基基酸酸。经经过过层层析析等等方方法法判判定定PTH氨氨基基酸酸种种类类，就就能能够够确确定定肽肽链链中中对对应应位位置置氨氨基基酸酸。经经过过n轮轮反反应应，即即可可确定由肽段中确定由肽段中N末端起末端起n个氨基酸次序。个氨基酸次序。酶蛋白的结构第28页酶蛋白的结构第29页酶蛋白的结构第30页8.8.确定肽段在多肽链中次序从而排列出多肽确定肽段在多肽链中次序从而排列出多肽链氨基酸次序链氨基酸次序v至至此此，已已经经得得出出了了多多肽肽链链被被断断裂裂成成各各个个肽肽段段氨氨基基酸酸次次序序，但但因因为为没没有有这这些些肽肽段段在在多多肽肽链链中中次次序序信信息息，还还是是无无法法排排出出整整个个多多肽肽链链氨氨基基酸酸次次序序。为为此此，必必须须用用两两种种或或者者两两种种以以上上方方法法来来断断裂裂多多肽肽链链，比比如如用用两两种种蛋蛋白白酶酶分分别别水水解解多多肽肽链链，将将得得到到两两套套断断裂裂位位点点不不一一样样肽肽段段，分分别别确确定定这这两两套套肽肽段段氨氨基基酸酸次次序序，然然后后利利用用这这两两套套肽肽段段氨氨基基酸酸次次序序彼彼此此之之间间有有交交织织重重合合，能能够够确确定定整整条条多多肽链氨基酸次序。肽链氨基酸次序。酶蛋白的结构第31页v经经过过末末端端分分析析得得到到：N末末端端残残基基为为I，C末末端端残残基为基为Lv用用胰胰蛋蛋白白酶酶水水解解得得到到第第一一套套肽肽段段，测测定定出出氨氨基基酸次序分别为：酸次序分别为：vMTYAGKISREALCAFRDALKv用用胰胰凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶水水解解得得到到第第二二套套肽肽段段，测测定定出出氨基酸次序分别为：氨基酸次序分别为：vTYREALAGKDALISRMKCAF酶蛋白的结构第32页v因因为为N末末端端残残基基为为I，ISR和和ISRM是是N末末端端肽肽段段；又又因因为为C末末端端残残基基为为L，EAL和和REAL是是C末末端端肽肽段段。利用两套肽段氨基酸次序彼此之间重合关系，得出：利用两套肽段氨基酸次序彼此之间重合关系，得出：v第第一一套套肽肽段段：N末末端端ISRMTYAGKDALKCAFREALC末端末端v第第二二套套肽肽段段：N末末端端ISRMTYAGKDALKCAFREALC末端末端v推出完整肽链次序：推出完整肽链次序：ISRMTYAGKDALKCAFREALv在在上上例例中中，两两套套肽肽段段之之间间恰恰好好能能够够相相互互跨跨过过切切口口而而重重合合，从从而而能能确确定定出出肽肽段段在在多多肽肽链链中中位位置置，拼拼凑凑出出整整条条肽链氨基酸次序。肽链氨基酸次序。酶蛋白的结构第33页v9.多肽链中二硫键位置确实定多肽链中二硫键位置确实定v对对于于含含有有二二硫硫键键蛋蛋白白质质，咱咱们们在在分分析析多多肽肽链链氨氨基基酸酸次次序序前前先先将将其其拆拆开开，然然而而在在测测定定完完多多肽肽链链氨氨基基酸酸次次序序后后需需要要确确定定链链内内和和链链间间二二硫硫键键位位置置，常常见见方方法法是是对对角角线线电电泳泳法法。不不拆拆开开二二硫硫键键直直接接用用蛋蛋白白酶酶水水解解蛋蛋白白质质，所所得得肽肽段段样样品品点点样样到到滤滤纸纸中中央央电电泳泳原原点点，在在第第一一个个方方向向上上进进行行电电泳泳，则则不不一一样样肽肽段段按按其其所所带带电电荷荷和和分分子子大大小小分分离离。结结束束后后将将滤滤纸纸在在过过甲甲酸酸蒸蒸气气中中熏熏，二二硫硫键键被被氧氧化化和和拆拆开开。将将滤滤纸纸旋旋转转90，在在相相同同条条件件下下进进行行第第二二个个方方向向上上电电泳泳。这这时时，对对于于不不含含二二硫硫键键肽肽段段，因因为为没没有有发发生生改改变变，电电泳泳迁迁移移率率不不变变，电电泳泳后后位位置置应应处处于于对对角角线线上上；而而含含有有二二硫硫键键肽肽段段，其其大大小小和和电电荷荷发发生生了了改改变变，电电泳泳迁迁移移率率也也要要改改变变，电电泳泳后后位位置置偏偏离离对对角角线线，将将这这些些肽肽段段提提取取出出来来，进进行行氨氨基基酸酸次次序序分分析析，与与已已经经测定多肽链氨基酸次序相比较，即可推断出二硫键位置。测定多肽链氨基酸次序相比较，即可推断出二硫键位置。酶蛋白的结构第34页酶蛋白的结构第35页v除除了了上上述述经经典典蛋蛋白白质质一一级级结结构构测测定定方方法法外外，因因为为核核苷苷酸酸序序列列测测定定技技术术发发展展快快速速，当当前前DNA核核苷苷酸酸序序列列测测定定已已完完全全实实现现自自动动化化，而而蛋蛋白白质质氨氨基基酸酸次次序序是是由由DNA所所决决定定，大大家家经经过过提提纯纯指指导导蛋蛋白白质质合合成成mRNA，再再将将mRNA经经过过逆逆转转录录作作用用得得到到cDNA，并并扩扩增增cDNA，然然后后测测定定其其核核苷苷酸酸序序列列，依依据据三三联联体体遗遗传传密密码码规规则则可可确确定定出出蛋蛋白质氨基酸次序。白质氨基酸次序。v到当前为止，已经有到当前为止，已经有10万种以上蛋白质完成了万种以上蛋白质完成了一级结构测定，对于大多数常见蛋白质，经过一级结构测定，对于大多数常见蛋白质，经过查阅数据库，可得到关于一级结构资料。查阅数据库，可得到关于一级结构资料。酶蛋白的结构第36页第二节第二节 蛋白质空间结构研究方法蛋白质空间结构研究方法v二二级级结结构构：a-a-螺螺旋旋（a a-helix)；b-b-片片层层(-sheet-sheet)；b-b-转角转角(-turn)-turn)；无规卷曲无规卷曲(random)v维维持持键键：氢氢键键、疏疏水水键键、范范德德华华力力、离离子子键键、配配位键等位键等vR基基团团对对a-a-螺螺旋旋影影响响：a)组组成成a-a-螺螺旋旋要要求求R不不太太大大，不不带带电电荷荷b）几几个个相相连连氨氨基基酸酸R带带同同种种电电荷荷，不不形形成成a-a-螺螺旋旋c）R带带电电荷荷但但间间断断，可可形形成成a-a-螺螺旋旋酶蛋白的结构第37页v*=57，=47是是形形成成a-a-螺螺旋旋条条件件，不不满满足足此此条件不能形成条件不能形成a-a-螺旋螺旋v*Gly不不参参加加a-a-螺螺旋旋，原原因因：Glya-a-C上上连连两两个个H，故故、无法确定无法确定v*Pro、Hyp不不参参加加a-a-螺螺旋旋，原原因因：不不形形成成角角；空空间障碍不形成氢键间障碍不形成氢键v=119，=+113时时，蛋蛋白白质质分分子子成成平平行行b-b-片片层层v=139，=+135时时，蛋蛋白白质质分分子子成成反反平平行行b-b-片层片层v从能量上看，反平行式要比平行式更稳定。从能量上看，反平行式要比平行式更稳定。酶蛋白的结构第38页 三级结构三级结构v二二级级结结构构深深入入卷卷曲曲形形成成,含含有有三三级级结结构构蛋蛋白白普通为球形或椭球形普通为球形或椭球形v纤维蛋白含有超二级结构纤维蛋白含有超二级结构(超螺旋超螺旋)四级结构四级结构v含有独立三级结构间结构含有独立三级结构间结构酶蛋白的结构第39页晶体蛋白测定晶体蛋白测定vX光光衍衍射射古古老老方方法法，1958年年英英国国科科学学家家开开始始利利用用，分分辨辨率率6A0，当当前前分分辨辨率率1.4A0，我我国国X光光衍衍射射仪仪分分辨辨率率1.8A0，测胰岛素结构。，测胰岛素结构。v缺点：只能测晶体，不能测溶液。缺点：只能测晶体，不能测溶液。不能测氢原子位置，故测不出氢键作用。不能测氢原子位置，故测不出氢键作用。只能测静态酶结构，无法测酶催化反应动态。只能测静态酶结构，无法测酶催化反应动态。v当前有较新试验方法当前有较新试验方法中子衍射。中子衍射。酶蛋白的结构第40页溶液中构象测定溶液中构象测定va)紫紫外外吸吸收收法法（常常见见方方法法）：Try，Tyr，Phe在在紫紫外外波波长长范范围围有有最最大大光光吸吸收收，产产生生紫紫外外吸吸收收光光谱谱。受受pH、溶溶剂剂或或邻邻近近分子、邻近发色团相对取向影响。分子、邻近发色团相对取向影响。v当前用紫外吸收法能够探讨以下问题：当前用紫外吸收法能够探讨以下问题：v芳芳香香族族氨氨基基酸酸在在表表面面？在在内内部部？极极性性环环境境？非非极极性性环环境境？数数量量？(氨氨基基酸酸由由极极性性到到非非极极性性，上上升升。极极性性溶溶液液中中，氨氨基基酸酸在在蛋蛋白白中中，大大于于游游离离时时，一一定定在在蛋蛋白白内内部部且且被被非非极极性性氨氨基基酸酸包包围围。极极性性改改变变对对，影影响响大大，氨氨基基酸酸一一定定在表面。）在表面。）v外界条件影响，二级、三级结构有没有改变？改变过程？外界条件影响，二级、三级结构有没有改变？改变过程？酶蛋白的结构第41页vb)荧光光谱法荧光光谱法vTyr，Try，Phe能能发发射射荧荧光光。最最大大荧荧光光强强度度波波长长为为348nm、303nm、282nm，发发光光强强度度Try：Tyr：Phe=100：9：0.5。故故普普通以通以Try为准，荧光灵敏度是紫外为准，荧光灵敏度是紫外103104倍。倍。v用用荧荧光光光光谱谱法法可可研研究究蛋蛋白白质质分分子子构构象象改改变变、酶酶活活性性部部位位结结构构、Try和和Tyr残基微环境、蛋白质变性。残基微环境、蛋白质变性。v蛋白位于极性溶剂时，蛋白位于极性溶剂时，max短波，短波，Try进入蛋白内部非极性区。进入蛋白内部非极性区。v蛋白位于非非极性溶剂，蛋白位于非非极性溶剂，max短波，短波，Try到蛋白表面。到蛋白表面。v紫外测值，纯酶需配成紫外测值，纯酶需配成0.5mg/mlv荧光测值，纯酶需配成荧光测值，纯酶需配成0.035mg/mlv研研究究酶酶活活性性部部位位普普通通要要引引入入一一个个荧荧光光探探针针.此此试试剂剂要要求求与与酶酶结结合合牢牢靠靠、不不影影响响底底物物结结合合。探探针针在在水水中中，荧荧光光很很小小；在在非非极极性性中中增大。增大。v例例：酶酶+荧荧光光标标识识底底物物：荧荧光光强强度度上上升升，峰峰值值移移向向短短波波,酶酶活活部部位是疏水区位是疏水区酶蛋白的结构第42页vc)园二色谱法（园二色谱法（CD谱）谱）vCD光光谱谱图图：远远紫紫外外区区185nm245nm，吸吸光光是是肽肽键键所所致致，故故可可看看出出主主链链，可可算算出出螺螺旋、旋、折叠含量。折叠含量。v近近紫紫外外区区245nm320nm，吸吸光光是是Tyr、Trp、Phe所所致致，故故可可看看出出芳芳香香族族氨氨基基酸酸所所在在微环境。微环境。酶蛋白的结构第43页v至至今今为为止止大大家家还还无无法法做做到到直直接接观观察察蛋蛋白白质质分分子子中中原原子子和和原原子子团团排排列列，光光学学显显微微镜镜最最大大分分辨辨率率在在0.2m，而而蛋蛋白白质质分分子子内内各各原原子子之之间间距距离离在在0.1nm左左右右。当当前前大大家家对对蛋蛋白白质质空空间间结结构构进进行行研研究究都都是是借借助助于于一一些些辐辐射射方方法法，常常见见包包含含X射射线线衍衍射射法法、核核磁磁共共振振、荧荧光光光光谱谱法法、旋旋光光色色散散、圆圆二二色色性性、拉拉曼曼光光谱谱、扫扫描描隧隧道道显显微微技技术术、原原子子力力显显微微技技术术，等等。，等等。酶蛋白的结构第44页v例例1氨氨基基酸酸组组成成Phe+Pro+2Lys+GluEdman降降解解PTHGlu，胰胰酶酶，羧羧肽肽酶酶A、B均均不不可可水水解成氨基酸或小肽，求次序。解成氨基酸或小肽，求次序。酶蛋白的结构第45页v例例2：A肽经酸解得肽经酸解得:vLys+His+Asp+2Glu+Ala+Val+Tyr+2NH3。v经经FDNB得得DNPAspv经羧肽酶得经羧肽酶得Valv经经胰胰酶酶得得（1）Lys+Asp+Glu+Ala+Tyr（PH6.4是是等等电电点）（点）（2）His+Glu+Val（PH6.4带带+电荷）电荷）v（2）经）经FDNB得得DNPHis。v经胰凝乳蛋白酶得（经胰凝乳蛋白酶得（1）Asp+Ala+Tyr（PH6.4中性）中性）v（2）Lys+His+2Glu+Val（PH6.4带带+电荷）电荷）v求次序。求次序。酶蛋白的结构第46页v例例3（1）肽肽经经酸酸解解得得Try+Ala+Arg+2Ser+Lys+Phe+Met+Prov（2）肽经）肽经FDNB法得法得DNPAlaDNPLysv（3）肽经羧肽酶）肽经羧肽酶A不能测出不能测出C末端氨基酸末端氨基酸v（4）肽经羧肽酶）肽经羧肽酶B不能测出不能测出C末端氨基酸末端氨基酸v（5）肽肽经经溴溴化化氰氰得得Ser+Try+Pro；Ala+Arg+Ser+Lys+Phe+Metv（6）肽肽 经经 胰胰 凝凝 乳乳 蛋蛋 白白 酶酶（chT）得得 Ser+Pro；Met+Try；Phe+Lys+Ser+Arg+Alav（7）肽肽 经经 胰胰 酶酶（T）得得 Ala+Arg；Lys+Ser；Phe+Try+Met+Ser+Prov求次序。求次序。酶蛋白的结构第47页v例例1v答案：答案：GluPheLysProLysv解解法法：PTHGluN末末端端为为Glu，胰胰酶酶不不水水解解故故有有LysProv羧羧肽肽酶酶A不不水水解解：Lys为为C末末端端，Pro为为C末末端端，Pro为为C末端第二。末端第二。v羧肽酶羧肽酶B不水解：不水解：Pro为为C末端第二。末端第二。v故故Pro为为C末端第二。末端第二。v故有故有GluPheLysProLys或或GluLysLysProPhev若若是是后后一一个个胰胰酶酶可可将将其其水水解解成成GluLys，LysProPhe，而试验显示胰酶不水解，故只能是第一个情况。，而试验显示胰酶不水解，故只能是第一个情况。酶蛋白的结构第48页v例例2答案：答案：AsnAlaTyrGluLysHisGlnValv解法：酸讲解明解法：酸讲解明Asp和和2Glu中有两个是以酰胺状态存在中有两个是以酰胺状态存在vFDNB得得N末端是末端是Aspv羧肽酶得羧肽酶得C末端是末端是Valv胰胰酶酶水水解解碱碱性性氨氨基基酸酸羧羧基基所所形形成成键键，且且在在His+Glu+Val中中His为为N末末端端。综综合以上四项有合以上四项有Asp（）（）（）（）（）（）LysHisGluVal（1）v胰凝乳蛋白酶水解芳香族氨基酸羧基所形成键，故有胰凝乳蛋白酶水解芳香族氨基酸羧基所形成键，故有AspAlaTyr（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（2）v由（由（1）（）（2）得）得AspAlaTyrGluLysHisGluValv因因为为Lys+Asp+Glu+Ala+Tyr（pH6.4是是等等电电点点）故故AsporGlu是是以以酰酰胺胺状状态态存在。存在。v又因为又因为His+Glu+Val（PH6.4带带+电荷）故电荷）故Glu应为应为Gln所以原次序应为所以原次序应为AspAlaTyrGluLysHisGlnValv又因为（又因为（1）Asp+Ala+Tyr（PH6.4中性）得中性）得Asp为为Asnv（2）Lys+His+2Glu+Val（PH6.4带带+电荷）得电荷）得2Glu中只有一个中只有一个Glu，而另一个应为而另一个应为Glnv最终止果为最终止果为AsnAlaTyrGluLysHisGlnVal酶蛋白的结构第49页v例例3答案：答案：AlaArgSerLysPheMetTrySerProv解法：（解法：（2）说明）说明N末端为末端为Ala；（；（3）（）（4）说明）说明Pro要么在要么在C末端要么在末端要么在C末端第二；（末端第二；（5）说明溴化氰专）说明溴化氰专一水解一水解Met羧基所形成键，故应将肽分解成两段，因羧基所形成键，故应将肽分解成两段，因为为Ala在在N末端故有末端故有Ala（）（）（）（）（）（）（）（）Met（）（）（）（）（）；（）；（6）说明胰凝乳蛋白酶水解芳香族）说明胰凝乳蛋白酶水解芳香族氨基酸羧基所形成键，且芳香族氨基酸羧基连接是氨基酸羧基所形成键，且芳香族氨基酸羧基连接是Pro不能水解，故有不能水解，故有Ala（）（）（）（）（）（）PheMetTrySerPro；（；（7）说明胰酶水解碱性氨基酸羧基所形成键，）说明胰酶水解碱性氨基酸羧基所形成键，故有故有AlaArgSerLysPheMetTrySerPro。酶蛋白的结构第50页