重组DNA药物医学知识专家讲座.pptx

第七章第七章 重组重组DNADNA药品药品一、重组一、重组DNADNA技术与基因工程基本定义技术与基因工程基本定义重组重组DNADNA技术技术是指将一个生物体（是指将一个生物体（供体供体）基因与）基因与载体载体在体外进行拼接重组，然后转入另一个生物体（在体外进行拼接重组，然后转入另一个生物体（受体受体）内，使之按照人们意愿稳定遗传并表示出新产物或新内，使之按照人们意愿稳定遗传并表示出新产物或新性状性状DNADNA体外操作程序，也称为体外操作程序，也称为分子克隆技术分子克隆技术。所以，所以，供体供体、受体受体、载体载体是重组是重组DNADNA技术三大基本元技术三大基本元件。件。重组DNA药物医学知识专家讲座第1页基因工程基因工程是指重组是指重组DNADNA技术产业化设计与应用，技术产业化设计与应用，包含包含上游技术上游技术和和下游技术下游技术两大组成部分。两大组成部分。上游技术指是基因重组、克隆和表示设计与构建上游技术指是基因重组、克隆和表示设计与构建（即重组（即重组DNADNA技术）；而下游则包括到基因工技术）；而下游则包括到基因工程菌或细胞大规模培养以及基因产物分离纯化过程菌或细胞大规模培养以及基因产物分离纯化过程。程。重组DNA药物医学知识专家讲座第2页优点：优点：1 1、可大量生产过去难以取得生理活性蛋白和、可大量生产过去难以取得生理活性蛋白和多肽；去除内源性物质不足之处多肽；去除内源性物质不足之处2 2、提供足够数量生理活性物质，以进行生理、提供足够数量生理活性物质，以进行生理生化、结构研究生化、结构研究3 3、利用基因工程技术可发觉、挖掘更多内源、利用基因工程技术可发觉、挖掘更多内源性生理活性物质性生理活性物质4 4、取得新型化合物、取得新型化合物重组DNA药物医学知识专家讲座第3页主要基因工程产品研制、开发、上市时间主要基因工程产品研制、开发、上市时间主要基因工程产品研制、开发、上市时间主要基因工程产品研制、开发、上市时间产品产品人生长激素释放抑制素（人生长激素释放抑制素（SRM)人胰岛素人胰岛素首次克隆首次克隆表示时间表示时间国家国家用途用途首次进入首次进入市场时间市场时间国家国家/地域地域1977日本日本治疗巨人症治疗巨人症1978美国美国治疗糖尿病治疗糖尿病1982欧洲欧洲人生长激素（人生长激素（HGH)1979美国美国治疗侏儒症治疗侏儒症1985美国美国人人干扰素（干扰素（IFN)1980美国美国治疗病毒感染症治疗病毒感染症1985美国美国乙肝疫苗乙肝疫苗1983美国美国预防乙型肝炎预防乙型肝炎1986欧洲欧洲人白细胞介素人白细胞介素21984日本日本治疗肿瘤治疗肿瘤1989欧洲欧洲人促红细胞生成素人促红细胞生成素治疗贫血治疗贫血1988欧洲欧洲人粒细胞集落刺激因子人粒细胞集落刺激因子治疗中性白细胞治疗中性白细胞降低症降低症1991美国美国人组织纤溶酶原激活剂人组织纤溶酶原激活剂（t-PA)治疗血栓症治疗血栓症1987美国美国重组DNA药物医学知识专家讲座第4页DNADNA重组药品制造主要步骤重组药品制造主要步骤重组药品制造主要步骤重组药品制造主要步骤取得目标基因取得目标基因DNA体外重组体外重组（切与连）（切与连）载体选择受体细胞选择重组重组DNA分子转化分子转化（转）（转）转化子筛选与判定转化子筛选与判定（选）（选）外源基因大规模表示和分离纯化外源基因大规模表示和分离纯化产品检验和制剂制备产品检验和制剂制备重组DNA药物医学知识专家讲座第5页重组DNA药物医学知识专家讲座第6页二、基本过程二、基本过程上游阶段：试验室 取得目标基因、酶切和酶连、插入适当载体、转入宿主细胞、复制、目标基因分析确证、表示、筛选适当表示系统等下游阶段：将试验室结果产业化 发酵参数确定、新型生物反应器研制、高效分离介质及装置开发、生物传感器设计制造、电子计算机优化控制、产品质量控制v注意：上游注意：上游DNA重组设计必须以简化下游操作工艺和装备为重组设计必须以简化下游操作工艺和装备为指导思想；而下游过程则是上游基因重组蓝图表达和确保，指导思想；而下游过程则是上游基因重组蓝图表达和确保，这是基因工程产业化基本标准。这是基因工程产业化基本标准。重组DNA药物医学知识专家讲座第7页1 1、目标基因取得、目标基因取得1 1）、鸟枪法（基因文库）、鸟枪法（基因文库）基因组基因组DNADNA提取提取 限制性内切酶部分水解限制性内切酶部分水解与载体连接与载体连接转化、扩增与筛选转化、扩增与筛选2 2）、逆转录法（）、逆转录法（cDNAcDNA文库）文库）mRNAmRNA纯化纯化cDNAcDNA第一合成第一合成第二链合成第二链合成 cDNA cDNA克隆克隆将重组体导入宿主细胞将重组体导入宿主细胞 cDNAcDNA文库判定文库判定目标目标cDNAcDNA克隆分离和判定克隆分离和判定3 3）、）、合成法合成法4 4）、）、PCRPCR法法重组DNA药物医学知识专家讲座第8页4、PCR法或逆转录法或逆转录PCR（RT-PCR）经典PCR反应包含 模板变性 94以上（12）退火 5055（12）延伸 72（12）在高温聚合酶作用下，以DNA单链为模板，由引物起始从53 延伸。重组DNA药物医学知识专家讲座第9页(c)(c)(b)(b)引物引物引物引物2 2553333335555(d)(d)新引物新引物新引物新引物5533靶靶靶靶DNADNA扩增扩增扩增扩增(a)(a)5533引物引物引物引物1 13 3 553355引物引物引物引物2 2互补链互补链互补链互补链引物引物引物引物1 1互补链互补链互补链互补链单位长度链单位长度链单位长度链单位长度链不一样长度链不一样长度链不一样长度链不一样长度链5 5 3 3 3355引物引物引物引物1 1互补链互补链互补链互补链引物引物引物引物2 2互补链互补链互补链互补链目标片段（不一样长度链未示出）目标片段（不一样长度链未示出）目标片段（不一样长度链未示出）目标片段（不一样长度链未示出）聚合酶链式反应示意图聚合酶链式反应示意图聚合酶链式反应示意图聚合酶链式反应示意图(e)(e)(f)(f)(g)(g)重组DNA药物医学知识专家讲座第10页55333355靶靶靶靶DNADNA片段片段片段片段引物引物引物引物A A5 55 5引物引物引物引物AA3333PCRPCRPCRPCRPCRPCR3 33 35555PCRPCR引物引物引物引物B B引物引物引物引物C C5 55 53333混合混合混合混合,变性变性变性变性,退火退火退火退火5533553333553355+DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶5533335555333355用引物用引物用引物用引物B B和和和和C C作作作作PCRPCRPCRPCRPCRPCR定点诱变定点诱变定点诱变定点诱变PCRPCR用于基因突变用于基因突变重组DNA药物医学知识专家讲座第11页重组DNA药物医学知识专家讲座第12页重组DNA药物医学知识专家讲座第13页化学合成法化学合成法 在已知DNA序列或多肽普通结构时，如链长在 60bp100bp可用化学合成法直接合成DNA。重组DNA药物医学知识专家讲座第14页重组DNA药物医学知识专家讲座第15页2 2、基因表示、基因表示1 1）、选择宿主细胞）、选择宿主细胞 原核原核 大肠杆菌大肠杆菌：生长快；遗传研究深入；产品多为：生长快；遗传研究深入；产品多为胞内（包含体）或周质中；不能糖基化修饰。胞内（包含体）或周质中；不能糖基化修饰。需注意内毒素污染。需注意内毒素污染。枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌：分泌力强，不形成包含体；不分泌力强，不形成包含体；不修饰；胞外酶可能会降解产物修饰；胞外酶可能会降解产物 链霉菌链霉菌：分泌能力强；不致病，安全；有糖基：分泌能力强；不致病，安全；有糖基化能力。化能力。重组DNA药物医学知识专家讲座第16页优点：易大量生产，成本低，周期短 缺点：多为胞内表示、提取困难，易生成包含体、含起始密码Met(AUG)，有内毒素毒性重组DNA药物医学知识专家讲座第17页真核真核酵母酵母：研究基因表示调控最有效单细胞真核微生：研究基因表示调控最有效单细胞真核微生物；基因组小，仅为大肠杆菌物；基因组小，仅为大肠杆菌4 4倍；传代时间倍；传代时间短；无毒；有分泌功效和修饰功效；已用于干短；无毒；有分泌功效和修饰功效；已用于干扰素、乙肝表面抗原等重组扰素、乙肝表面抗原等重组DNADNA药品生产。药品生产。丝状真菌丝状真菌：有很强蛋白质分泌能力，能正确加工：有很强蛋白质分泌能力，能正确加工，糖基化方式与高等生物相同，有成熟发酵和，糖基化方式与高等生物相同，有成熟发酵和后处理工艺后处理工艺哺乳动物细胞哺乳动物细胞：类似天然产物，但培养条件苛刻：类似天然产物，但培养条件苛刻重组DNA药物医学知识专家讲座第18页大肠杆菌与真核细胞表示系统比较大肠杆菌与真核细胞表示系统比较大肠杆菌大肠杆菌:发酵发酵 包含体包含体 复性复性 纯化纯化 目标蛋白目标蛋白真核细胞真核细胞:发酵发酵 上清液上清液 纯化纯化 目标蛋白目标蛋白重组DNA药物医学知识专家讲座第19页大肠杆菌表示重组蛋白易形成包含体大肠杆菌表示重组蛋白易形成包含体 高效表示目标蛋白高效表示目标蛋白 在大肠杆菌内形成大在大肠杆菌内形成大 量无活性包含体。量无活性包含体。因无法有效处理复因无法有效处理复 性问题，在美国每年性问题，在美国每年 造成经济损失就达造成经济损失就达 几十亿美元几十亿美元 包含体电镜图包含体电镜图重组DNA药物医学知识专家讲座第20页蛋白质复性概念蛋白质复性概念将蛋白质从结构不规则、无将蛋白质从结构不规则、无 活性状态，恢复到有唯一活性状态，恢复到有唯一 立体结构、有生物活性立体结构、有生物活性 状状态过程称为态过程称为蛋白质复性蛋白质复性。重组DNA药物医学知识专家讲座第21页2 2）、表示载体）、表示载体 要求：要求：a a、能独立复制、能独立复制b b、有灵活多克隆位点和方便筛选标识、有灵活多克隆位点和方便筛选标识c c、含有有效运载外源基因能力，能携带大小、含有有效运载外源基因能力，能携带大小不一样外源基因不一样外源基因d d、轻易控制，在细胞内稳定性高，安全可靠。、轻易控制，在细胞内稳定性高，安全可靠。重组DNA药物医学知识专家讲座第22页 如大肠杆菌如大肠杆菌pBV220pBV220系统，为温度诱导表示系统，为温度诱导表示载体，已成功用于载体，已成功用于IL-2IL-2，IL-3IL-3，IFNIFN等等 pET pET系统，最有潜力系统，可用乳糖代替系统，最有潜力系统，可用乳糖代替IPTGIPTG（异丙基硫代（异丙基硫代-D-D-半乳糖），产物可半乳糖），产物可达细胞总蛋白达细胞总蛋白2030%2030%，表示量可达总蛋白，表示量可达总蛋白50%50%。重组DNA药物医学知识专家讲座第23页pETpETpETpET载体载体载体载体重组DNA药物医学知识专家讲座第24页 3 3）、构建工程菌）、构建工程菌 目标基因与载体目标基因与载体DNADNA连接连接v重组重组DNADNA向宿主细胞内转移向宿主细胞内转移v筛选与判定带有目标基因阳性克隆筛选与判定带有目标基因阳性克隆v影响目标基因表示原因影响目标基因表示原因重组DNA药物医学知识专家讲座第25页三、重组药品分离纯化三、重组药品分离纯化 A A 重组蛋白分离纯化方法选择基本标准重组蛋白分离纯化方法选择基本标准 针对不用产物表示形式采取不一样策略针对不用产物表示形式采取不一样策略针对不一样性质重组蛋白选择不一样层析类型针对不一样性质重组蛋白选择不一样层析类型各种分离纯化技术联合利用各种分离纯化技术联合利用适当分离纯化介质选择适当分离纯化介质选择分离纯化过程规模化分离纯化过程规模化重组DNA药物医学知识专家讲座第26页针对不一样产物表示形式采取不一样策略针对不一样产物表示形式采取不一样策略 采取采取分泌型分泌型战略表示重组蛋白，通常体积大、浓度战略表示重组蛋白，通常体积大、浓度低，所以应在纯化之前采取沉淀或超滤等方法先进行低，所以应在纯化之前采取沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理；浓缩处理；采取采取包涵体包涵体型战略表示重组蛋白，应先离心回收包型战略表示重组蛋白，应先离心回收包涵体；涵体；采取采取融合型融合型战略表示重组蛋白，普通是胞内可溶性，战略表示重组蛋白，普通是胞内可溶性，拟首先选取亲和层析进行纯化拟首先选取亲和层析进行纯化 表示在表示在细胞膜和细胞壁之间间隙中细胞膜和细胞壁之间间隙中蛋白质，应用低蛋白质，应用低浓度溶菌酶处理，然有再用渗透压休克法释放重组蛋浓度溶菌酶处理，然有再用渗透压休克法释放重组蛋白。白。重组DNA药物医学知识专家讲座第27页针对不一样性质重组蛋白选择不一样层析类型针对不一样性质重组蛋白选择不一样层析类型 等电点等电点处于极端区域（处于极端区域（大于大于8 8或小于或小于5 5）重组蛋白应首选）重组蛋白应首选离离子交换法子交换法进行分离，这么很轻易除去几乎全部杂蛋白；进行分离，这么很轻易除去几乎全部杂蛋白；重组蛋白特异性重组蛋白特异性配体配体、底物底物、抗体抗体、糖链糖链等都是首选等都是首选亲和层亲和层析析纯化方法主要条件，标准是它们与目标蛋白之间解离常数应纯化方法主要条件，标准是它们与目标蛋白之间解离常数应在适当范围内（在适当范围内（10108 810104 4mol/Lmol/L）;疏水层析疏水层析和和反相层析反相层析是依据蛋白质是依据蛋白质疏水性疏水性差异进行分离；差异进行分离；凝胶过滤层析凝胶过滤层析是依据蛋白是依据蛋白分子量和体积差异分子量和体积差异进行分离；进行分离；径向层析径向层析是近年来发展起来集是近年来发展起来集层析分离层析分离和和膜分离膜分离于一体一个于一体一个复合技术，在流量、负荷量等参数方面显示出极大优越性。复合技术，在流量、负荷量等参数方面显示出极大优越性。重组DNA药物医学知识专家讲座第28页各种分离纯化技术联合利用各种分离纯化技术联合利用 在进行重组蛋白纯化时，通常需要综合使用各种技在进行重组蛋白纯化时，通常需要综合使用各种技术，普通来说，在选择分离纯化方法时应遵照以下标术，普通来说，在选择分离纯化方法时应遵照以下标准：准：应选择不一样分离纯化机理方法联合使用应选择不一样分离纯化机理方法联合使用 应首先选择能除去含量最多杂质方法应首先选择能除去含量最多杂质方法 应尽可能选择高效分离方法应尽可能选择高效分离方法 应将最费时、成本最高分离纯化方法安排在最终应将最费时、成本最高分离纯化方法安排在最终阶段阶段重组DNA药物医学知识专家讲座第29页适当分离纯化介质选择适当分离纯化介质选择惯用蛋白质分离纯化介质有惯用蛋白质分离纯化介质有SephadexSephadex和和SepharoseSepharose。理想分离纯化介质应含有以下性。理想分离纯化介质应含有以下性质：质：对目标蛋白含有较高分辨效率对目标蛋白含有较高分辨效率 对目标蛋白不会造成变性对目标蛋白不会造成变性 化学性能和机械性能稳定，重复性好化学性能和机械性能稳定，重复性好 价格低廉价格低廉重组DNA药物医学知识专家讲座第30页分离纯化过程规模化分离纯化过程规模化 蛋白质分离纯化试验室工艺、技术、方法在大规蛋白质分离纯化试验室工艺、技术、方法在大规模产业化过程未必适当，如：模产业化过程未必适当，如：试验室方法在工程上可能难以实现（超声波破试验室方法在工程上可能难以实现（超声波破细胞壁）细胞壁）试验室方法在大规模生产中可能成本过高（超试验室方法在大规模生产中可能成本过高（超速离心）速离心）所以，在很多情况下，试验室技术路线不等于生所以，在很多情况下，试验室技术路线不等于生产工艺。产工艺。重组DNA药物医学知识专家讲座第31页四、质量控制四、质量控制v1 1、原材料质量控制原材料质量控制：2 2、培养过程质量控制培养过程质量控制 3 3、纯化工艺质量控制纯化工艺质量控制 4 4、目标产品质量控制目标产品质量控制 重组DNA药物医学知识专家讲座第32页确保编码确保编码DNADNA序列正确序列正确 要了解以下特征：要了解以下特征：A A、目标基因起源、克隆过程、序列、目标基因起源、克隆过程、序列 B B、表示载体名称、结构、遗传特征及酶切图、表示载体名称、结构、遗传特征及酶切图谱、抗生素标识等谱、抗生素标识等 C C、宿主名称、起源、传代历史、检定结果及、宿主名称、起源、传代历史、检定结果及生物学特征生物学特征 D D、载体引入宿主方式、及载体再宿主中状态、载体引入宿主方式、及载体再宿主中状态 E E、插入基因于表示载体两侧控制区核酸序列、插入基因于表示载体两侧控制区核酸序列 F F、开启和控制克隆基因表示方法及水平、开启和控制克隆基因表示方法及水平重组DNA药物医学知识专家讲座第33页v种子克隆纯而且稳定，在培养工程中工种子克隆纯而且稳定，在培养工程中工程菌不应出现无突变或质粒丢失现象程菌不应出现无突变或质粒丢失现象v种子批系统种子批系统v工作细胞库工作细胞库重组DNA药物医学知识专家讲座第34页v尽可能去除污染病毒、核酸、宿主细胞杂蛋尽可能去除污染病毒、核酸、宿主细胞杂蛋白等杂质，并防止在纯化过程带入有害物质白等杂质，并防止在纯化过程带入有害物质 纯化每一步应测定纯度、计算提纯倍数、收纯化每一步应测定纯度、计算提纯倍数、收率等等率等等重组DNA药物医学知识专家讲座第35页1 1）、产品判别）、产品判别氨基酸组成份析：氨基酸组成份析：肽图分析：肽图分析：NN末端和末端和C C末端氨基酸测序：末端氨基酸测序：蛋白质二硫键分析：蛋白质二硫键分析：重组蛋白相对分子量：重组蛋白相对分子量：等电点测定：等电点测定：2 2）、纯度分析：）、纯度分析：SDS-PAGE,CE,IEF,HPLCSDS-PAGE,CE,IEF,HPLC3 3）、生物活性测定）、生物活性测定4 4）、残余杂质检测）、残余杂质检测 宿主细胞蛋白含量、宿主细胞宿主细胞蛋白含量、宿主细胞DNADNA、残余抗生素等、残余抗生素等5 5）、安全性检测）、安全性检测 无菌试验、热原试验、毒性试验、免疫原性检验无菌试验、热原试验、毒性试验、免疫原性检验重组DNA药物医学知识专家讲座第36页A A 体内生物学活性测定方法体内生物学活性测定方法 生物学模型生物学模型 生长激素生长激素 大鼠大鼠 脑垂体脑垂体B B 体外生物学活性测定方法体外生物学活性测定方法 如：如：MTT MTT法法:MTT formazan(:MTT formazan(蓝紫色蓝紫色)干扰素类蛋白：可用细胞毒抑制试验来测定干干扰素类蛋白：可用细胞毒抑制试验来测定干扰素体外活性。扰素体外活性。琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶重组DNA药物医学知识专家讲座第37页五、主要重组五、主要重组DNADNA药品药品（一）利用重组大肠杆菌生产医用蛋白或多肽（一）利用重组大肠杆菌生产医用蛋白或多肽 代表产品：重组人胰岛素、重组人生长激素、重组人干扰素、代表产品：重组人胰岛素、重组人生长激素、重组人干扰素、重组人白细胞介素、重组人集落刺激因子、重组抗体及其片重组人白细胞介素、重组人集落刺激因子、重组抗体及其片断等。断等。效率高、产量大效率高、产量大 周期短、成本低周期短、成本低 工艺稳定、质量可控工艺稳定、质量可控 缺点是易形成包含体缺点是易形成包含体重组DNA药物医学知识专家讲座第38页1 1）、干扰素（）、干扰素（IFN-IFN-、）1957 1957年年IsaccsIsaccs等发觉病毒干扰现象，即病毒感等发觉病毒干扰现象，即病毒感染细胞能产生一个因子，作用于其它细胞干扰染细胞能产生一个因子，作用于其它细胞干扰病毒复制，因而命名为干扰素。病毒复制，因而命名为干扰素。依据产生干扰素细胞起源、理化性质和生物活依据产生干扰素细胞起源、理化性质和生物活性等差异，可分为性等差异，可分为、等等3 3种，其中种，其中IFN-IFN-为多基因产物，有为多基因产物，有2323种以上亚型。种以上亚型。重组DNA药物医学知识专家讲座第39页 19861986年，年，FDAFDA同意同意RochRoch企业重组企业重组IFN-IFN-2a2a和和ScheringSchering企业重组企业重组IFN-2bIFN-2b，重组，重组IFN-IFN-、分别在分别在19901990年和年和19931993年上市。年上市。我国中国预防医学科学院病毒学研究所侯我国中国预防医学科学院病毒学研究所侯云德等发觉中国人受病毒攻击产生干扰素云德等发觉中国人受病毒攻击产生干扰素主要为主要为IFN-1bIFN-1b型，型，19921992年我国第一个基年我国第一个基因工程药品因工程药品IFN-1bIFN-1b取得国家一类新药证取得国家一类新药证书。书。重组DNA药物医学知识专家讲座第40页2 2）胰岛素）胰岛素(Insulin,Ins)(Insulin,Ins)19211921年，年，Banting FGBanting FG等从胰脏中分离等从胰脏中分离19551955年，年，Sanger FSanger F测序测序19651965年，我国完成结晶牛胰岛素全合成年，我国完成结晶牛胰岛素全合成19791979年，年，Rutter WRutter W等克隆了胰岛素基因等克隆了胰岛素基因19821982年，第一个重组人胰岛素同意上市年，第一个重组人胰岛素同意上市重组DNA药物医学知识专家讲座第41页v胰岛素结构及生物合成胰岛素结构及生物合成v胰岛素原与胰岛素胰岛素原与胰岛素v人胰岛素生产方法人胰岛素生产方法 v产人胰岛素大肠杆菌工程菌构建策略产人胰岛素大肠杆菌工程菌构建策略 重组DNA药物医学知识专家讲座第42页重组DNA药物医学知识专家讲座第43页v(a)AB链分别表示法链分别表示法 体外折叠成功率低，通常只有1020v(b)人胰岛素原表示法人胰岛素原表示法 因为C肽存在，胰岛素原在复性条件下能形整天然空间构象，为三对二硫键正确配对提供了良好条件，使得体外折叠率高达80以上 当前Ely Lily用这种工艺路线年产几十吨重组人胰岛素，其经济效益相当可观。v(c)AB链同时表示法链同时表示法重组DNA药物医学知识专家讲座第44页重组DNA药物医学知识专家讲座第45页重组DNA药物医学知识专家讲座第46页3 3）生长激素）生长激素19441944年，李卓浩等从牛垂体中分离出牛生长激素年，李卓浩等从牛垂体中分离出牛生长激素19561956年，从人垂体中分离出年，从人垂体中分离出hGHhGH19691969年，年，hGHhGH序列报道序列报道 临床上用于垂体性侏儒症。临床上用于垂体性侏儒症。1956198519561985年，只年，只能从人尸体垂体中分离纯化。但至能从人尸体垂体中分离纯化。但至19851985年，共年，共发觉发觉5050多例克多例克-雅氏症，雅氏症，5 5人病亡，研究结果证人病亡，研究结果证实由垂体起源生长激素污染有朊病毒。实由垂体起源生长激素污染有朊病毒。19851985年，垂体起源被禁用，同年，年，垂体起源被禁用，同年，rhGHrhGH上市。上市。重组DNA药物医学知识专家讲座第47页v1985年，美国年，美国FDA同意由大肠杆菌发酵生产同意由大肠杆菌发酵生产重组人生长激素上市，随即各种路径生产重重组人生长激素上市，随即各种路径生产重组人生长激素快速充满市场。组人生长激素快速充满市场。1997年，仅美年，仅美国国Genentech和和Ely Lily两家企业重组人生长两家企业重组人生长激素年产量已达激素年产量已达20kg，年销售额超出，年销售额超出3.5亿美亿美元。元。v人生长激素结构与性质人生长激素结构与性质v重组人生长激素工程菌构建重组人生长激素工程菌构建重组DNA药物医学知识专家讲座第48页重组DNA药物医学知识专家讲座第49页（二）利用重组酵母生产医用蛋白（二）利用重组酵母生产医用蛋白优势：优势：v1.1.最简单真核生物，基因表示调控机理较清楚，最简单真核生物，基因表示调控机理较清楚，而且遗传操作相对较为简单；而且遗传操作相对较为简单；v2.2.含有原核无法比拟真核生物蛋白翻译后修饰加含有原核无法比拟真核生物蛋白翻译后修饰加工系统工系统v3.3.不含有特异性病毒，不产生毒素，有些酵母菌不含有特异性病毒，不产生毒素，有些酵母菌在食品工业当中有着几百年应用历史，属于安全在食品工业当中有着几百年应用历史，属于安全型基因工程受体系统；型基因工程受体系统；v4.4.大规模发酵工艺简单，成本低廉大规模发酵工艺简单，成本低廉v5.5.能将外源基因表示产物分泌至培养基中能将外源基因表示产物分泌至培养基中劣势：即使拥有完整蛋白质糖基化修饰系统，但其修劣势：即使拥有完整蛋白质糖基化修饰系统，但其修饰方式不用于高等真核生物。饰方式不用于高等真核生物。v举例：重组乙肝疫苗举例：重组乙肝疫苗 重组人血清白蛋白重组人血清白蛋白重组DNA药物医学知识专家讲座第50页重组HAS制备v人血清白蛋白人血清白蛋白HASHAS是血浆中主要成份是血浆中主要成份 载体蛋白。成熟载体蛋白。成熟人血清白蛋白为一非糖基化单一多肽链，由人血清白蛋白为一非糖基化单一多肽链，由585585个氨个氨基酸组成，含有基酸组成，含有1717对二硫键，由此维系空间构象是血对二硫键，由此维系空间构象是血清白蛋白生物功效所必需。清白蛋白生物功效所必需。v巴斯德毕赤酵母是迄今为止最为优良重组人血清白蛋巴斯德毕赤酵母是迄今为止最为优良重组人血清白蛋白表示分泌系统。产率可高达白表示分泌系统。产率可高达15g/L15g/L 重组DNA药物医学知识专家讲座第51页（三）利用转基因动物或细胞生产生物大分子（三）利用转基因动物或细胞生产生物大分子v1.利用动物乳腺组织生产蛋白药品利用动物乳腺组织生产蛋白药品v 酪蛋白酪蛋白、tPA、IL2v2.利用哺乳动物细胞大规模培养技术生产复利用哺乳动物细胞大规模培养技术生产复杂人体蛋白杂人体蛋白v比如比如 EPO重组DNA药物医学知识专家讲座第52页促红细胞生成素（促红细胞生成素（EPOEPO）由肾脏分泌一个唾液酸蛋白，它能促进红细由肾脏分泌一个唾液酸蛋白，它能促进红细胞系增值、分化和成熟胞系增值、分化和成熟.由由166166个氨基酸残基组成高度糖基化蛋白，其个氨基酸残基组成高度糖基化蛋白，其糖基对其生物活性至关主要糖基对其生物活性至关主要 当前用哺乳动物细胞表示系统如当前用哺乳动物细胞表示系统如CHOCHO细胞生产。细胞生产。临床为治疗肾衰造成贫血首选药品，全世界销临床为治疗肾衰造成贫血首选药品，全世界销售额超出售额超出1010亿美元。亿美元。重组DNA药物医学知识专家讲座第53页v19571957年年JacobsonJacobson等证实，肾脏是血清等证实，肾脏是血清EPOEPO主主要起源，含量极微小，无法分离纯化取得纯要起源，含量极微小，无法分离纯化取得纯品。直到品。直到19851985年，年，JacobsJacobs等才先后成功克隆等才先后成功克隆出人、猴、小鼠出人、猴、小鼠EPOEPO基因，随即重组人基因，随即重组人EPOEPO在在CHOCHO细胞中取得表示，并经过层析纯化技细胞中取得表示，并经过层析纯化技术制备出术制备出rHuEPOrHuEPO纯品，于纯品，于19891989年取得美国年取得美国FDAFDA同意后首次投放市场。同意后首次投放市场。重组DNA药物医学知识专家讲座第54页EPO制备工艺 v依据已知天然依据已知天然EPO氨基酸序列，合成对应寡聚核苷酸探针，氨基酸序列，合成对应寡聚核苷酸探针，筛选出人筛选出人EPO基因，引入真核生物质粒表示载体基因，引入真核生物质粒表示载体PD11,用磷用磷酸钙微量沉淀法转染酸钙微量沉淀法转染CHO细胞，克隆培养后，检测培养上细胞，克隆培养后，检测培养上清中清中EPO生物学活性，筛选出高效表示生物学活性，筛选出高效表示EPO细胞株，按照细胞株，按照中国生物制品规程要求建立种子库，检定合格后用于生中国生物制品规程要求建立种子库，检定合格后用于生产。产。v CHO工程细胞在条件培养基中培养时，表示工程细胞在条件培养基中培养时，表示EPO分泌到分泌到培养上清中，上清液中除了培养上清中，上清液中除了EPO外，还含有培养基成份和其外，还含有培养基成份和其它杂蛋白，利用它杂蛋白，利用EPO 本身物理化学性质，将培养上清液加本身物理化学性质，将培养上清液加热至热至80，或用，或用6mol/L盐酸胍、盐酸胍、8mol/L尿素沉淀，能够除尿素沉淀，能够除去大多数杂蛋白。上清液超滤浓缩后，经过一系列凝胶过滤去大多数杂蛋白。上清液超滤浓缩后，经过一系列凝胶过滤层析，如层析，如Sephadex G25，Sephacryl S200及及Biogel P 等多步凝胶过滤，其等多步凝胶过滤，其EPO纯度可到达纯度可到达90以上。深入以上。深入纯化可用纯化可用Sepharose 4B偶联偶联EPO单克隆抗体或多克隆抗体单克隆抗体或多克隆抗体亲和层析或经高压液相层析，其亲和层析或经高压液相层析，其EPO纯度可达纯度可达99以上以上。重组DNA药物医学知识专家讲座第55页依据氨基酸序列依据氨基酸序列合成寡聚核苷酸合成寡聚核苷酸筛选出筛选出EPO基因基因与真核载体连接转化与真核载体连接转化重组质粒重组质粒转染转染CHO筛选筛选高表示高表示CHO工程细胞工程细胞建立种子库建立种子库CHO工程细胞工程细胞培养培养培养液培养液去杂蛋白去杂蛋白初提取液初提取液80 盐酸胍盐酸胍凝胶层析凝胶层析EPO 纯度纯度达达90HPLC 或亲合层析或亲合层析EPO纯度达纯度达99重组DNA药物医学知识专家讲座第56页