SOX4在下咽癌中的表达及其对癌细胞恶性生物学行为的影响.pdf

交通医学 2023 年第 37 卷第 3 期 Med J of Communications,2023,Vol.37,No.3咱文章编号暂1006-2440渊2023冤03-0226-09咱引文格式暂张晓波，刘慧婷，刘元茹，等.SOX4 在下咽癌中的表达及其对癌细胞恶性生物学行为的影响 J.交通医学，2023，37（3）：226-234.*基金项目 江苏省南通市民生科技创新与示范促进基金（MS22021046）；临床肿瘤健康研究基金会（Y-XD2019-213）；苏州市“科教兴卫”青年科技项目（KJXW2021076）；昆山市第一人民医院 2022 年度广仁基金科研课题（KRY-YN2022013）。*作者简介 张晓波，男，汉族，江苏张家港人，生于 1989 年 9 月，硕士。研究方向：耳鼻咽喉头颈外科。通信作者：盛菊萍，E-mail：；张振新，E-mail:SOX4 在下咽癌中的表达及其对癌细胞恶性生物学行为的影响*张晓波1袁2*袁刘慧婷3袁刘元茹1袁左凡4袁王志霞1袁任倩倩1袁姚瑶1袁陈艳5袁高骞6袁盛菊萍1袁张振新1渊南通大学附属医院1耳鼻咽喉头颈外科曰4口腔科袁江苏 226001曰2江阴市人民医院耳鼻咽喉头颈外科曰3江苏大学附属昆山医院耳鼻咽喉头颈外科曰5湘雅常德医院耳鼻咽喉头颈外科曰6昆山市中医医院耳鼻咽喉头颈外科冤摘要目的院分析下咽鳞状细胞癌（hypopharyngeal squamous cell carcinomas，HSCC）组织中 SRY 相关 HMG-box 转录因子 4（SRY-box transcription factor-4，SOX4）的表达及其与患者临床病理特征及预后的关系。观察 siRNAs敲低 FaDu 人咽鳞癌细胞中 SOX4 表达对细胞增殖、迁移及裸鼠成瘤的影响。方法院（1）选取下咽癌石蜡切片标本 76例，癌旁正常组织标本 18 例作为对照，采用免疫组化检测 SOX4 和 Ki67 的表达水平。（2）选取 6 对新鲜的下咽癌组织和相邻正常组织，采用蛋白免疫印迹法（Western blot）检测 SOX4 表达水平。（3）运用 siRNAs 敲低 FaDu 细胞中SOX4 表达。（4）饥饿释放实验检测 SOX4 在增殖期 FaDu 细胞中的表达水平，CCK-8 法检测 FaDu 细胞增殖活性，流式细胞术检测细胞周期的分布，Transwell 试验和划痕实验检测细胞迁移能力。（5）Western blot 检测上皮间充质转化（epithelial mesendyinal transition，EMT）相关分子的表达。（6）裸鼠成瘤实验观察 SOX4 对肿瘤生长的影响。结果院（1）与癌旁正常组织相比，HSCC 组织中 SOX4 表达明显升高，与肿瘤分化程度、肿瘤大小、临床分期、淋巴结转移及 Ki67 表达相关（P约0.05）。（2）SOX4 高表达患者生存期较短。（3）增殖期 FaDu 细胞 SOX4 和 PCNA 的表达同步明显增加。（4）SOX4-Si2 处理后 FaDu 细胞中 SOX4 染色强度显著降低，细胞增殖能力明显下降，细胞停滞于 G1 期，S 期细胞减少。（5）SOX4-Si2 干扰后 FaDu 细胞划痕愈合能力明显下降，细胞迁移数减少，上皮表型标志物 茁-连环蛋白和 E-钙粘蛋白表达显著增加，而间质表型标志物波形蛋白和 N-钙粘蛋白表达显著降低。（6）裸鼠成瘤实验显示，SOX4-Si2 干扰后裸鼠肿瘤生长受到显著抑制，Ki-67 阳性率增高。结论院SOX4 在 HSCC 中过表达，SOX4 在体内外对下咽癌的进展和迁移起着重要作用，可作为下咽癌患者诊断和治疗的分子靶标。关键词下咽鳞状细胞癌；FaDu 细胞；SOX4；上皮间充质转化；动物模型中图分类号R739.63文献标志码ADOI10.19767/ki.32-1412.2023.03.002The expression of SOX4 in hypopharyngeal carcinomaand its effect on biological behavior of cancer cellsZHANG Xiaobo1袁2,LIU Huiting3,LIU Yuanru1,ZUO Fan4,WANG Zhixia1,REN Qianqian1,YAO Yao1,CHEN Yan5,GAO Qian6,SHENG Juping1,ZHANG Zhenxin1(1Departments of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery,4Department of Stomatology,Affiliated Hospital of NantongUniversity,Jiangsu 226001;2Departments of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery,Jiangyin People爷s Hospital;3Departments of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery,Affiliated Kunshan Hospital of Jiangsu University;5Departments of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery,Xiangya Changde Hospital;6Departments ofOtorhinolaryngology Head and Neck Surgery,Traditional Chinese Medicine Hospital of Kunshan)AbstractObjective:To investigate the expression of SOX4 in hypopharyngeal squamous cell carcinoma(HSCC)226窑窑交通医学 2023 年第 37 卷第 3 期 Med J of Communications,2023,Vol.37,No.3tissues and the relationship between SOX4 expression level and clinicopathological features and prognosis.In vivo experi鄄ments,using siRNAs to knockdown the expression of SOX4 in FaDu human hypopharyngeal squamous cells,to explore theeffect on cell proliferation,migration and tumor formation in nude mice.Methods:(1)Using immunohistochemistry to detectSOX4 and Ki-67 expression in 76 cases of paraffin-embedded HSCC and 18 cases of para-cancerous tissue samples.(2)Using western blot to examine SOX4 expression in 6 fresh pairs of HSCC cancer tissues and adjacent normal tissues.(3)SOX4-siRNAs were used to knockdown the expression of SOX4 in HSCC cell line FaDu.(4)Serum-starving experimentwas used to determine expression level of SOX4 in proliferating FaDu cells.Cell viability,cell cycle and cell migrationwere assessed by CCK-8,flow cytometry,and wound-healing and transwell assays.(5)Using western blot to detect the ex鄄pression of epithelial mesenchymal transition(EMT)related molecules.(6)Nude mice subcutaneous xenografts experimentwas performed to investigate the effect of SOX4 on tumor growth.Results:(1)Compared with para-cancerous tissues,SOX4expression significantly increased in HSCC specimens and its expression level was associated with differentiation,tumorsize,clinical stage,lymph node metastasis and Ki-67 expression(P约0.05).(2)The survival time of patients with high SOX4expression was shorter.(3)The expression of SOX4 and PCNA in FaDu cells increased significantly during proliferatingphase.(4)After SOX4-Si2 treatment,the SOX4 staining intensity in FaDu cells decreased significantly,the cell proliferationability decreased,the cells stagnated in G1 phase,and the cells in S phase decreased.(5)After SOX2-Si2 interference,thescratch healing ability of FaDu cells significantly decreased,the cell migration number decreased,and the expression of 茁-catenin and E-cadherin which were epithelial phenotype markers increased,while the expression of vimentin and N-cad鄄herin which were interstitial phenotype markers significantly decreased.(6)The tumor formation experiment of nude miceshowed that the tumor growth of nude mice was significantly inhibited after SOX4-Si2 interference,and the positive rate ofKi-67 increased.Conclusion:SOX4 is overexpressed in HSCC and plays an important role in the progression and migra鄄tion of HSCC in vitro and vivo.It can be used as a molecular target for diagnosis and treatment of HSCC.Key wordshypopharyngeal squamous cell carcinoma;FaDu cell;SRY-box transcription factor-4;epithelial mes鄄enchymal transition;animal model下咽鳞状细胞癌（hypopharyngeal squamous cellcarcinomas，HSCC）占所有头颈部鳞状细胞癌 3豫耀5豫，近年来其发病率呈逐年上升趋势1。超过 75豫HSCC 患者诊断时疾病已处于晚期，局部和远处转移率较高，预后较差，5 年总体生存率为 15豫耀45豫2-4。早期诊断和治疗对降低 HSCC 死亡率非常关键。深入研究 HSCC 发生发展机制，寻找用于早期检测和开发新治疗方案的标志物具有重要意义。转录因子家族成员 SOX4 编码由 474 个氨基酸组成的分子量为 47 kD 的蛋白质，SOX4 包含四个主要部分：HMG盒（DNA 结合结构域）和 TAD（反式激活结构域），在中心部位还有一个富含甘氨酸的区域和一个富含丝氨酸的区域5-6。已证实 SOX4 在胚胎发育、细胞命运决定和分化中发挥重要作用。SOX4 参与抑制肿瘤细胞凋亡，诱导细胞迁移和转移以及癌症干细胞的产生和维持7-8。本研究选取南通大学附属医院病理科2009 年 1 月2022 年 10 月 76 例 HSCC 组织和 18例癌旁正常组织石蜡标本，6 对新鲜 HSCC 组织及其相邻正常组织以及 FaDu 人咽鳞癌细胞株，旨在探索 SOX4 在 HSCC 中的表达及其对癌细胞恶性生物学行为的影响。1材料与方法1.1对象与材料（1）组织标本：76 例 HSCC 组织石蜡标本，患者术前未作放化疗，均经病理确诊，以同期 18 例癌旁正常组织石蜡标本作为对照。同时收集手术切除的 6 对新鲜 HSCC 组织及其相邻正常组织，存储于-80 益低温冰箱保存。本研究经南通大学附属医院医学伦理委员会批准，并获得患者或其家属知情同意。（2）FaDu 人咽鳞癌细胞株：购自中国科学院上海细胞库，采用含 10%胎牛血清的 DMEM 高糖培养基，于 37 益，5%CO2培养箱中培养。（3）6 周龄雄性 BALB/C 无胸腺裸鼠由南通大学动物实验中心提供和饲养。1.2实验方法1.2.1免疫组化（immunohistochemistry，IHC）检测HSCC 组织中 SOX4 表达：组织石蜡切片常规烤片、二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化。置于枸橼酸缓冲液（pH227窑窑交通医学 2023 年第 37 卷第 3 期 Med J of Communications,2023,Vol.37,No.36.0）中煮沸 15耀20 min，冷却至室温，PBS 冲洗 3 次。切片置于 3%H2O2，37 益 15 min，阻断内源性过氧化物酶。以羊血清工作液封闭，37 益 40 min。滴加一抗，4 益冰箱过夜。滴加生物素标记二抗，37 益孵育30 min。滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37 益孵育 30 min。DAB 染色，自来水冲洗后苏木素复染，常规脱水、透明、干燥，中性树脂封片。评分标准：400 倍显微镜观察细胞染色情况。染色细胞百分比为 A 类评分，0耀4豫计 0 分，5豫耀25豫计 1分，26豫耀50豫计 2 分，51豫耀75豫计 3 分，76豫耀100豫计 4 分。染色强度为 B 类评分，阴性计 0 分，弱阳性计 1 分，中等阳性计 2 分，强阳性计 3 分。A伊B 为IHC 最终得分，0耀5 分为低表达或不表达，6耀12 分为高表达。1.2.2Western blot 印迹法：采用 Western blot 检测SOX4、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclearantigen，PCNA）、茁-连环蛋白（茁-catenin）、E-钙粘蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（vimentin）、N-钙粘蛋白（N-cadherin）表达量。称取适量 HSCC 组织或癌旁组织，碾碎，加入 RIPA 裂解液，置于冰上 20 min。将裂解产物移至 EP 管中，4 益下离心取上清液。加入loading buffer，沸水煮 15 min 后置于-80 益冰箱备用。FaDu 细胞蛋白提取方法同组织蛋白提取。根据目的蛋白分子量选定分离胶浓度为 10%，制备 SDS-PAGE 凝胶，在电泳液中进行电泳。组装转膜夹层，在预冷的转膜液中转膜。转膜结束后将 PVDF 膜移至含 5%脱脂奶粉的 TBST 缓冲液中，室温下摇床均匀封闭 2 h。用含 5%脱脂奶粉的 TBS 缓冲液稀释一抗，4 益孵育过夜。取出湿盒室温复温 40 min，TBST洗膜 3 次。TBS 稀释二抗，室温下孵育 1 h。TBST 洗膜 3 遍。膜在暗房加入 ECL 试剂，胶片曝光、显影，定影后扫膜备用。利用 Image J 软件计算条带的灰度值。1.2.3细胞转染：（1）取生长良好的 FaDu 细胞种植于 6 孔板培养，待细胞密度达 50%左右时进行转染。分为转染组、空转组及对照组，转染组根据 SOX4 敲低位点不同分为 Si1、Si2、Si3、Si4 四组。（2）配置转染试剂：2 支 EP 管中分别加入 A 液（10 滋L siRNA+240 滋L 基础培养基）、B 液（5 滋L Lipofectamine2 000+245 滋L 基础培养基），混合后静置 5 min。将 B液加入 A 液中充分混合，静置 20 min。6 孔板中加入新鲜无血清基础培养基 1 500 滋L，再加入 AB 混合液。（3）4耀6 h 后换上含 10%胎牛血清的完全培养基。（4）48 h 后提取细胞 RNA，72 h 后提取细胞蛋白，利用 RT-qPCR 及 Western blot 印迹法检测转染效率。1.2.4血清饥饿释放实验：取生长良好的 FaDu 细胞于无血清 DMEM 高糖培养基培养 72 h 后，换成含 10%胎牛血清的 DMEM 高糖培养基，分别培养0 h、6 h、12 h、24 h、36 h。收集各组细胞，采用流式细胞术和 Western blot 印迹法检测细胞周期、SOX4蛋白和 PCNA 蛋白表达水平。1.2.5RT-qPCR 技术检测 SOX4 mRNA 表达：（1）提取总 RNA：FaDu 细胞转染 48 h 后，以无菌 PBS清洗 2 次，每孔加入 1 mL Trizol 充分裂解，将裂解产物移至去 RNA 酶 EP 管中，加入 0.2 mL 氯仿震荡15 s。4 益下 12 000 r/min 离心 15 min，吸取无色上层液至另一支去 RNA 酶 EP 管，加入 0.5 mL 异丙醇，混匀，静置 10 min，4 益 12 000 r/min 离心 10 min，弃上清。每管加入 1 mL DEPC 水配置的 75%乙醇，4 益下 7 500 r/min 离心 5 min，弃上清。室温中晾干，每管加入 20 滋L DEPC 水溶解，测定样品 RNA 浓度。（2）逆转录合成 cDNA：去 RNA 酶 EP 管中分别加入Oligo（dT）1 滋L，RNA（0.1耀5 滋g）加 DEPC 水 11 滋L，70 益 5 min，立即冰上冷却。加入核糖核酸酶抑制剂1 滋L，dNTPmix（10 mmol/L）2 滋L，5伊Reactin Buffer4 滋L，混匀，再加入 1 滋L 逆转录酶。42 益 60 min，70 益 10 min 终止反应，即刻置于-20益 保存。（3）实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）：引物序列为 SOX4 F：5-CACTCCTCCTCTTCCTCCTC-3，R：5-GCCGA-CGACGAACTGAAG-3；GAPDH F：5-CAGACTATCAAGGAGGAAG-3，R：5-CCAGGAGTGAGATG-ATTC-3。反应体系：cDNA（1颐20）2 滋L，上、下游引物 2 滋L，SYBR Green PCR Master：Mix 10 滋L、H2O6 滋L，总体系 20 滋L。反应条件：95 益 15 s，60 益 30 s，72 益 30 s，循环 40 次。每组设 3 个复孔。1.2.6流式细胞术分析细胞周期分布：收集生长良好的 FaDu 细胞，4 益 PBS 清洗 3 遍，胰酶消化后制成细胞悬液。4 益下 1 200 r/min 离心 5 min，弃 PBS，重复 2 次。加入预冷 70%乙醇 1 mL 固定细胞 24 h。取出细胞 1 200 r/min 离心 5 min，弃去乙醇，预冷PBS 洗涤 3 次，每管加入 1%Triton X-100 200 滋L10 min。再加入 RNaseA（100 滋L/mL）100 滋L，4 益避光反应 20 min。每管加入 200 滋L PI 染色试剂228窑窑交通医学 2023 年第 37 卷第 3 期 Med J of Communications,2023,Vol.37,No.3（0.5 mg/mL），冰上染色 20 min。流式细胞仪（激发波长488 nm）分析细胞周期分布。1.2.7CCK8 法检测细胞增殖能力：将 FaDu 细胞种入 96 孔板，每孔约 8 000 个细胞。细胞转染后 0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、72 h 吸净孔中培养基，每孔加入 10 滋L CCK8 试剂+90 滋L 基础培养基混合液，孵育 90 min，酶标仪检测 490 nm 处 OD 值。1.2.8划痕实验检测细胞迁移能力：将 FaDu 细胞种入 6 孔板中，待细胞融合 80%左右进行细胞转染，分为转染组、空转组和对照组。用 10 滋L 枪头对每孔划“井”字，以无菌 PBS 洗去划落细胞，每孔加入无血清 DMEM 高糖培养基培养。分别于转染后 0 h、36 h 在显微镜下拍照。1.2.9Transwell 实验检测细胞迁移能力：将 FaDu细胞种入 6 孔板中进行细胞转染，分为转染组、空转组和对照组。取 24 孔板，每孔加入 500 滋L 含 10%胎牛血清的完全培养基，将小室置入孔中。用胰酶消化转染 48 h 的细胞，制成单细胞悬液，将 5伊104个细胞/200 滋L 加入上室中。36 h 后 PBS 洗涤细胞 2 次，棉签擦洗干净上室。外室中每孔加入多聚甲醛固定30 min。小室晾干后置入结晶紫染色 20 min，自来水冲洗干净，晾干。显微镜下观察、拍照，随机选取 5 个视野统计细胞个数。1.2.10裸鼠成瘤实验：裸鼠分为 NC 组和干扰组，每组 5 只。干扰组裸鼠肩部皮下注射 2伊106个SOX4-Si2 处理的 FaDu 细胞，NC 组注射相同数量的转染空载质粒的 Fadu 细胞。每 3 天用游标卡尺测量肿瘤体积，体积=0.5伊长度伊宽度2。注射后 3 周处死小鼠，甲醛固定肿瘤组织进行病理学分析。实验重复3 次。本实验经南通大学动物实验伦理委员会批准。1.3统计学处理应用 SPSS 20.0 统计学软件进行数据分析。计数资料以频数表示，组间比较采用 字2检验；计量资料以x 軃 依s 表示，两组间比较采用独立样本 t 检验，多组间比较采用方差分析。SOX4 与 Ki67表达的相关性采用皮尔森相关性分析，绘制 Kaplan-Meier 生存曲线，采用 log-rank 分析 SOX4 表达与患者预后的关系。P约0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1SOX4 蛋白在 HSCC 组织中过度表达石蜡标本免疫组化显示，SOX4 蛋白表达定位于细胞质和细胞核中，在 HSCC 组织中高表达（IHC 评分 6.50依2.93分），在癌旁正常组织中弱表达（IHC 评分 2.00依1.61分），差异有统计学意义（P0.001）（图 1A、B）。Western blot 检测 6 对新鲜 HSCC 组织及其癌旁正常组织，结果显示 HSCC 组织中 SOX4 表达水平明显高于癌旁正常组织，差异有统计学意义（P约0.05）（图 1C、D）。2.2SOX4 表达与下咽癌患者临床病理特征及预后的关系如表 1 和图 2 所示，低分化型 HSCC SOX4表达高于高分化型（P=0.002，图 2A、B），III耀IV 期患者 SOX4 表达高于 I耀II 期患者（P0.001，图 2C），淋巴结转移患者 SOX4 表达高于无淋巴结转移患者（P0.001，图 2D），肿瘤直径跃2 cm 患者 SOX4 表达高于臆2 cm 患者（P=0.006，图 2E），差异均有统计学意义；而不同年龄（P=0.872）和性别（P=0.222）间*P0.05图 1SOX4 在 HSCC 组织及癌旁组织中的表达ACBD229窑窑交通医学 2023 年第 37 卷第 3 期 Med J of Communications,2023,Vol.37,No.3图 2SOX4 在 HSCC 组织中的表达及其临床意义SOX4 表达水平的差异均无统计学意义（P跃0.05）。Ki-67 是细胞增殖相关核抗原，是评估肿瘤增殖细胞比例的有效工具。皮尔森相关性分析表明 SOX4表达越高，Ki-67 阳性率越高（R2=0.569，P0.001，图2F、G）。对 HSCC 患者随访至 2022 年 10 月，Kaplan-Meier 生存分析显示，SOX4 高表达（IHC 评分逸6分）患者生存期较短，预后较差（P=0.026，图 2H）。2.3SOX4 在增殖期 FaDu 细胞中的表达将FaDu细胞血清饥饿 72 h 后，将血清加入培养基中培养 6、12、24 和 36 h，流式细胞术检测显示 G1 期细胞从86.33豫降至 46.61豫，S 期细胞从 9.85豫增至 37.43豫（图 3A）。Western blot 检测显示，增殖期 FaDu 细胞SOX4 和 PCNA（细胞增殖标志物）的表达同步明显增加（P约0.05）（图 3B、C）。2.4敲低 SOX4 表达抑制 FaDu 细胞增殖能力利用siRNAs 转染 FaDu 细胞以敲低 SOX4 的表达，PCR和 Western blot 技术检测 FaDu 细胞中 SOX4 mRNA及蛋白表达，证实敲低效果良好，其中以 SOX4-Si2的效果最好（图 4A、B、C）。后续相关实验采用SOX4-Si2 处理的 FaDu 细胞。IHC 染色结果表明，SOX4-Si2 处理后 FaDu 细胞中 SOX4 染色强度显著降低（图 4D）。CCK-8 检测结果显示，与 NC-Si 或对照组相比，SOX4-Si2 敲低后的 FaDu 细胞增殖能力明显下降（图 4E）。流式细胞术分析显示，敲低 SOX4表达后导致 FaDu 停滞于 G1 期，S 期细胞减少（图4F、G）。表 1SOX4 表达与 HSCC 患者临床病理特征的关系临床病理特征nIHC 评分（分）P值年龄（岁）2477.213依2.851临床分期玉耀域254.440依2.219约0.001芋耀郁517.510依2.716淋巴结转移无395.218依2.494约0.001有377.946依2.677Ki-67 表达低314.323依2.329约0.001高458.010依2.305DBCAEFGH230窑窑交通医学 2023 年第 37 卷第 3 期 Med J of Communications,2023,Vol.37,No.3A耀C：SOX4 SiRNA 处理抑制 FaDu 细胞中 SOX4 mRNA 和蛋白表达。D：FaDu 细胞中 SOX4 强染色，SOX4-Si2 转染的 FaDu 细胞中 SOX4 弱染色（200伊）。E：CCK-8 检测显示 SOX4-Si2 转染的 FaDu 细胞增殖能力降低。F、G：流式细胞术显示，敲低 SOX4 后FaDu 细胞阻滞于 G1 期，S 期细胞减少。*P约0.05。图 4敲除 SOX4 表达抑制 FaDu 细胞增殖图 3增殖期 FaDu 细胞中 SOX4 表达*P0.05ABCADBCFEG231窑窑交通医学 2023 年第 37 卷第 3 期 Med J of Communications,2023,Vol.37,No.3A：接种 NC 和 SOX4-Si2 转染的 FaDu 细胞裸鼠皮下肿瘤肉眼观察。B：裸鼠异种移植肿瘤生长曲线。C：肿瘤切片中 SOX4 和 Ki-67 IHC 染色（200伊）。*P约0.001。图 6敲低 SOX4 抑制体内肿瘤增殖A：划痕实验检测各组 FaDu 细胞的迁移能力（200伊）。B：各组细胞相对迁移距离。C：Transwell 实验显示各组细胞迁移。D：通过Transwell 膜迁移的各组细胞数量。E，F：各组细胞中 茁-catenin、E-cadherin、vimentin、N-cadherin 表达水平。*P约0.05。图 5敲除 SOX4 表达抑制 FaDu 细胞迁移2.5敲低 SOX4 表达抑制 FaDu 细胞迁移能力划痕实验显示，SOX4-Si2 干扰后 FaDu 细胞划痕愈合能力较对照组明显下降（P约0.05）（图 5A、B），Tran原swell 实验也显示 SOX4-Si2 干扰后 FaDu 细胞迁移数少于 Control 和 NC-Si 组（P约0.05）（图 5C、D），表明敲低SOX4 后 FaDu 细胞迁移能力明显下降。同时上皮表型标志物 茁-catenin 和 E-cadherin 表达显著增加，而间质表型标志物 vimentin 和 N-cadherin 表达显著降低（图 5E、F），表明 HSCC 中 SOX4 可能通过 诱 导 上 皮 间 充 质 转 化（epithelial mesendyinaltransition，EMT）而促进肿瘤转移。2.6动物模型实验中敲低 SOX4 表达抑制肿瘤生长裸鼠成瘤实验显示，与 NC 组相比，SOX4-Si2干扰后肿瘤生长受到显著抑制（P约0.001）（图 6A、B）。此外，免疫组化染色显示在 SOX4 表达增高的同时，增殖标志物 Ki-67 阳性率也增高（图 6C）。提示敲低HSCC 细胞中的 SOX4 可以抑制体内肿瘤生长。ABCDEFABC232窑窑交通医学 2023 年第 37 卷第 3 期 Med J of Communications,2023,Vol.37,No.33讨论本研究 IHC 和 Western blot 检测显示，HSCC 组织中 SOX4 蛋白表达明显高于癌旁组织，其表达水平与肿瘤细胞分化程度、临床分期、肿瘤大小、淋巴结转移及 Ki-67 表达有关，这与鼻咽癌9、前列腺癌10、口腔鳞状细胞癌11等恶性肿瘤相似。在非小细胞肺癌12、前列腺癌13、胆管癌14、口腔癌11中 SOX4高表达预示患者预后不良，本研究发现 SOX4 高表达患者生存期较短，预后较差，提示 SOX4 可能是预测 HSSC 患者预后的生物学标志物。由于异常增殖是细胞恶性转化的重要环节，我们首先检测增殖期 FaDu 细胞中 SOX4 表达水平，Western blot 检测显示，增殖期 FaDu 细胞中 SOX4和细胞增殖标志物 PCNA 的表达同步明显增加，说明SOX4 过表达与肿瘤生长密切相关。使用 siRNA敲低 FaDu 细胞中 SOX4 的表达，细胞增殖能力显著降低，S 期细胞显著减少，提示 SOX4 可能通过调节细胞周期进程来促进肿瘤细胞增殖。转移是癌症发病中最复杂的分子调控过程15，研究表明 SOX4 高表达与肿瘤复发、远处转移和侵袭性有关16。EMT 的程序化激活使肿瘤细胞获得间充质特征，有利于肿瘤的进展、转移和复发。许多上皮来源的恶性肿瘤过表达 SOX4，并且与 EMT 的发展有关17。SOX4 对肿瘤细胞迁移的影响可能与不同信号通路的激活有关。有报告认为，癌症的进展与TGF-信号通路有关18-19。SOX4 参与 HCC 细胞转移过程中的 EMT，从而促进肿瘤进展20。在人乳腺上皮细胞中 TGF-茁 介导的 SOX4 表达增强对 EMT 期间产生间充质表型是必要的21。SOX4 过度表达有助于乳腺癌细胞的侵袭和扩散，SOX4 过度表达与生成EMT 的 TGF-茁 途径激活有关。本研究发现，沉默SOX4 表达后 FaDu 细胞迁移能力受到抑制，同时上皮标志物表达增加，间质标志物表达降低，提示SOX4 可能通过协同 EMT 促进 HSCC 转移。综上所述，SOX4 在 HSCC 中过表达，SOX4 促进HSCC 细胞的迁移和增殖，可能是早期识别 HSCC、判断患者预后的生物标志物和治疗靶点。参考文献1 COOPER J S，PORTER K，MALLIN K，et al.National Can原cer Database report on cancer of the head and neck:10-yearupdate J.Head Neck，2009，31（6）：748-758.2 TAKES R P，STROJAN P，SILVER C E，et al.Current trendsin initial management of hypopharyngeal cancer：the declin原ing use of open surgery J.Head Neck，2012，34（2）：270-281.3 CHEN Y，ZHANG Q，DING C，et 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