参萸补血方对再生障碍性贫血小鼠骨髓增殖及血液学参数的影响.pdf

2023 年 第 26 卷 第 4 期广西中医药大学学报参萸补血方对再生障碍性贫血小鼠骨髓增殖及血液学参数的影响陆海颂，雷宇，曾清*，程纬民，何艾（广西中医药大学第一附属医院，广西南宁530023）摘要：目的观察参萸补血方对再生障碍性贫血（AA）小鼠骨髓细胞学的影响，探讨其治疗AA的确切疗效。方法将80只小鼠按随机数字表法分为4组：正常对照组、模型组、参萸补血方组、醋酸泼尼松组，每组20只。除正常对照组外，余组小鼠以60 Co-射线照射加腹腔注射环磷酰胺、氯霉素复合方法建立AA模型。造模后参萸补血方组 剂量为16.56 g/（kgd）、醋酸泼尼松组 剂量为9.1 mg/（kgd）给药连续干预4周，每天灌胃量均为10 ml/kg。光镜下观察骨髓增生程度并计算骨髓非造血细胞百分率（包括淋巴细胞、单核细胞、浆细胞等），血细胞分析仪检测各组小鼠外周血中血液学参数情况。结果与正常对照组比较，模型组小鼠外周血中的白细胞（WBC）、血红蛋白（HGB）和血小板（PLT）水平均显著降低，骨髓中非造血细胞的百分率显著升高（P0.05），骨髓增生低下（P0.01）；与模型组比较，参萸补血方组、醋酸泼尼松组小鼠外周血中WBC、HGB、PLT水平均显著升高，骨髓中非造血细胞百分率显著下降（P0.05），骨髓增生活跃（P0.01）。结论 参萸补血方能够修复AA模型小鼠的骨髓造血功能，促进骨髓增殖，改善外周血液学参数，有效治疗AA。关键词：再生障碍性贫血；参萸补血方；骨髓增殖；血液学参数；实验研究中图分类号：R285.5文献标识码：A文章编号：2095-4441（2023）04-0053-05引文格式：陆海颂，雷宇，曾清，等.参萸补血方对再生障碍性贫血小鼠骨髓增殖及血液学参数的影响 J.广西中医药大学学报，2023，26（4）：53-57.Effects of Shenyu Buxue Prescription on Bone Marrow Proliferation andHematological Parameters in Rats with Aplastic AnemiaLU Hai-song，LEI Yu，ZENG Qing*，CHENG Wei-min，HE Ai（The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning，Guangxi，530023）Abstract：ObjectiveTo observe the effect of Shenyu Buxue prescription on the myeloid cytology of rats withaplastic anemia（AA）and to explore its exact efficacy.MethodsEighty rats were divided randomly into four groups according to the random number table method：normal control group，model group，Shenyu Buxue presciption group，andprednisone acetate group，with 20 rats in each group.Except the normal control group，the rats from the other groupswere irradiated with 60 Co-radiation and intraperitoneal injection of cyclophosphamide and chloramphenicol to establish the AA model.After modeling，Shenyu Buxue prescription group with 16.56 g/（kgd）and prednisone acetate groupwith 9.1 mg/（kgd）were administered for 4 weeks，and the daily gavage volume was 10 ml/kg.The degree of bone marrow proliferation was observed under light microscopy and the percentage of non-hematopoietic cells including lympho收稿日期：2023-03-30基金项目：广西自然科学基金项目（编号：2023GXNSFBA026117）；广西中医药管理局资助项目（编号：GZZC2019058）；广西中医药大学青年基金项目（编号：2019QN024）第一作者简介：陆海颂（1985），女，主治医师，讲师，研究方向：血液肿瘤疾病中西医结合治疗*通信作者：曾清（1969），女，副主任医师，副教授，研究方向：中医治疗血液肿瘤疾病；E-mail： 532023，Vol.26 No.4Journal of Guangxi University of Chinese Medicine再生障碍性贫血（aplastic anemia，AA）是一种免疫介导的以不同程度骨髓造血功能障碍、骨髓造血组织脂肪化、外周血全血细胞（白细胞、血红蛋白、网织红细胞及血小板）减少为特征的自身免疫性疾病，临床主要表现为进行性贫血、脏器出血及严重感染等。疾病后期因重度贫血、血小板严重减少和中性粒细胞极度缺乏而出现严重的出血及感染，诱导脏器功能衰竭及死亡1-2。目前AA的诊疗片面强调免疫抑制剂的使用，而忽视了骨髓衰竭的病理因素，治疗方面主要采用造血干细胞移植、免疫抑制等方法，疗效不尽如人意3。中医学认为，AA归属于中医“虚劳（髓劳）”“血虚”等范畴，脾肾亏虚为其关键病机，补肾健脾、益髓生血为AA的治疗原则。参萸补血方由党参、山茱萸肉、牡丹皮、淫羊藿、补骨脂等组成，具有补肾健脾、益髓生血的功效，临床用于AA的治疗，可以明显改善AA患者的骨髓衰竭，升高血红蛋白，并缓解乏力、头晕等症状，使患者尽早脱离输血，临床疗效显著4-6。本研究以参萸补血方干预免疫介导的AA小鼠，通过检测AA小鼠骨髓增殖及外周血中各项血液学参数的变化，探讨参萸补血方对AA小鼠骨髓增殖及血液学参数的影响。1实验材料1.1动物BalB/C 小鼠 80只，雄性，SPF 级，体质量1822 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK（湘）2019-0004。小鼠分笼饲养，每笼5只，饲养动物的室内温度（232），湿度（5010）%。实验动物使用许可证号：SYXK（桂）2019-0001。1.2药品与试剂参萸补血方由党参25 g、山茱萸肉10 g、牡丹皮30 g、淫羊藿30 g、补骨脂25 g组成，所有药材由广西中医药大学第一附属医院药剂科提供。将3剂参萸补血方饮片熬制成水煎剂116 ml，合生药浓度3.12 g/ml，储存于4 冰箱备用。醋酸泼尼松片为天津力生制药股份有限公司产品，国药准字 H12020123；环磷酰胺（cyclophosphamide，CY）为上海华联制药有限公司产品（国药准字 H31000699）；氯霉素（chloramphenicol，CH）为陕西省西安妇幼制药厂产品，批号：912525。1.3仪器Varian Trilogy直线加速器（美国瓦里安医疗系统公司）；血细胞分析仪-BC-6900（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）；高速冷冻离心机（德国Eppendorf 公司）；1510型酶标仪（美国赛默飞世尔科技公司）；Olympus BEION V4.2型显微镜（日本OLYMPUS公司）。2实验方法2.1分组、造模与给药将80只BalB/C小鼠按随机数字表法分为4组：正常对照组、模型组、参萸补血方组、醋酸泼尼松组，每组20只。正常对照组不造模，予普通饲料喂养，自由饮用蒸馏水。其余组采用60 Co-射线照射加腹腔注射环磷酰胺（CY）、氯霉素（CH）的方法建立AA小鼠模型7：第一天予BalB/C小鼠一次全身3Gy 60 Co-射线均匀照射，能量8 MeV，单次剂量300C Gy，源皮距100 cm，照射时间1 min。照射后第 4 d、第 5 d、第 6 d 各腹腔注射（ip）CY 50 mg/kg、CH 62.5 mg/kg 1次，造模期间自由饮水。第14 d，各组分别处死 5 只小鼠以验证 AA 小鼠模型造模是否成功。以小鼠外周血三系细胞（白细胞、红细胞、血小板）减少，网织红细胞减少，骨髓增生低下，非造血细胞（脂肪细胞）增多，有核细胞计数极度减低为造模成功标准。造模成功后，各给药组根据 药理实验方法学 中小鼠与人的体表面积比值表折算成小鼠等效灌胃剂量8，参萸补血方组灌胃给予参萸补血方药液，剂量为16.56 g/（kgd），灌胃量为10 ml/kg；醋酸泼尼松cytes，monocytes，plasma cells，etc.of bone marrow was calculated，and the hematological parameters in the peripheralblood of each group were detected by the hemocytosis.ResultsCompared with the normal control group，the levels ofwhite blood cells（WBC），hemoglobin（HGB）and platelets（PLT）in the peripheral blood in the model group was significantly reduced，the percentage of non-hematopoietic cells in the bone marrow was significantly increased（P0.05），and the bone marrow hyperplasia was low（P0.01）.Compared with the model group，the levels of WBC，HGB and PLTin the peripheral blood in the Shenyu Buxue prescription group and the prednisone acetate group increased significantly，the percentage of non-hematopoietic cells in the bone marrow decreased significantly（P0.05），and bone marrowhyperplasia was active（P0.01）.ConclusionShenyu Buxue prescription can repair the bone marrow hematopoieticfunction，promote bone marrow proliferation，improve peripheral hematological parameters，and effectively treat aplasticanemia.Keywords：aplastic anemia；Shenyu Buxue prescription；bone marrow proliferation；hematological parameters；experimental research 542023 年 第 26 卷 第 4 期广西中医药大学学报3.3骨髓细胞学检测结果3.3.1外观取材涂片观察肉眼观察：正常对照组小鼠骨髓涂片涂膜面厚薄适中，无脂肪珠，可见骨髓小粒；模型组小鼠骨髓涂片涂膜面较薄，可见脂肪珠，无骨髓小粒。参萸补血方组与醋酸泼尼松组的骨髓涂片肉眼观察差别不明显，涂膜面厚薄适中，无脂肪珠，骨髓小粒介于模型组与正常对照组之间。3.3.2骨髓细胞形态学分析镜下观察：正常对照组小鼠骨髓全片可见骨髓小粒，无油滴，骨髓增生活跃，有核细胞密布，各系比例大致正常，成熟红细胞形态正常，巨核细胞多见，血小板多见，成簇分布。模型组小鼠部分骨髓涂片出现油滴，骨髓全面衰竭呈增生障碍，造血细胞减少，非造血细胞增多，成熟红细胞大小一致，无明显淡染区，巨核细胞缺如，血小板减少、散在分布。参萸补血方组与醋酸泼尼松组小鼠骨髓衰竭程度明显减轻，油滴较模型组明显减少，仅见少量脂肪空泡，部分骨髓片可见散在造血灶，偶见巨核细胞，血小板散在。见图1。3.3.3各组小鼠治疗后骨髓增生程度比较与正常对照组比较，模型组的骨髓增生程度均低下（P0.01）；与模型组比较，参萸补血方组与醋酸泼尼松组小鼠骨髓增生程度均有所恢复（P0.01），见表2。3.3.4骨髓非造血细胞百分率变化与正常对照组比较，模型组小鼠的骨髓非造血细胞百分率显著升高（P0.05）；与模型组比较，参萸补血方组和醋酸泼尼松组小鼠的骨髓非造血细胞百分率均显著下降（P0.05），见表3。4讨论AA属于骨髓衰竭性疾病，临床主要表现为骨髓增生减低、全血细胞减少等。AA起病急，病情进展迅速，短期死亡率高，是一种难治的血液系统疾病10。表1各组小鼠外周血液学参数比较（xs）组别正常对照组模型组参萸补血方组醋酸泼尼松组n15151515WBC（109）7.920.804.470.665.611.486.050.43HGB（g/L）165.205.6885.605.60120.076.63136.677.37PLT（109）969.8075.54565.6060.40770.0727.45795.6779.88注：与正常对照组比较，P0.05；与模型组比较，P0.05组灌胃给予醋酸泼尼松片溶液，剂量为9.1 mg/（kgd），灌胃量为10 ml/kg；模型组灌胃给予等量生理盐水，灌胃量为10 ml/kg。每天1次，至第28 d实验结束。2.2观察指标2.2.1动物一般情况在实验过程中，每天观察并记录各组小鼠的饮食、活动、毛色、体重和死亡情况。2.2.2标本处理实验结束，处死各组小鼠。各组小鼠通过摘取眼球、眼眶取血备用，随后颈椎脱臼处死，分离出双侧股骨。剪取右侧股骨中段7 mm处，用空气快速吹打出骨髓液，制成骨髓涂片，瑞氏-吉姆萨染色，送检验科观察骨髓象。2.2.3骨髓细胞学检测瑞氏-吉姆萨染色光镜下评估骨髓增生程度及骨髓非造血细胞（包括淋巴细胞、单核细胞、浆细胞等）百分率变化。瑞氏-吉姆萨染色骨髓增生程度判断标准9：红细胞与有核细胞之比100 1300 1为增生极度减低（-）；红细胞与有核细胞之比35 170 1为增生减低（+）；红细胞与有核细胞之比16 132 1为增生活跃（+）；红细胞与有核细胞之比5 112 1为增生明显活跃（+）；红细胞与有核细胞之比0.5 12.0 1为增生极度活跃（+）。2.2.4外周血液学参数检测外周血送本院检验科，严格按照全自动血液分析仪操作步骤检测常规血液学参数的改变情况，即白细胞（WBC）、血红蛋白（HGB）和血小板（PLT）水平。2.3统计学方法采用SPSS 22.0软件统计分析，符合正态分布的计量资料以均数标准差（xs）表示，采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；计数资料采用秩和检验，检验水准=0.05。3结果3.1一般情况正常对照组小鼠一般情况良好，毛被光泽，行动灵活，食量及大便正常。模型组小鼠形体消瘦，精神不振，行动迟缓，行走不稳，食量明显减少，毛色无光泽易脱落；经治疗后，参萸补血方组和醋酸泼尼松组小鼠活动正常，一般情况较模型组明显好转。3.2各组小鼠外周血液学参数比较与正常对照组比较，模型组小鼠外周血中WBC、HGB和PLT水平均显著减少，差异均有统计学意义（P0.05）。与模型组比较，参萸补血方组与醋酸泼尼松组小鼠外周血中WBC、HGB和PLT水平均显著增加，差异有统计学意义（P0.05），见表1。552023，Vol.26 No.4Journal of Guangxi University of Chinese Medicine图1各组小鼠骨髓增生情况正常对照组（400）模型组（400）参萸补血方组（400）醋酸泼尼松组（400）治疗措施主要为造血干细胞移植、免疫抑制疗法以及对症支持治疗，但是受限于供者缺乏及免疫抑制疗法高复发率等风险，总体疗效不尽如人意11-12。中医认为AA病因多为先天不足，后天失调，饮食劳倦、药物毒邪、久病重病等因素均可伤及脏腑阴阳，尤其是脾肾之脏，肾虚无以主骨藏精生髓，脾虚无以生长生化气血，引起虚损劳伤，最终迁延发展为髓劳。“髓”代表其病位，并且涉及肝肾脾三脏；“劳”代表其病性，主要表现为疲劳等症13。孙伟正教授认为肾虚为AA病机根本，气血两虚为标14。雍彦礼等15发现中医“肾藏精，主骨生髓”理论与免疫和造血功能相吻合，从细胞学角度证实肾虚可直接影响免疫细胞的生成和调节；而补肾健脾中药可以刺激骨髓造血干/祖细胞的增殖和分化，调节免疫功能，改善 AA 造血衰竭16。在治疗上，蒋佩珍等17采用补肾生血法治疗AA患者，发现总有效率达86.4%，可有效减少患者输表2各组小鼠治疗后骨髓增生程度比较（只）组别正常对照组模型组参萸补血方组醋酸泼尼松组n15151515-0821+0722骨髓增生程度+1501112+0000+0000注：多组比较，2=33.040，P0.001；模型组与正常对照组比较，Z=-5.078，P0.01；醋酸泼尼松组与模型组比较，Z=-3.676，P0.01；参萸补血方组与模型组比较，Z=-3.521，P0.01 562023 年 第 26 卷 第 4 期广西中医药大学学报血量甚至脱离输血，体现了从肾论治AA的优势。此外，在西医基础治疗的情况下，联合中药治疗AA患者的效果比单独使用西药更具有优势，朱艳红18使用复方皂矾丸+中药+康力龙治疗难治型AA患者20例取得满意疗效，可纠正AA患者免疫紊乱，恢复骨髓造血功能。参萸补血方为我院治疗骨髓造血衰竭性疾病的经验方，以补肾健脾、益髓生血立法组方，方中山茱萸、补骨脂温补肾阳，填精补髓；党参、淫羊藿滋补脾阳，补充后天之本；佐以牡丹皮凉血止血，清热解毒。诸药合用，具有补肾健脾、益髓生血之功效。现代药理研究表明，党参主要成分人参皂苷对骨髓多能干细胞的增殖具有明显促进作用，山茱萸能够通过促进巨噬细胞吞噬功能发挥调节机体免疫作用19-20。本研究组前期临床研究表明，参萸补血方可通过调节T淋巴细胞亚群，纠正免疫紊乱，修复受损的造血干细胞并促进其分化、增殖，AA患者经过该方治疗后，其外周血象各项指标均有改善，并能够缓解乏力、头晕等症状，脱离输血，提高患者生活质量，临床疗效良好4-6。动物实验研究也显示，参萸补血方能改善AA模型小鼠免疫紊乱，促进骨髓造血功能，提升外周血细胞水平7。本实验研究显示，参萸补血方能提高AA小鼠骨髓造血细胞比例，改善AA小鼠骨髓增生低下和造血细胞减少，促进骨髓造血细胞增殖、分化，提高AA小鼠外周血中HGB、WBC、PLT水平（P0.05或P0.01），表明参萸补血方能够修复 AA 模型小鼠的骨髓造血功能，促进骨髓增殖，改善外周血液学参数，有效治疗AA，但其具体作用机制尚有待更进一步的研究证实。参考文献1YOUNG N S.Aplastic anemiaJ.New England Journal ofMedicine，2018，379（17）：1643-1656.2中华医学会血液学分会红细胞疾病（贫血）学组.再生障碍性贫血诊断与治疗中国专家共识（2017版）J.中华血液学杂志，2017，38（1）：1-5.3SCHEINBERG P.Novel therapeutic choices in immune aplastic anemia J.F1000Res，2020，10（9）：1000-1118.4曾清，程纬民.参萸补血方为主治疗慢性再生障碍性贫血30例 J.广西中医学院学报，2005，8（1）：18-19.5曾清，程纬民，韦常丽，等.参萸补血方对脾肾阳虚型慢性再生障碍性贫血T细胞免疫机制的影响 J.四川中医，2007，25（10）：64-65.6曾清，程纬民，何艾.参萸补血方对脾肾阳虚型慢性再生障碍性贫血患者疗效及其免疫学机制的研究 J.广西中医药，2018，41（1）：3-5，40.7曾清，陆海颂，程纬民，等.参萸补血方对再生障碍性贫血模型小鼠 Th17 细胞及其相关因子IL-6、IL-17及 IL-23表达水平的影响 J.中国医药导报，2018，15（12）：13-16.8魏伟，吴希美，李元建.药理实验方法学 M.4版.北京：人民卫生出版社，2010：165.9白蕊.骨髓检验诊断再生障碍性贫血的临床价值 J.中外医疗，2018，37（3）：180-181，184.10闫宇辰，李振宇.重型再生障碍性贫血的临床诊治进展J.医学研究杂志，2022，51（4）：18-20.11FATTIZZO B，GIANNOTTA J A，BARCELLINI W.Mesenchymal stem cells in aplastic anemia and myelodysplasticsyndromes：the“seed and soil”crosstalk J.Int J Mol Sci，2020，21（15）：5438.12WANG L，LIU H.Pathogenesis of aplastic anemia J.Hematology，2019，24（1）：559-566.13陈信义，陈珮.中医治疗血液病名家学术观点撷菁 J.北京中医药，2021，40（5）：466-469.14于孙婉琪，谷梦宇，史文萱，等.孙伟正教授从肾论治非重型再生障碍性贫血经验撷英 J.中医药信息，2022，39（3）：25-28，54.15雍彦礼，孙凤.补髓生血颗粒对慢性髓劳病IL-21和IL-21mRNA 的影响 J.世界中西医结合杂志，2019，14（10）：1339-1341，1371.16宋兴华，赖毛华，刘华，等.健脾补肾法对骨髓抑制小鼠造血功能的影响 J.中国中医药现代远程教育，2016，14（24）：140-142.17蒋佩珍，丁宇斌，王文儒，等.补肾生血法与益气养血法联合西药治疗再生障碍性贫血的前瞻性随机双盲安慰剂对照的多中心临床研究 J.中医杂志，2022，63（11）：1043-1050.18朱艳红.复方皂矾丸+中药+康力龙治疗20例难治型再障患者疗效观察 J.世界最新医学信息文摘，2019，19（82）：206.19周春根，江滨，倪敏，等.人参皂苷Rg1对间充质干细胞作用的研究进展 J.中华中医药学刊，2021，39（4）：130-132，293.20周迎春，张廉洁，张燕丽.山茱萸化学成分及药理作用研究新进展 J.中医药信息，2020，37（1）：114-120.（编辑陈明伟）表3各组小鼠骨髓非造血细胞百分率比较（%，xs）组别正常对照组模型组参萸补血方组醋酸泼尼松组n15151515非造血细胞百分率17.003.2761.406.6729.835.1523.834.54注：与正常对照组比较，P0.05；与模型组比较，P0.05 57