桉蝙蛾3龄幼虫嗅觉结合蛋白的高表达量与其寄主选择时期的一致性.pdf

环境昆虫学报 ():/邱峙嵩 陈晓 马洪轩 胡平.桉蝙蛾 龄幼虫嗅觉结合蛋白的高表达量与其寄主选择时期的一致性.环境昆虫学报 ():.桉蝙蛾 龄幼虫嗅觉结合蛋白的高表达量与其寄主选择时期的一致性邱峙嵩 陈 晓 马洪轩 胡 平(广西大学林学院 南宁 广西国有高峰林场 南宁)摘要:为分析桉蝙蛾 幼虫嗅觉蛋白中结合蛋白()在不同龄期和体段的表达 揭示桉蝙蛾幼虫结合蛋白的时空表达谱 基于表达谱阐明其与幼虫寄主选择行为的关系 本研究利用 分析桉蝙蛾幼虫结合蛋白在 个龄期和 个体段中的表达 在各龄期幼虫的头部中、和 均在 龄幼虫头部显著地高量表达 同时 的结合蛋白在幼龄幼虫(龄和 龄)的某个体段表达量最高 此外 和 的结合蛋白在桉蝙蛾幼虫腹部和胸部的表达量最高 以上筛选出的 个结合蛋白是桉蝙蛾 龄幼虫在地栖转树栖过程中 参与寄主识别最主要的蛋白 且结合蛋白在 龄幼虫头部的显著高量表达与 龄幼虫转移栖息地和选择寄主相一致 同时结合蛋白在幼龄幼虫中的高量表达可能与选择寄主后幼龄幼虫对寄主挥发物的适应相一致 本研究支持了桉蝙蛾幼龄幼虫寄主选择的推测 与其他昆虫一致 结合蛋白在桉蝙蛾幼虫的腹部和胸部(非嗅觉部位)高量表达 其功能有待解读关键词:桉蝙蛾 幼虫 嗅觉蛋白 时空表达 实时荧光定量 中图分类号:文献标识码:文章编号:()基金项目:广西壮族自治区科技基地和人才专项()国家自然科学基金青年科学基金项目()广西壮族自治区自然科学基金面上项目()作者简介:邱峙嵩 男 年生 硕士研究生 研究方向为森林病虫害防治 :通讯作者 :胡平 女 博士 讲师 主要研究方向为森林病虫害防治 :收稿日期:接受日期:():()().环境昆虫学报 卷 ():()广西桉树 人工林贡献了全国/以上的木材 在我国木材安全和储备林建设上起着非常重要的作用(杨章旗)桉树同时也是亚热带和热带荒山瘠地造林的先锋树种 其健康、可持续发展 对我国具有十分重大的经济、生态价值和战略意义(陈勇平等)桉蝙蛾 是近年来新发现的桉树蛀干害虫在广西分布范围极广 在区内所有市、县区和全部 个自治区直属国有林场均有危害(杨秀好等)桉蝙蛾是本地害虫适应外来寄主的典型案例 仅在广西危害的木本植物就达 科 属 种(杨秀好等)其幼虫主要危害 年桉树幼林 成虫卵散产于地面孵化后 幼虫在朽木或落叶层地栖至 龄 后转移并选择寄主上树危害(杨秀好)即使在桉树混交林中其 龄幼虫也能准确选择并危害桉树(杨秀好)推测桉蝙蛾幼虫在转移过程中能通过其嗅觉系统主动识别桉树嗅觉是昆虫感知外界环境、进行信息交流的关键 嗅觉系统可以引导昆虫进行寄主定位、食物选择、求偶、选择栖息地等行为(莫建初等)昆虫的嗅觉识别过程需要多种嗅觉相关蛋白 参 与 如 气 味 结 合 蛋 白()、化学感受蛋白()、气味 受 体()、离子型受体()及感觉 神 经 元 膜 蛋 白()()其中 除、是昆虫嗅觉蛋白中的膜蛋白外 和 是昆虫嗅觉蛋白中的结合蛋白 其主要功能是在感器淋巴液中结合通过极孔进入的气味分子()并将其转运到昆虫的气味受体 触发嗅觉相关信号转导()主要在昆虫触角中特异性表达(张方梅等)且已证实许多 在化学感器()中表达 但也有研究发现 也可在昆虫其他组织中被检测到(王晓双等)可以通过识别普通气味分子和昆虫信息素与外界环境交流 目前的研究表明大多数昆虫气味结合蛋白均能结合寄主植物挥发物(王 冰 等 )如 白 蜡 窄 吉 丁 体内的 与 种寄主植物挥发物表现出高亲和力()蜜蜂通过 识别挥发性信息素与同类进行交流()还参与昆虫的其他行为及生命活动 如梨小食心虫 体内的 在雄虫翅中存在高表达量 推测与调控雄虫振翅释放信息素的行为有关(陈秀琳等)基 因 最 早 在 沙 漠 蝗 的触角中发现 它与 在序列、结构等方面都存在明显的差异()研究发现 在昆虫体内分布广泛 在触角、腿、翅膀、头部、胸部和腹部等部位中均有表达()是昆虫化学接收系统中气味的载体()其功能多样如识别寄主植物的挥发物()识别外界环境中大量的非挥发性物质(王培丹等)部分 参与性信息素的识别()此 外 还具有调控昆虫生长发育和生理节律等功能(李广伟)昆虫的各种嗅觉蛋白协同合作促使昆虫在复杂的环境中能准确地进行化学识别从而精准进行选择寄主、产卵和交尾等行为基于桉蝙蛾幼虫栖息地转移及在混交林准确选择桉树危害的现象 推测桉蝙蛾 龄幼虫地栖转树栖的过程中结合蛋白高量表达 并在寄主的 期邱峙嵩等:桉蝙蛾 龄幼虫嗅觉结合蛋白的高表达量与其寄主选择时期的一致性嗅觉识别中发挥作用 本研究基于桉蝙蛾幼虫转录组鉴定的结合蛋白()通过实时荧光定量 技术()测定结合蛋白在桉蝙蛾幼虫 个龄期(龄、龄、龄和 龄)和 个体段(头部、胸部和腹部)中的表达情况 揭示结合蛋白的变化规律 同时基于其表达模式 阐明桉蝙蛾结合蛋白在不同龄期幼虫中的表达与其寄主选择行为的关系 材料与方法 供试虫源及样品收集 年 月至 年 月于广西壮族自治区国有高峰林场长客分场()和军山分场()的桉树人工林中采集桉蝙蛾幼虫 后带回广西大学林学院森林保护实验室 参照杨秀好()判断龄期的方法和标准 选取活体 龄、龄、龄和 龄的桉蝙蛾幼虫各 头 将头部直接剪下 用解剖剪沿腹部中线剪开幼虫胸腹部表皮 用镊子去除肠道及脂肪 再用剪刀将胸部和腹部分开 后用 清洗 得到桉蝙蛾幼虫头部、胸部和腹部的样品 个龄期和 个体段的样品均有 个生物学重复 所有的样品置于 离心管后加入 ()直接提取 总 提取和 合成参照提取沙棘木蠹蛾 的方法(胡平)采用 并结合 ()的方法提取桉蝙蛾 幼 虫 不 同 龄 期 和 体 段 的 总 利 用 ()检测总 的质量和浓度 所有样品的/与/在 之间 按照反转试剂盒 ()的步骤合成 将 稀释 倍作为模板备用 实时荧光定量 选取了桉蝙蛾幼虫头体转录组鉴定的嗅觉蛋白中的 个结合蛋白 基于其基因序列 设计实时荧光定量 引物(表)内参基因为甘油醛磷 酸 脱 氢 酶 基 因()在荧光定量表 实时荧光定量 的引物 基因 正向引物 反向引物 环境昆虫学报 卷 仪 ()上进行 反应所用的是 体系:()模板 正 反 引 物(/)各 反应程序:预变性 共 个循环的 到 每增加 保持 以记录溶解曲线 每个样品采用 个生物学重复和 个技术重复 值通过 ()软件获得 表达量采用 的方法计算()以 在 龄幼虫头部的表达量作为数据分析中的对照样品 数据分析每个基因在各个体段、龄期的表达量的显著性分析采用单因素方差分析 ()中的多重比较中的 ()检验 分析软件为 ()结果与分析 在桉蝙蛾幼虫不同龄期、体段的表达 测定了 个 在桉蝙蛾幼虫 体段和 龄期中的表达(图)从最高表达量上看 前三 的 基 因 依 次 是、和(图)且 是在 龄幼虫头部中表达量最高的基因 具体来看 在 龄幼虫腹部显著高表达 其次为 龄幼虫胸部且均 显 著 高 于 其 他 龄 期 和 体 段()在 龄幼虫腹部的表达量显著高于 龄头部 且均显著高于其他龄期和体段()的表达量在 龄幼虫的腹部依次显著高于 龄幼虫的胸部和头部 且 龄幼虫在各体段的表达 量 均 显 著 高 于 其 他 龄 期()在 龄和 龄幼虫胸部的表达量显著高于其 他 龄 期 和 体 段()在 龄幼虫腹部的表达量最高 显著高于其他龄期和体段()和 在 龄幼虫头部的表达量显著高于其他龄期和体段()依次在 龄幼虫胸部和头部以及 龄幼虫头部表达量最高 且相互差异显著()在 龄幼虫胸部的表达量高于腹部 腹部高于头部 且均显著高于其他龄期和体段()仅在 龄的头腹部表达且腹部的表达量显著高于头部()在 龄幼虫胸部表达量高于 龄头部 且均高于其他龄期的各体段()在 龄幼虫腹部的表达量显著高于其他龄期和体段()(图)综合分析发现 个 的最高表达量均在 龄幼虫的某个体段 个 的最高表达量在 龄幼虫的某个体段 同时分别有 个和 个 在桉蝙蛾幼虫胸部和腹部的表达量最高 在桉蝙蛾幼虫不同龄期、不同体段的表达水平 测定了 个 在桉蝙蛾幼虫 体段和 龄期中的表达(图)在 龄幼虫腹部的表达量显著高于 龄幼虫头部 且 龄幼虫各体段的表达量均显著高于其他龄期()在 龄幼虫头部中的表达量显著高于其他龄期和体段()在 龄幼虫腹部的表达量依次显著高于 胸 部 和 其 他 龄 期 和 体 段()在 龄幼虫腹部和 龄幼虫胸部中的表达量 显 著 高 于 其 他 龄 期 和 体 段()在 龄幼虫胸部中的表达量显著高于其他龄期的各体段()(图)综合分析发现 个 的最高表达量均在 龄幼虫的某个体段 同时各有 个 在桉蝙蛾幼虫腹部和胸部的表达量最高 结论与讨论桉蝙蛾是桉树的重要蛀干害虫 深入了解其嗅觉感受分子基础 可为新型引诱剂或趋避剂的开发奠定理论基础 幼虫头部是主要的嗅觉识别部位()在桉蝙蛾幼虫头部中 气味结 合 蛋 白、和 的表达量均在 龄幼虫中显著偏高()呈现出明显的幼龄头部的偏好性 且 是在 龄幼虫头部中表达量最高的基因 气味结合蛋白在桉蝙 期邱峙嵩等:桉蝙蛾 龄幼虫嗅觉结合蛋白的高表达量与其寄主选择时期的一致性图 在 体段和 龄期的表达谱 注:头部 胸部 腹部 龄幼虫 龄幼虫 龄幼虫 龄幼虫 误差线为标准误误差线上的不同小写字母表示在 水平上显著差异 下同:.蛾幼虫头部高量表达的结果与甜菜夜蛾 幼虫()的结果一致 甜菜夜蛾 主要表现出在幼虫头部偏向性表达 研究发现 丽蚜小蜂 通过其 识别番 茄 植 株(何 艳 艳)甜菜夜蛾 幼虫的 在 龄幼虫头部表达量显著高于 龄和 龄幼虫 结合 龄幼虫的高食量需求 推测 参与了幼虫觅食的寄主识别过程()值得注意的是 桉蝙蛾 龄幼虫头部偏好性的表达模式与桉蝙蛾 龄幼虫地栖转树栖 需要识别环境中寄主挥发物的选择行为相吻合(杨秀好)表明这些基因在栖息地转移的寄主挥发物识别的过程中发挥重要的作用 推测、和 是幼龄幼虫参与寄主气味识别最主要的环境昆虫学报 卷图 在 体段和 龄期的表达谱 蛋白 特别是表达量最高的 此外 触角是嗅觉识别的主要器官 研究发现 的多个 呈现幼虫触角的偏向性表达()棉铃虫 多个 也在幼虫触角表达()免疫定位进一步发现小菜蛾 的 个 在幼虫触角的锥形感器中高表达()基于前期研究的桉蝙蛾幼虫触角感器(胡平等)需进一步探究以上气味识别的主要的蛋白 在桉蝙蛾幼虫触角上的表达情况以进一步精确阐述其在桉蝙蛾幼虫寄主选择过程中具体的嗅觉功能 和 在 龄幼虫头部的表达量显著高于其他龄期的头部 幼虫头部是触角着生部位 也是感觉中心 推测这些基因可能也主要行 使 桉 蝙 蛾 幼 虫 嗅 觉 识 别 功 能 在 粘 虫 ()、禾谷缢管蚜 ()、稻褐飞虱 ()和 ()的研究均支持 参与植物挥发物的识别 进一步研究发现 与幼虫口器相比 棉铃虫 幼虫触角表达更多的 ()所以在桉蝙蛾幼龄幼虫头部中高表达的 个 可能是重要的化学感受蛋白 在复杂的环境中通过帮助幼虫识别寄主挥发物而选择寄主 等()研 究 赤 拟 谷 盗 幼虫胸部发现有锥形感器(化学感受器)和刺形感器(分为机械及味觉感受亚型)的分布 腹部有毛形感器(化学感受器)和刺形感器(机械及味觉感受亚型)的分布 胸腹部感受器的分布表明昆虫的胸腹部可能有嗅觉感受的功能 在桉蝙蛾幼虫中 在胸部和腹部分布着大量的刺形感器和 鬃毛(胡平等)同时 和 的结合蛋白在桉蝙蛾幼虫腹部和胸部的表达量最高 推测桉蝙蛾幼虫的胸部和腹部 除了机械感受以外 也可能具有气味感受的功能 此外结合蛋白在桉蝙蛾幼虫腹部和胸部高表达 也可能表示该结合蛋白在幼虫体内行使非嗅觉功能 已有研究表明结合蛋白具有非嗅觉功能 如在意大利蜜蜂 的研究中发现 在蜜蜂工蜂的胸、腹部中的表达量高 其可能参与角质层疏水碳氢化合物的运输 从而使工蜂能识别蜂群中的同伴()棉铃虫 和 的精液中含有丰富的 等()推测该蛋白是产卵抑制剂的载体 此外 在棉铃虫 的眼中发现多种与视觉相关的 这可能与视觉色素的产生和运输有关()所以这些在桉蝙蛾幼虫胸腹部高量表达的结合蛋白的其他非嗅觉功能有待进一步研究绝大部分大豆蚜 在 龄若虫的表达 期邱峙嵩等:桉蝙蛾 龄幼虫嗅觉结合蛋白的高表达量与其寄主选择时期的一致性量最高 表明大豆蚜 龄若虫是其对寄主植物的取食和搜索行为的调控表达的关键时期()在桉蝙蛾中 个 和 个 的最高表达部位均在 龄幼虫的某个体段 个 的最高表达部位在 龄幼虫的某个体段 表明 的结合蛋白在幼龄幼虫(龄和 龄)的某个体段表达量最高 结合蛋白在 龄幼虫头部的显著高量表达与 龄幼虫转移栖息地和选择寄主相一致 同时结合蛋白在幼龄幼虫中的高量表达可能与选择寄主后幼龄幼虫对寄主挥发物的适应一致 且、和 在 龄幼虫各体段中的表达量均高于其他龄期的各体段 推测其在 龄幼虫寄主选择中具有重要意义本研究探究了桉蝙蛾结合蛋白在幼虫 个龄期和 个体段的表达模式 结果表明 在桉蝙蛾幼 虫 头 部 中、和 具有 龄幼虫头部表达的偏好性 这与桉蝙蛾 龄幼虫地栖转树栖的寄主选择行为相适应 推测这些蛋白是参与桉蝙蛾幼虫寄主识别最主要的蛋白 同时 结合蛋白均在幼龄幼虫(龄和 龄)的某个体段表达量最高 这与 龄幼虫寄主选择以及选择后幼龄幼虫对寄主挥发物的适应相一致 该结果均支持桉蝙蛾幼龄幼虫寄主选择的推测 为探究桉蝙蛾幼虫寄主识别的分子机制奠定了基础 此外 根据本研究筛选出的主要结合蛋白 其具体的嗅觉功能需要结合分子生物学、化学生态学、免疫组织化学等多种手段 进行进一步验证 而在桉蝙蛾幼虫腹部和胸部高量表达的结合蛋白的功能也有待进一步研究参考文献().():.():(:).:.():(:).():陈秀琳 苏丽 陈丽慧 等 梨小食心虫 气味结合蛋白的分子克隆、表达谱及结合特性分析.昆虫学报 ():.():陈勇平 吕建雄 陈志林 我国桉树人工林发 展 概 况 及 其 利 用 现 状 .中 国 人 造 板 ():.():.:何艳艳 丽蚜小蜂对烟粉虱寄主选择 基因筛选与表达研究.北京:中国农业科学院 .():胡平 杨秀好 杨振德 桉蝙蛾幼虫触角及胸腹体表感器形态及分布特征.北京林业大学学报 ():(:).:胡平.沙棘木蠹蛾嗅觉相关基因筛选及性信息素结合蛋白功能研究.北京:北京林业大学 .():().():.():().:李广伟 梨小食心虫识别寄主植物挥发物的分子机制.陕西:西北农林科技大学 环境昆虫学报 卷 .():():莫建初 王成盼 尉吉乾 昆虫外周嗅觉系统研究进展.江西农业大学学报 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