不同浓度的赤藓糖醇对变异链球菌生物膜结构的影响.pdf

A /S R细胞的增殖均有抑制作用,已报道对非S U耐药的肾癌细胞,P P A R 配体也表现为增 殖 抑制 和诱 导细 胞 凋亡,提示P P A R 配体对肾癌细胞的抑制作用和产生S U耐药的机 制没 有 相 关 性.其 次,R G处 理 后 O/S R和A /S R细胞促进HUV E C小管形成能力明显减弱,显示R G具有抑制S U耐药肾癌生成血管的能力,已知HUV E C小管的形成高度依赖于环境中V E G F水平,W e s t e r nb l o t结果表明,R G处理后V E G F蛋白的表达水平明显下降,证实R G对V E G F的负调节是其抑制HUV E C小管形成的基础.由于P P A R 配体也可能通过非P P A R 依赖性途径起作用,本研究用s h R NA静默P P A R 表达后发现R G的抑制效应被逆转,证明R G对血管生成的抑制和激活P P A R 相关,提示其他能激活P P A R 的配体也可能存在类似的效应.S T A T 是人类各种恶性肿瘤细胞生长和转移的关键因子,同 时 也 被 证 实 是V E G F的 调 节 因 子 之 一,活 化 的S T A T 通过促进H I F的转录和直接结合V E G F的启动子两种途径上调V E G F的表达.本研究显示,R G抑制耐药肾癌细胞AK T和S TA T 蛋白的活化和磷酸化,这一作用也和P P A R 的激活相关,推测R G下调V E G F表达是通过P P A R AK T/S T A T 信 号 轴 发 挥 作 用.本 研 究 表 明,R G不仅直接抑制细胞增殖,还能通过激活P P A R 抑制肿瘤血管的生成,有可能在治疗S U耐药的肾癌中发挥作用,并且R G作为已在临床使用的治疗药物,其实用性更强.但在体内实验中R G是否也具有改变肾癌对S U耐药的作用,还需要进一步研究.参考文献S m a l l J,W a s h b u r nE,M i l l i n g t o nK,e t a l T h ea d d i t i o no f a b e m a c i c l i bt os u n i t i n i bi n d u c e sr e g r e s s i o no fr e n a lc e l lc a r c i n o m ax e n o g r a f t t u m o r sJ O n c o t a r g e t,():M o r a i sC S u n i t i n i br e s i s t a n c ei nr e n a lc e l lc a r c i n o m aJ JK i d n e yC a n c e rVHL,():郭鑫,宗 欢 欢,李 杜 达,等 P P A R 在 肿 瘤 中 的 双 重 作 用J中国细胞生物学学报,():K o t l i n o w s k i J,J o z k o w i c zA P P A RG a mm aa n da n g i o g e n e s i s:e n d o t h e l i a lc e l l s p e r s p e c t i v eJJ D i a b e t e s R e s,:O s a k oY,Y o s h i n oH,S a k a g u c h iT,e t a l P o t e n t i a l t u m o r s u p p r e s s i v er o l eo f m i c r o R NA a pi ns u n i t i n i b r e s i s t a n tr e n a lc e l l c a r c i n o m ac e l l s t h r o u g ht h er e g u l a t i o no fR RM J I n tJO n c o l,():W a n gY,C h e nS,S u nS,e t a l W o g o n i n i n d u c e s a p o p t o s i s a n dr e v e r s e ss u n i t i n i br e s i s t a n c eo f r e n a l c e l l c a r c i n o m ac e l l sv i a i n h i b i t i n g C D K R B p a t h w a yJF r o n t P h a r m a c o l,:K o t l i n o w s k iJ,J o z k o w i c zA P P A Rg a mm aa n da n g i o g e n e s i s:e n d o t h e l i a lc e l l s p e r s p e c t i v eJJ D i a b e t e s R e s,:P i a t k o w s k a C h m i e l I,G a w r o s k a G r z y w a c zM,N a t o r s k a C h o m i c k aD,e ta l P i o g l i t a z o n ea sam o d u l a t o ro ft h ec h e m o r e s i s t a n c eo fr e n a lc e l la d e n o c a r c i n o m at om e t h o t r e x a t eJ O n c o lR e p,():H eM,X u eY M i c r o R NA as u p p r e s s e sp r o l i f e r a t i o na n d i n v a s i o np o t e n t i a l o fn o n s m a l l c e l l l u n gc a r c i n o m a sv i ar e g u l a t i o no fS T A T J O n c oT a r g e t sT h e r,:L i uY,C h e nS,L i uJ,e ta l T e l m i s a r t a ni n h i b i t so x a l a t ea n dc a l c i u mo x a l a t e c r y s t a l i n d u c e de p i t h e l i a l m e s e n c h y m a l t r a n s f o r m a t i o n v i a P P A R AK T/S T AT/p MA P K S n a i lp a t h w a yJ L i f eS c i,:基础研究不同浓度的赤藓糖醇对变异链球菌生物膜结构的影响福建医科大学附属口腔医院儿童牙科(福州 )杨秀娟姚军基金项目:福建省医学创新课题(C X )【摘要】目的探讨不同浓度的赤藓糖醇对变异链球菌生物膜结构的影响.方法采用激光共聚焦显微镜结合死菌与活菌荧光染色技术,对比不同浓度的赤藓糖醇对变异链球菌生物膜结构的影响.结果随着赤藓糖醇浓度的增加,变异链球菌生物膜各层活菌百分比减少,厚度变薄,细菌密度降低,且差异均有统计学意义(P ).结论赤藓糖醇对变异链球菌有抑制作用,作用随浓度增加而增强.【关键词】赤藓糖醇;变异链球菌;生物膜【中图分类号】R 【文献标识码】B【文章编号】()E f f e c t so f e r y t h r i t o l a t d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o nt h eb i o f i l ms t r u c t u r eo f s t r e p t o c o c c u sm u t a n s Y ANGX i u j u a n,Y A OJ u nD e p a r t m e n to fP e d i a t r i cD e n t i s t r y,A f f i l i a t e dS t o m a t o l o g i c a lH o s p i t a lo fF u j i a n M e d i c a lU n i v e r s i t y,F u z h o u,F u j i a n ,C h i n a【A b s t r a c t】O b j e c t i v e T oc o m p a r e t h ee f f e c t so f e r y t h r i t o l a td i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n so nt h eb i o f i l ms t r u c t u r eo f s t r e p t o c o c c u sm u t a n s M e t h o d s T h ee f f e c t so fd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fe r y t h r i t o lo nt h eb i o f i l ms t r u c t u r eo fs t r e p t o c o c c u sm u t a n s福建医药杂志 年月第 卷第期F u j i a nM e dJ,J u n ,V o l ,N o w e r ec o m p a r e db yC L S Mc o m b i n e dw i t hf l u o r e s c e n c e s t a i n i n go f d e a db a c t e r i aa n d l i v eb a c t e r i a R e s u l t s W i t ht h e i n c r e a s eo f e r y t h r i t o l c o n c e n t r a t i o n,t h ep e r c e n t a g eo fv i a b l eb a c t e r i a i ne a c hb i o f i l ml a y e ro f s t r e p t o c o c c u sm u t a n sd e c r e a s e d,t h et h i c k n e s sb e c a m e t h i n n e r,t h eb a c t e r i a l d e n s i t yd e c r e a s e d,a n dt h ed i f f e r e n c e sw e r es i g n i f i c a n t(P )C o n c l u s i o n E r y t h r i t o lh a sa ni n h i b i t o r ye f f e c to ns t r e p t o c o c c u sm u t a n s,a n dt h ee f f e c t i n c r e a s e sw i t ht h e i n c r e a s eo f e r y t h r i t o l c o n c e n t r a t i o n【K e yw o r d s】e r y t h r i t o l;s t r e p t o c o c c u sm u t a n s;b i o f i l m赤藓糖醇是一种多元醇,是一种新型的“零”热值天然甜味剂,口感良好,不会引起胃肠不适,和其他甜味剂同时使用可以起到协同增效作用.此外,它还是一种无热、具有防龋作用、不会引起血糖反应、抗氧化的甜味剂,广泛应用于食品、医药、化妆品、化工等领域 .对于赤藓糖醇在食品工业领域的应用研究已经比较深入,而针对赤藓糖醇在龋病预防方面的研究甚少.本实验采用激光共聚焦显微镜(C L S M)结合死菌与活菌荧光染色技术,观察对比不同浓度的赤藓糖醇对体外实验条件下 h变异链球菌单菌种生物膜结构的影响,从而为赤藓糖醇应用于龋病预防提供实验依据和基础.材料与方法 实验材料:实验菌株:变异链球菌标准株(S t r e p t o c o c c u sm u t a n s,Sm u t a n s)A T C C (由四川大学华西口腔医学院龋病研究室惠赠).实验主要仪器:超净工作台(苏州净化设备有限公司)、L D Z X K B S立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)、YQ X 厌氧培养箱(上海新苗医疗器械制造有限公司)、KQ D B超声清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)、酶标仪(H e r a e u,德国)、微量加样枪、激光共聚焦扫描显微镜(L e i c aT C SS P,G e r m a n y).主要试剂:T P Y液体培养基(m L液体中含有 g胰蛋白胨,g酵母提取物,g蔗糖,g磷酸二氢钾,gKHP O HO,gN aC O,gN a C l,m LHO)、T P Y固体培养基(m LT P Y液体培养基中加入 g琼脂)、P B S液(mm o l/LN a C l,mm o l/L K C l,mm o l/L N aHP O,mm o l/LKHP O,p H )、赤藓糖醇(山东宝龄宝生物股份有限公司)、L L I V E/D E A DB a c t e r i a lV i a b i l i t yK i t(M o l e c u l a rP r o b e s,U S A).实验方法:配制赤藓糖醇实验溶液:将赤藓糖醇溶于蒸馏水中,配成浓度为、的赤藓糖醇溶液,高温高压蒸汽消毒 m i n,备用.变异链球菌的复苏:接种冻干的变异链球菌标准株至T P Y固体培养基内,厌氧培养(N、C O、H)h,形态学检查为纯培养物后用于传代.变异链球菌的培养:取上述复苏的标准株接种于T P Y固体培养基内,厌氧培养(N、C O、H)h,形态学检查为纯培养物后纳入实验.变异链球菌菌悬液的制备:用无菌接种环刮取上述细菌接种于T P Y液体培养基中,厌氧培养(N、C O、H)h,涂 片 镜 检 为 纯 培 养 物 后,将菌液分散到P B S液中,震荡均匀后在酶标仪上调节菌浓度为A ,此菌液为本实验所需工作菌悬液.细菌生物膜的形成:在孔细胞培养皿中放入灭菌的 mm mm盖玻片,每孔一片,将准备好的菌液m L接种于孔细胞培养皿中,同时分别加入等体积不同浓度(、)的赤藓糖 醇 实验 溶液,以P B S缓冲液m L与实验菌液m L混合作为阴性对照,以P B S缓冲液m L作为空白对照,每组溶液准备个平行样本.将孔细胞培养皿置 于厌 氧培 养 箱中,厌 氧培 养(N、C O、H)h.荧光染液的配制:本实验采用的荧光染色剂为L L I V E/D E A DB a c t e r i a lV i a b i l i t yK i t(M o l e c u l a rP r o b e s,U S A),该荧光染色剂含有能使活菌发出绿色荧光的S Y TO 以及使死菌发出红色荧光的P I,因此,在镜下,通过测定绿色荧光和红色荧光就可以区分活菌和死菌.将荧光染色剂按照S Y T O P I 蒸馏水 L Lm L的比例加入同一离心管,振荡混匀备用.每一标本使用染液 L.以上操作均在避光下条件下进行.变异链球菌生物膜的荧光染色:将上述生长 h的变异链球菌生物膜盖玻片取出,用灭菌的P B S缓冲液轻洗盖玻片次(去除未黏附的松散的细菌),置于载玻片上.取 L上述准备好的荧光染液滴于盖玻片变异链球菌生物膜表面,室温下,黑暗环境下孵育 m i n后,再用灭菌的P B S缓冲液轻轻洗涤生物膜标本,以去除生物膜表面其他附着物.黑暗环境下,于生物膜上滴一滴p 苯二胺抗淬灭剂(甘油,P B S,p H为 ,其中p 苯二胺浓度为mm o l/L),再滴一滴灭菌的甘油/P B S缓冲液封片剂(甘油与P B S缓冲液体积比为),盖上盖玻片,避光存放,并立即镜检.激光共聚焦扫描显微镜观察:将上述准备好的标本置于激光共聚焦扫描显微镜下观察.镜下死菌显示为红色,活菌为绿色.每个生物膜标本由底层(生物膜和盖玻片相贴的面)向表层(生物膜游离面)逐层沿Z轴扫描,Z轴步距为m,得到断层扫描图像.每个标本随机观察个视野.观察条件:氩 激光(/n m),氦 氖 激 光(n m),物镜,目镜.应用L A SA FL i t e图像分析软件分别计算活菌和死菌连续扫描图像生物膜底层、生物膜中间层、生物膜表层.应用软件测量分析生物膜底层至表层的厚度,红光和绿光荧光面积分别代表生物膜各层死菌和活菌的情况,通过测量每层死菌和活菌的面积(两者之和为生物膜密度),计算每层活菌百分比.活 菌 百 分 比 计 算 公 式 为:活 菌 百 分 比该层绿色荧光面积和该层红色荧光面积绿色荧光面积 统计学分析:采用S P S S 统计软件进行数据处理.计量资料以xs表示,多组间比较采用单因素方差分析,福建医药杂志 年月第 卷第期F u j i a nM e dJ,J u n e ,V o l ,N o 多组间的两两比较采用L S D t检验.P 为差异有统计学意义.结果 激光共聚焦扫描显微镜下生物膜结构:阴性对照组未见附着物.阴性对照组及赤藓糖醇各组的盖玻片上均有生物膜形成,生物膜呈灰白色,平铺在盖玻片上,且具有一定厚度.生物膜经荧光染液染色后,C L S M下观察显示:变异链球菌生物膜呈空间立体结构,形态多样,颜色各异,有红色、绿色及红绿色相互交叉重叠的橘黄色,同时可观察到细菌之间存在着数量和形态不同的暗黑的孔隙和通道.阴性对照组变异链球菌生物膜密度明显高于其他赤藓糖醇组.阴性对照组生物膜呈片状,面积最大,最厚,几乎填满整个盖玻片.赤藓糖醇各组生物膜较薄,零星散开,可见暗黑的空隙,细菌零乱分布,并且浓度越大细菌越分散,空隙明显增加.见图.图不同浓度的赤藓糖醇作用下变异链球菌生物膜C L S M扫描图像(荧光染色 )生物膜活菌百分比:阴性对照组表层、中间层、底层生物膜活菌百分比均小于赤藓糖醇各组,差异均有统计学意义(P ).生物膜底层活菌百分比随赤藓糖醇浓度增加而减少,浓度赤藓糖醇组和浓度赤藓糖醇组之间差异无统计学意义(P );其余组之间差异具有统计学意义(P ).生物膜中间层和底层活菌百分比随赤藓糖醇浓度增加而减少,各组间差异有统计学意义(P ).见表.表赤藓糖醇作用后变异链球菌生物膜各层的活菌百分比(xs)组别底层中间层表层阴性对照组 赤藓糖醇浓度组 浓度组 浓度组 浓度组 F值 P值 注:为与阴性对照组比较,P ;为与浓度组比较,P ;为与浓度组比较,P ;为与浓度组比较,P .生物膜厚度:阴性对照组变异链球菌生物膜平均厚度最大,为()m;不同浓度的赤藓糖醇组生物膜厚度明显小于阴性对照组,均小于 m;浓度赤藓糖醇组生物膜厚度为()m,浓度赤藓糖醇组生物膜厚度为()m,浓度赤藓糖醇组生物膜厚度为()m,浓度赤藓糖醇组生物膜厚度为()m,随赤藓糖醇浓度增加,生物膜厚度呈 现 减 小 趋 势,总 体 差 异 均 有 统 计 学 意 义(F ,P ),两两比较,浓度赤藓糖醇组和浓度赤藓糖醇组之间差异无统计学意义(P ),其余各组之间差异有统计学意义(P ).生物膜密度:阴性对照组变异链球菌生物膜密度明显高于其他赤藓糖醇组.同一层次,对作用后生物膜密度进行比较,阴性对照组均高于所有赤藓糖醇组,总体差异均有统计学意 义(P ).两 两 比 较 显 示:底 层、组间差异无统计学意义(P ),其余组间差异具有统计学意义(P );中间层除、组间差异无统计学意义(P ),其余组间差异具有统计学意义(P );表 层 除、组 间 差 异 无 统 计 学 意 义(P ),其余组间差异具有统计学意义(P ).见表.表赤藓糖醇作用后生物膜密度(xs)组别底层中间层表层阴性对照组 赤藓糖醇浓度组 浓度组 浓度组 浓度组 F值 P值 注:为与阴性对照组比较,P ;为与浓度组比较,P ;为与浓度组比较,P ;为与浓度组比较,P .讨论龋病是人类的一种常见病和多发病,是多因素慢性细菌感染性疾病,是加重或诱发全身疾病的主要口腔疾病.变异链球菌是公认的主要致龋菌,其在牙面黏附、聚集,并进一步形成复杂的牙菌斑生物膜,牙菌斑生物膜是其致龋的前提福建医药杂志 年月第 卷第期F u j i a nM e dJ,J u n ,V o l ,N o 和基础 .本实验采用C L S M结合死菌与活菌荧光染色技术,观察对比不同浓度的赤藓糖醇对体外实验条件下 h变异链球菌单菌种生物膜结构的影响.从实验结果中发现,阴性对照组 h生物膜厚度明显高于赤藓糖醇实验组,并且随着赤藓糖醇浓度的增加,变异链球菌生物膜厚度变薄,各层细菌密度降低,细菌之间的黏结性降低,各层活菌百分比也随浓度的增加而减少,说明赤藓糖醇对变异链球菌生物膜结构有影响,并且影响程度和赤藓糖醇浓度成反比,随浓度增加,影响效果也更加明显.本研究结果证实了赤藓糖醇对变异链球菌生物膜结构的影响作用,以往研究也证实了赤藓糖醇能够抑制变异链球菌产酸,减少唾液和牙菌斑中变异链球菌的数量、黏附以及降低葡糖基转移酶(G T F)和果糖基转移酶(F T F)等固有酶表达的作用等 .赤藓糖醇对变异链球菌生物膜的抑制作用可能是由于赤藓糖醇不能被变异链球菌利用,通过竞争性抑制变异链球菌的磷酸烯醇式丙酮酸依赖性磷酸转化酶系统,从而抑制变异链球菌对糖类的吸收、转运.因为不同浓度的赤藓糖醇的作用强弱不同,所以导致出现不同浓度间抑制效果的差异性.总之,赤藓糖醇能够影响变异链球菌生物膜结构,减少生物膜中细菌数量;但是,关于赤藓糖醇对变异链球菌生物膜结构产生影响的具体机制以及不同浓度间作用的差异还需要在以后的研究中做进一步的探讨.参考文献韩春妮,何芳雁,代蓉,等赤藓糖醇对H O 诱导P C 细胞氧化损伤的保护作用 J昆明 医科大学学报,():马超,王静赤藓糖醇基复合相变材料的研究进展 J材料导报,():L i v e s e yG H e a l t hp o t e n t i a lo fp o l y o l sa ss u g a rr e p l a c e r s,w i t he m p h a s i so nl o w g l y c a e m i cp r o p e r t i e sJN u t r R e s R e v,():M u n r oIC,B e r n tW O,B o r z e l l e c aJF,e ta l E r y t h r i t o l:a ni n t e r p r e t i v es u mm a r yo fb i o c h e m i c a l,m e t a b o l i c,t o x i c o l o g i c a la n dc l i n i c a ld a t aJ F o o d C h e m T o x i c o l,():肖素荣,李京东赤藓糖醇的特性及应用 J中国食物与营养,():唐子圣,朱敏,刘正变异链球菌生物膜结构观察 J中华微生物学和免疫学杂志,():H eJ,T uQ,G eY,e ta l T a x o n o m i ca n df u n c t i o n a la n a l y s e so f t h es u p r a g i n g i v a lm i c r o b i o m ef r o mc a r i e s a f f e c t e da n dc a r i e s f r e eh o s t sJ M i c r o bE c o l,():S o l b i a t iJ,F r i a s L o p e zJ M e t a t r a n s c r i p t o m eo ft h eo r a lm i c r o b i o m e i nh e a l t ha n dd i s e a s eJ JD e n tR e s,():姚军,张佳丽赤藓糖醇对变异链球菌作用机制的实验研究J华西口腔医学杂志,():杨秀娟,姚军赤藓糖醇和木糖醇对变异链球菌黏附的影响J国际口腔医学杂志,():姚军,张帆,杨秀娟,等赤藓糖醇抑制变异链球菌在牛奶中产酸的实验研究 J牙体牙髓牙周病学杂志,():姚军,张琰君,张佳丽,等赤藓糖醇对嗜酸乳杆菌影响配方奶中乳酸代谢量的定量分析 J中华口腔医学杂志,():P a r kYN,J e o n gSS,Z e n gJ,e ta l A n t i c a r i o g e n i ce f f e c t so fe r y t h r i t o l o ng r o w t ha n da d h e s i o no fS t r e p t o c o c c u sm u t a n sJF o o dS c iB i o t e c h n o l,():樊明文,周学东牙体牙髓病学 M 版北京:人民卫生出版社,:基础研究I G F R/P I K/A k t通路及其调控对非小细胞肺癌血管生成拟态形成影响的研究福建医科大学附属第二医院胸外科(泉州 )李荣宾黄延延林贤宾杨建胜基金项目:福建省自然科学资金资助项目(J )福建医科大学附属第二医院超声医学科【摘要】目的为非小细胞肺癌(N S C L C)的治疗探索一个潜在的分子靶标.方法通过q P C R、W e s t e r nb l o t、免疫组化检测N S C L C组织和癌旁组织K L F 、I G F R表达情况;通过抑制I G F R/P I K/A k t通路活化,检测相关靶标MMP 和MMP 的表达;通过I G F R/P I K/A k t通路抑制剂L Y 干预血管生成拟态(VM)形成.结果与癌旁组织相比,免疫组化、W e s t e r nb l o t和q P C R提 示,K L F 在N S C L C组 织 中 表 达 降 低,且 随 着N S C L C级 别 提 高,表 达 量 递 减.N S C L C组织中存在明显I G F R阳性,且I G F R阳性表达量随着N S C L C级别增高而递增.同时,W e s t e r nb l o t和M a t r i g e l三维细胞培养结果表明,随着I G F R/P I K/A k t通路抑制剂浓度增加,I G F R/P I K/A k t通路相关蛋白质、MMP、MMP 表达水平也随之降低,肿瘤VM形成随之减少.结论N S C L CVM的形成与I G F R/P I K/A k t信号通路有关,K L F 在N S C L C中的表达趋势与I G F R表达相反,两者之间是否存在调控关系需进一步验证.【关键词】非小细胞肺癌;抗血管生成;K L F ;I G F R/P I K/A k t;血管生成拟态福建医药杂志 年月第 卷第期F u j i a nM e dJ,J u n e ,V o l ,N o