大白菜叶色深绿突变体 dg 的转录组差异表达调控分析.pdf

第 46 卷第 4 期2023 年 7 月河 北 农 业 大 学 学 报JOURNAL OF HEBEI AGRICULTURAL UNIVERSITYVol.46 No.4Jul.2 0 2 3大白菜叶色深绿突变体 dg 的转录组差异表达调控分析苏湘杰，岳晓楠，卢 银，解紫薇，王彦华，赵建军，刘梦洋（华北作物改良与调控国家重点实验室/河北省蔬菜种质创新与利用重点实验室/河北省绿色高效蔬菜产业协同创新中心/河北农业大学 园艺学院，保定 071001）摘要：大白菜以叶片作为主要食用器官，叶片深绿色可促进光合作用，有效提高作物产量和品质，叶片深绿色大白菜具有重要的应用和育种价值。本研究以大白菜叶色浅绿野生型 WT 和叶色深绿突变体 dg 为材料，通过高分辨率光谱明确突变体 dg 的叶色深绿表型，利用转录组测序（RNA-seq）分析转录水平上的表达调控网络，结果发现叶色深绿突变体 dg 中多个参与植物代谢过程和抗逆生理的细胞色素 P450 单加氧酶基因显著差异表达，同时影响卟啉与叶绿素代谢通路中 PPOX，NYC1-1，NYC1-2 和光合作用通路中 PetH，psbY 等光合相关基因的表达，对植物光合系统研究提供了重要材料，为 BrFC2 基因功能的全面揭示和研究奠定了前期基础。关 键 词：大白菜；叶色深绿；转录组测序中图分类号：S634.1开放科学（资源服务）标识码（OSID）：文献标志码：ADifferential expression regulation analysis of dark-green leaf mutant dg in Chinese cabbageSUXiangjie,YUEXiaonan,LUYin,XIEZiwei,WANGYanhua,ZHAOJianjun,LIUMengyang（State Key Laboratory of North China Crop Improvement and Regulation/Key Laboratory for Vegetable Germplasm Enhancement and Utilization of Hebei/Green and Efficient Vegetable Industry Collaborative Innovation Center in Hebei/College of Horticulture,Hebei Agricultural University,Baoding 071001,China）Abstract:The leaves of Chinese cabbage are the main edible organs.The dark green leaves can promote photosynthesis and effectively improve crop yield and quality.The research of dark green leaves in Chinese cabbage has important application and breeding value.In this study,the light-green leaf of wild type WT plants and the dark-green leaf of dg mutant were compared by high resolution spectrum to verify the dark-green leaf phenotype of the mutant Chinese cabbage.The transcriptional regulatory network was then analyzed using the RNA-seq data.The results showed that cytochrome P450 genes that are involved in metabolic processes and plant stress-resistant physiology were significantly differentially expressed in mutant dg.At the same time,the expression of photosynthesis-related genes were affected including PPOX,NYC1-1,NYC1-2 in porphyrin and chlorophyll metabolism pathway and PetH,psbY in photosynthesis pathway,which provided important materials for the study of plant photosynthetic system and laid a foundation for the comprehensive revelation and study of BrFC2 gene function.Keywords:Chinese cabbage;dark green leaf;RNA-Seq收稿日期：2023-03-10基金项目：河北省自然科学基金优秀青年科学基金项目（C2022204063）；河北省引进留学人员资助项目（C20220364）；河北省研究生创新资助项目（CXZZBS2021039）；河北农业大学引进人才项目（YJ201955）.第一作者：苏湘杰（1995），女，河北衡水人，博士研究生，研究方向为蔬菜种质资源评价及利用创新.E-mail：通信作者：刘梦洋（1989），女，河北保定人，副教授，研究方向为蔬菜功能基因组学.E-mail：liumengyang_ 赵建军（1971），男，河北沧州人，教授，博士生导师，研究方向为蔬菜功能基因组学.E-mail：本刊网址：http:/文章编号：1000-1573(2023)04-0022-11DOI：10.13320/ki.jauh.2023.005523第 4 期野生型 WT 和叶色深绿突变体 dg 为材料，对其进行转录组(RNA-Seq)测序，结合叶绿素合成通路的中间产物的含量变化，分析 BrFC2 突变后卟啉与叶绿素代谢途径和光合作用通路的差异表达基因，在转录水平上解析 BrFC2 调控网络。1 材料与方法1.1 试验材料在人工气候室分别播种大白菜叶色浅绿野生型WT 和叶色深绿突变体 dg 各 20 株。在苗期（播种后 45 d），选取长势一致的野生型 WT 和突变体 dg各 3 个生物学重复，采集由内向外数第 5 片真叶，液氮速冻，-80 保存备用。1.2 试验方法1.2.1 多光谱参数、叶绿素含量及叶绿素荧光参数测定 选取长势一致的大白菜叶色浅绿野生型 WT和叶色深绿突变体 dg 各 3 个生物学重复，采集由内向外数第 5 片新鲜叶片。使用高分辨率多光谱表型成像系统（丹麦 Videometer）采集大白菜叶片可见光图像及多光谱数据。叶绿素的提取和测定如 Porra等所述13。使用 Plant Explorer Pro 对苗期大白菜叶色浅绿野生型 WT 和叶色深绿突变体 dg 进行叶绿素荧光分析，计算光合作用参数，包括 PSII 的最大量子产率（Fv/Fm）、PSII 的有效量子产率 Y（II）、非光化学猝灭（NPQ）、调节能量耗散的量子产率（YNPQ）、调节能量耗散的非量子产率（Y-NO）和电子传输速率（ETR）。1.2.2 叶绿素合成通路中间物质测定 选取长势一致的大白菜叶色浅绿野生型 WT 和叶色深绿突变体dg 各 5 个生物学重复，快速称取 0.1 g，加入 0.9 mL PBS 溶液冰浴匀浆，4 放置 10 min，12 000 r/min，4 离心 5 min 后，加入预先包被-氨基酮戊酸（ALA）、粪卟啉原（CoprogenIII）、原卟啉IX（Proto）、原叶绿素酸酯（Pchlide）、叶绿素酸酯（Chlide）、血红素（Heme）、叶绿素 a（Chlorophyll a）和叶绿素 b（Chlorophyll b）抗体的包被微孔中，反应后，用酶标仪在 450 nm 波长下测定吸光度（OD 值）。绘制各物质的标准曲线，计算测量前体物质的含量。1.2.3 RNA 提取及转录组测序使用 Eastep Super总 RNA 提取试剂盒（Promega）提取植物总 RNA，NEBNext UltraTM RNA Library Prep Kit for Illumina大白菜（Brassica rapa L.ssp.pekinensis）属十字花科芸薹属 2 年生蔬菜作物，广泛栽培于我国北部地区，在日常生活中占有重要地位。大白菜叶片作为主要食用部位，颜色种类较多，差异较大。近年来，叶片深绿色大白菜更容易受到消费者的青睐，叶色深绿可促进光合作用，有效提高产量和品质，具有重要的应用价值，也是研究光合系统结构和基因调控机制的理想材料。叶片颜色突变是植物最常见的且易于鉴定的突变表型。近年，科学家们已鉴定出大量的叶绿素相关基因，涉及到叶绿素的合成、积累和降解途径，这个过程中任何一个基因发生突变，都可能会产生叶色突变体，但是这些突变体多为黄化、白化或条纹状突变体，如叶绿素 a 加氧酶(CHLOROPHYLL A OXYGENASE,CAO)1、光依赖性 NADPH：原叶绿素酸酯氧化还原酶 B(PROTOCHLOROPHYLLIDE OXIDOREDUCTASE B,PORB)2等基因突变。发掘大白菜叶色深绿相关功能基因的研究鲜有报道，其分子调控机制尚不明确。仅有的叶色深绿突变体又称为滞绿突变体，表现为植物在衰老阶段叶绿素降解缓慢或不降解，导致叶片出现持绿表型。拟南芥叶绿素 b还原酶(NON-YELLOW COLORING 1,NYC1)点突变导致未成熟花序在黑暗培养时出现持绿表型3。缺乏脱镁叶绿素酶(Pheophytinase,PPH)的拟南芥叶片保持常绿4。SGR1（STAYGREEN1）作为连通其他通路关键节点基因，在自然衰老和黑暗诱导情况下，sgr1-1 突变体表现出滞绿现象5，且在受生物胁迫和非生物胁迫时表型更为明显6，在芸薹属中，青梗菜SGR1 提前终止导致青梗菜在衰老过程中保持绿色7。甲基磺酸乙酯(Ethyl methylsulfonate，EMS)是人工诱变创新种质中应用最广泛的化学诱变剂，主要导致从 C/G 到 T/A 的单碱基突变8，染色体畸变相对较少，可以改良作物的某一种特定性状。本实验室利用 EMS 诱变大白菜叶色浅绿高代自交系A03(WT)的种子构建了表型变异丰富的大白菜突变体库，从中筛选获得了与营养品质、植株结构、器官形态、生长发育、产量构成等指标相关的多个突变体9-11。前期研究在该突变体库中筛选到一份叶色深绿突变体 dg，叶色深绿突变基因铁螯合酶 2(Ferroch-elatase-2，BrFC2)发生单碱基突变，可同时提高血红素和叶绿素含量12。本研究以大白菜叶色浅绿苏湘杰，等：大白菜叶色深绿突变体 dg 的转录组差异表达调控分析24第 46 卷河 北 农 业 大 学 学 报创建 cDNA 文库。库检合格后，使用 Illumina HiSeq测序平台进行高通量测序。1.2.4 转录组测序结果质控 使用 fastp 软件对测序原始数据进行处理，获得高质量的 Clean Reads；使用 HISAT2 软件将 Clean Reads 比对到大白菜 V3.0参考基因组（http:/brassicadb.org/brad/）上，获取Clean Reads 在参考基因组上的定位信息。1.2.5 差异表达基因鉴定及注释 以 FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped）作为衡量转录本的丰度。使用 DEseq 软件进行样品组间的差异表达分析。GO（Gene Ontology）和 KEGG（Kyoto Encycl-opedia of Genes and Genomes）是 2 种重要的基因注释手段。利用 GO 分析得到预测信息；利用 KEGG富集差异基因显著的通路。1.2.6 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）使用Eastep Super 总RNA提取试剂盒（Promega）提取植物总RNA，使用 EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis 试 剂 盒 以 Anchored Oligo(dT)18 为 引 物合 成 cDNA 第 1 链，使 用 Primer3 设 计 qRT-PCR特异性引物，使用 LightCycler 96 实时荧光定量仪（Roche）以 SYBR qPCR Mix 作为荧光检测染料进行实时荧光定量 PCR，使用 2-CT方法分析目的基因的相对表达量。2 结果与分析2.1 大白菜叶色深绿突变体 dg 的表型鉴定和光合参数分析与大白菜叶色浅绿野生型 WT 相比，突变体 dg在大白菜整个发育时期均表现出明显的叶片深绿色(图 1A)。使用高分辨率多光谱表型成像系统对大白菜叶色浅绿野生型 WT 和叶色深绿突变体 dg 叶片进行 19 个不同波长下的成像，获得大白菜的光谱和叶色信息，结果发现其光谱曲线具有典型的绿色植被光谱特征，同时与大白菜野生型 WT 相比，突变体 dg 在 500 700 nm 波段的反射比显著降低，具有较强的叶色差异性（图 1B），测定大白菜野生型WT 和突变体 dg 叶绿素含量发现，叶色差异由突变体 dg 中叶绿素 b 含量显著升高最终导致总叶绿素含量显著升高造成（图 1C）。ACB收获期莲座期dgWT020406080360 400 440 480 520 560 600 640 680 720 760 800 840 880 920 960反射比/uReflectance 波长/nm Wavelength WTdg*00.20.40.60.8叶绿素Chl a叶绿素Chl b总叶绿素Chl叶绿素/(mgg-1)Chlorophyll WTdg注：A：大白菜野生型 WT 及叶色深绿突变体 dg 的表型鉴定；B：大白菜野生型 WT 及叶色深绿突变体 dg 的光谱分析；C：大白菜野生型 WT 及叶色深绿突变体 dg 的叶绿素含量测定。*P 20 的碱基 百分比/%Q20Phred 30 的碱基 百分比/%Q30GC 含量/%GC contentWT-143 939 52042 706 9780.0397.7993.6847.28WT-246 075 68444 131 4080.0397.7893.7748.13WT-346 254 60043 897 1480.0397.8593.9748.15dg-145 986 96443 347 5260.0397.7893.7546.9dg-241 333 21439 258 7860.0397.7493.648.06dg-344 534 64842 556 7920.0397.8693.8947.91表 2 测序数据质量评价Table 2 The quality of sequencing data样品Sample质控后的 clean reads 数Total Reads比对到基因组上的 reads 数及百分比 Total map比对到参考基因组唯一位置的reads 数及百分比 Unique map成对的 reads 比对到基因组的reads 数及百分比 Proper mapWT-142 706 97839 225 233(91.85%)38 106 904(89.23%)36 147 128(84.64%)WT-244 131 40840 463 997(91.69%)39 131 786(88.67%)36 952 560(83.73%)WT-343 897 14840 228 285(91.64%)38 856 136(88.52%)36 833 938(83.91%)dg-143 347 52639 565 806(91.28%)38 368 213(88.51%)36 350 100(83.86%)dg-239 258 78636 268 520(92.38%)35 232 876(89.75%)33 391 290(85.05%)dg-342 556 79239 102 074(91.88%)37 924 544(89.12%)35 845 848(84.23%)苏湘杰，等：大白菜叶色深绿突变体 dg 的转录组差异表达调控分析26第 46 卷河 北 农 业 大 学 学 报dg_3dg_2dg_10.940.960.981WT_3WT_2WT_1WT_1 WT_2 WT_3dg_3dg_2dg_1图 3 野生型 WT 及叶色深绿突变体 dg 的相关性分析Fig.3 Correlation analysis of WT and dark green leaf mutant dg 2.3 转录组差异基因富集 GO 注释及分析对大白菜叶色浅绿野生型 WT 和叶色深绿突变体 dg 测序结果进行基因注释，注释到 1 220 个差异表达基因，其中与大白菜叶色浅绿野生型 WT 相比，叶色深绿突变体 dg 中 729 个基因表达显著上调，491 个基因表达显著下调，利用 GO 数据库将其注释到生物过程（Biological process）、细胞组分（Cellular component）和分子功能（Molecular function）共 652 个过程中。在生物过程（Biological process）中，多糖分解代谢过程（Polysaccharide catabolic process）被显著富集；在分子功能（Molecular function）中，血红素结合（Heme binding）、四吡咯结合（Tetrapyrrole binding）、氧化还原酶活性，作用于成对供体，分子氧的掺入或还原（Oxidoreductase activity,acting on paired donors,with incorporation or reduction of molecular oxygen）、铁离子结合（Iron ion binding）、-淀粉酶活性（Beta-amylase activity）和淀粉酶活性（Amylase activity）被显著富集（图 4）。描述DescriptionGeneRatio图 4 差异基因富集到的 GO 过程Fig.4 GO pathway enriched by differential genes27第 4 期在血红素结合（Heme binding）、四吡咯结合（Tetrapyrrole binding）、氧化还原酶活性，作用于成对供体，分子氧的掺入或还原（Oxidoreductase activity,acting on paired donors,with incorporation or reduction of molecular oxygen）、铁离子结合（Iron ion binding）等过程中，大多数的差异表达基因为细胞色素 P450（Cytochrome P450，P450）超家族成员（表 3）。在高等植物中，P450 在多种内源性亲脂性化合物的生物合成中起着关键作用，如脂肪酸、甾醇、苯丙类、萜类、植物素、油菜素内酯和赤霉素等14-15，也广泛参与植物的抗逆生理16。叶色深绿突变体 dg 中 CYP81D11 和 CYP81D8 显著差异表达，在拟南芥中，CYP81D11 和 CYP81D8 受甘蓝链格孢接种（A.brassicicola）和茉莉酸甲酯处理诱导表达17。CYP79B2 催化色氨酸生物合成途径（Tryptophan metabolism）中色氨酸（Tryptophan）转化为吲哚-3-乙醛肟（indole-3-acetaldoxime），这是吲哚硫甙（Indole glucosinolate）生物合成中间体，也是 IAA 生物合成中吲哚-3-乙腈（indole-3-acetonitrile，IAN）的前体18-20，对植物防御化合物具有重要作用21，在叶色深绿突变体 dg 中CYP79B2 表达量显著上调。过氧化氢酶 ROG 和过氧化物酶超家族基因转录水平在叶色深绿突变体 dg中显著下调（表 3），而过氧化氢酶和过氧化氢酶主要参与 ROS 活性氧的清除工作。总之这些结果表明，叶色深绿突变体 dg 中某些代谢功能下降，抗逆性和氧化应激稳态受到影响。表 3 GO 富集到的差异表达基因Table 3 Different expression genes by GO基因 IDGene ID拟南芥同源基因Homologys to Arabidopsis上调/下调Up-regulation/Down-regulation描述DescriptionBraA03g016390.3CAT2G30770上调细胞色素P450家族CYP71A13BraA08g030620.3CAT1G13080上调细胞色素P450家族CYP71B2BraA01g001490.3CAT4G37410上调细胞色素P450家族CYP81F4BraA06g036860.3CAT3G28740上调细胞色素P450家族CYP81D11BraA05g015120.3CAT5G36220上调细胞色素P450家族CYP81D1BraA07g016600.3CAT5G67310上调细胞色素P450家族CYP81G1BraA01g000830.3CAT4G39950上调细胞色素P450家族CYP79B2BraA03g061220.3CAT4G39950上调细胞色素P450家族CYP79B2基因 IDGene ID拟南芥同源基因Homologys to Arabidopsis上调/下调Up-regulation/Down-regulation描述DescriptionBraA04g016310.3CAT2G22330上调细胞色素P450家族CYP79B3BraA06g037550.3CAT4G27710上调细胞色素P450家族CYP709B3BraA02g039080.3CAT3G30180上调细胞色素P450家族CYP85A2BraA09g054580.3CAT4G15360上调细胞色素P450家族CYP705A3BraA03g060780.3CAT4G37520上调过氧化物酶超家族蛋白BraA03g060680.3CAT4G37370下调细胞色素P450家族CYP81D8BraA02g026330.3CAT1G64940下调细胞色素P450家族CYP89A6BraA08g017240.3CAT4G31940下调细胞色素P450家族CYP82C4BraA03g001990.3CAT3G44970下调细胞色素P450家族CYP708A2BraA04g020810.3CAT2G29090下调细胞色素P450家族CYP707A2BraA06g003740.3CAT3G14690下调细胞色素P450家族BraA09g026400.3CAT4G12300下调细胞色素P450家族CYP706A4BraA05g032420.3CAT3G14690下调细胞色素P450家族BraA03g016260.3CAT2G30490下调细胞色素P450家族CYP73A5BraA01g011320.3CAT4G13310下调细胞色素P450家族CYP71A20BraA03g055200.3CAT2G25160下调细胞色素P450家族CYP82F1BraA05g032430.3CAT3G14690下调细胞色素P450家族BraA01g037120.3CAT3G14690下调细胞色素P450家族BraA03g034380.3CAT5G04590下调亚硫酸盐还原酶BraA01g040230.3CAT3G10520下调2 类非共生血红 蛋白BraA05g040640.3CAT3G01420下调-双加氧酶(-DOX)，参与抵抗氧化应激和细胞死亡BraA10g029420.3CAT5G06730下调过氧化物酶超家族蛋白BraA03g002260.3CAT5G05260下调细胞色素P450家族CYP79A2BraA07g004440.3CAT5G42180下调过氧化物酶 PRX64BraA03g012640.3CAT5G57030上调番茄红素 环 化酶BraA06g016090.3CAT1G20620下调过氧化氢酶ROG1，催化过氧化氢（H2O2）分解为水和氧气BraA09g006230.3CAT5G24150下调角鲨烯单加氧酶BraA02g042300.3CAT5G24150下调角鲨烯单加氧酶BraA07g022210.3CAT3G56090下调铁蛋白 3，保护细胞免受氧化损伤续表：苏湘杰，等：大白菜叶色深绿突变体 dg 的转录组差异表达调控分析28第 46 卷河 北 农 业 大 学 学 报2.4 转录组差异基因富集 KEGG 注释及分析对大白菜叶色浅绿野生型 WT 和叶色深绿突变体 dg 测序结果的 1 220 个差异表达基因进行 KEGG富集分析共富集到 98 个 KEGG 通路，其中氮代谢（Nitrogen metabolism）、色 氨 酸 代 谢（Tryptophan metabolism）、硫代葡萄糖苷生物合成（Glucosinolate biosynthesis）、甘油酯代谢（Glycerolipid metabolism）、谷胱甘肽代谢（Glutathione metabolism）和组氨酸代谢（Histidine metabolism）等 6 个通路被显著富集。突 变 基 因 BrFC2 作 用 于 卟 啉 和 叶 绿 素 代 谢（Porphyrin and chlorophyll metabolism）途径，并影响植物光合作用。因此，选择卟啉和叶绿素代谢（Porphyrin and chlorophyll metabolism）和光合作用（Photosynthesis）途径中的差异表达基因作为研究突变基因调控的重要途径。在卟啉与叶绿素代谢（Porphyrin and chlorophyll metabolism）通路中，原卟啉原氧化酶（PPOX，BraA10g001110.3C）基因表达量在突变体 dg 中显著上调（图 5）。PPOX 催化原卟啉原 IX 生成原卟啉 IX，随后原卟啉如果与 Fe2+结合，就会转化成血红素，最终生成光敏色素；与 Mg2+结合，会转化为叶绿素 a和叶绿素 b，是叶绿素和血红素分支的最后一步反应；叶绿素 b 还原酶（NYC1_1，NYC1_2）的 2 个拷贝表达量显著降低，参与叶绿素 b 的降解，是叶绿素降解的第一个酶（图 5）；突变基因 BrFC2 及互作的 BrPORBs 基因转录水平在大白菜野生型 WT和突变体 dg 中无显著差异（图 5）。BraA10g030600.3C_HEMC_1BraA01gC01750.3C_RCCHBraA04g028660.3C_HEME2_2BraA03g048280.3C_CHLI1_2BraA06g027050.3C_GSA1_1BraA10g003160.3C_HCARBraA03g003420.3C_HEMC_2BraA03g005900.3C_PPH1BraA01g009960.3C_CHLI1_1BraA08g015150.3C_SGR1_3BraA03g001800.3C_NOLBraA10g007770.3C_CAOBraA03g050600.3C_SGR1_2BraA06g015220.3C_CLH1BraA07g034610.3C_HEMBBraA06g005680.3C_CHLDBraA10g001110.3C_PPOXBraA03g053700.3C_POPB2BraA02g002650.3C_HEMC_3BraA01g018190.3C_PORB1BraA10g021490.3C_DDRBraA09g052610.3C_HEMDBraA10g002190.3C_PORC1BraA02g005150.3C_PPH2BraA05g001750.3C_HEME2_1BraA01g013510.3C_SGR1_1BraA09g007910.3C_GSA1-2BraA03g052230.3C_CHLMBraA09g018050.3C_HEMA1_2BraA08g035300.3C_PORC2BraA09g043060.3C_CHLG1BraA08g006610.3C_NYC1_2BraA09g019990.3C_CLH2BraA01g027430.3C_HEMA1_1BraA09g052590.3C_FC2BraA03g005840.3C_CHLHBraA07g022590.3C_CRD1BraA04g008820.3C_NYC1_1BraA01g022230.3C_CHLG2BraA09g062130.3C_HEME2BraA06g033080.3C_FC1BraA02g032320.3C_CHLI2BraA03g027730.3C_SGR2WT_1WT_2WT_3dg_1dg_2dg_31.510.50-0.5-1-1.5图 5 卟啉与叶绿素代谢通路基因表达热图Fig.5 Gene expression heat map of porphyrin and chlorophyll metabolism pathway29第 4 期为了明确卟啉与叶绿素代谢通路基因的影响，利用 ELISA 方法测量了叶绿素合成通路中重要的前体物质的含量，与大白菜叶色浅绿野生型 WT 相比，叶色深绿突变体dg中-氨基酮戊酸（ALA），原卟啉IX（Proto），叶绿素酸酯（Chlide），血红素（Heme）和叶绿素 b（Chlorophyll b）含量显著增加，原叶绿素酸酯（Pchlide）含量显著降低，而粪卟啉原（CoprogenIII），叶绿素 a（Chlorophyll a）无明显差异（图 6）。*0.0 0.5 1.0 1.5 WTdgHeme/%*0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 WTdgChlb/%0.0 1.0 2.0 ALA/%*PBGGlu-tRNAALAUrogenIIICoprogenIIIProtoIXMg-ProtoIXHemePchlideChlideChl aChl bWTdgWTdg0.0 1.0 2.0 PBG/%*0.0 0.5 1.0 1.5 UrogenIII/%WTdg0.0 0.5 1.0 1.5 CoprogenIII/%WTdgWTdg0.0 1.0 2.0 ProtoIX/%*0.0 1.0 2.0 3.0 Mg-ProtoIX/%WTdg*0.0 0.5 1.0 1.5 WTdgChl a/%*0.0 0.5 1.0 1.5 WTdgPchlide/%*0.0 1.0 2.0 3.0 WTdgChlide/%图 6 叶绿素合成通路示意图及前体物质含量Fig.6 Schematic diagram of chlorophyll synthesis pathway and content of precursor substances苏湘杰，等：大白菜叶色深绿突变体 dg 的转录组差异表达调控分析30第 46 卷河 北 农 业 大 学 学 报在一定程度上，叶绿素含量与光合作用效率呈直接对应关系，提高叶绿素含量可作为提高光合效率的有效措施，因此比较了光合作用通路的差异基因。在光合作用（Photosynthesis）通路中，2 个基因（PetH，PsbY）显著下调，分别参与光合作用中光合电子传递和PSII反应中心复合体的形成（图7）。图 7 光合作用通路的差异表达基因Fig.7 Differential expression gene of photosynthesis pathway2.5 qRT-PCR验证差异基因为了进一步验证 RNA-seq 数据的准确性，挑选了光合作用相关通路的差异表达基因进行实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）验证，qRT-PCR 结果发现，PPOX 表达量在突变体 dg 中显著升高，NYC1-1，NYC1-2，PetH，PsbY 表达量在突变体 dg 中显著降低（图 8A），表现出与 RNA-seq 一致的表达趋势（图8B），进一步说明了 RNA-seq 分析的可靠性。*00.40.81.21.62PPOXNYC1-1NYC1-2PetHPsbY相对表达量Relative expressionWTdgy=1.689 2x-0.030 8R2=0.952 1-1.5-1-0.500.511.5-0.8-0.6-0.4-0.200.20.40.60.8log2FC(qPCR)log2FC(RNA-seq)AB注 A：qRT-PCR 验证 RNA-seq 中的差异表达基因；B：qRT-PCR 和 RNA-seq 相关性分析，*P 0.05。图 8 qRT-PCR 验证 RNA-seq 数据的可靠性Fig.8 Verification of RNA-seq by qRT-PCR31第 4 期3 讨论大白菜是我国栽培面积和消费量最大的叶菜类蔬菜作物，大白菜叶片颜色是育种的重要目标性状，也是研究叶绿素代谢、光合系统和叶绿体发育等机制的理想材料。但是目前挖掘叶片深绿色相关功能基因研究鲜有报道，仅有的叶色深绿突变体又称为滞绿突变体，多为无光合能力的非功能型滞 绿4,22。Liu 等12发现大白菜中 BrFC2 CAB 保守结构域位点发生单碱基突变导致大白菜叶片整个发育时期都表现出深绿色，本研究以大白菜叶片浅绿色野生型 WT 和叶片深绿色突变体 dg 为材料，进行转录组测序(RNA-Seq)，分析 BrFC2 表达调控网络。结果发现，在卟啉与叶绿素代谢（Porphyrin and chlorophyll metabolism）通路中，催化原卟啉原 IX生成原卟啉 IX 的 PPOX 表达量显著升高，催化叶绿素 b 降解的 NYC1 表达量显著降低有关，测定叶绿素合成通路中重要的中间物质的含量发现原卟啉 IX的产量显著升高，叶绿素 b 含量显著升高，与卟啉与叶绿素代谢通路中的差异表达基因表现出一致性；在光合作用（Photosynthesis）通路中，参与光合作用中光合电子传递和 PSII 反应中心复合体的形成的PetH 和 PsbY 表达量显著降低。Liu 等12通过实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）发现 BrFC2 突变后叶色深绿突变体 dg 中 BrFC2 基因表达量未发生显著变化，同时与 BrFC2 互作的 BrPORBs 基因转录水平无显著差异，本研究在转录组卟啉与叶绿素代谢途径中发现了与 Liu 等一致的结果（图 5）。Liu 等12使用高效液相色谱（HPLC）测定叶绿素合成通路中血红素、原叶绿素酸酯和叶绿素酸酯的含量，发现叶色深绿突变体 dg 中 BrFC2 的反应产物血红素含量显著升高，BrPORBs 的底物原叶绿素酸酯含量极显著降低，产物叶绿素酸酯的含量极显著降低升高，进而解析了 BrFC2 和 BrPORBs的互作机制。在本研究中因在卟啉与叶绿素代谢通路中存在差异表达基因，进一步通过 ELISA 方法测定了叶绿素合成通路中重要的前体物质，与 Liu 等人的结果一致。细胞色素 P450 单加氧酶是一类以血红素为辅基的 B 族细胞色素超家族蛋白酶，可催化各种氧化反应23-24。拟南芥基因组包含多达 286 个不同的细胞色素 P450 基因25。在本研究中，差异表达基因显著富集到氮代谢（Nitrogen metabolism）、色氨酸代谢（