5种α-羟基酸提取蓝莓中花色素的条件选择及分析.pdf

6月出版60食品分析食品工程2023年第2 期5种-羟基酸提取蓝素的条件选择及分析*陈子凡*池少铃2陈碧聪1吴丽娟！陈语媽！1（河源市食品检验所，广东河源517000)2（河源市药品检验所，广东河源517000)摘要研究了5种-羟基酸（柠檬酸、杏仁酸、甘醇酸、苹果酸、酒石酸）提取蓝莓中花色素的最佳提取条件。以酸类型、提取时间、提取温度、液料比为影响因素，以提取液中花色素含量为判定指标，采用四因素五水平正交试验优化提取工艺。试验结果表明，在4个因素中，提取温度对结果影响最大，提取时间次之，其中提取温度40 提取效果最好，2 0 和30 之间提取效果相似，提取时间5min和2 0 min之间提取效果相似，液料比10 mL/g提取效果最好。综合考虑花色素的降解和实际使用效果，结合方差分析数据，得出在1g蓝莓中加入3mL0.5%杏仁酸和7 mL水，在2 0 温度下，提取5min为提取花色素的最佳方案。关键词蓝莓；花色素；一羟基酸；提取方法Selection and analysis of conditions for extraction of anthocyaninsfrom blueberry with 5 -hydroxy acids*CHEN Zifan1*CHI Shaoling?CHEN Bicong!WU Lijuan!CHEN Yuyan(Heyuan Food Inspection Institute,Guangdong Heyuan517000,China)2(Heyuan Institute for Drug Control,Guangdong Heyuan517000,China)Abstractt Objective To find the optimal conditions for the extraction of anthocyanins from blueberry with 5 -hydroxy acids(citric acid,mandelic acid,glycolic acid,malic acid and tartaric acid).Methods Using the SPSS19Orthogonal experimental design,made a Orthogonal test table with 4 factors(acid type,extraction time,extractiontemperature,and solid-liquid ratio)and five levels.Using UHPLC-MS/MS,6 kinds of anthocyanins Referencestandards were used to establish a standard curve,using the orthogonal test table to determin the total content ofanthocyanins in the extract,then the data of experimental were collected for the Analysis of Variance.Results amongthe 4 factors,the extraction temperature was the first influence and the extraction time was second.the extraction effectis the best at 40C,the extraction effect between 20C and 30C is similar,and the extraction effect between 5 minand 20min is similar,and the best extraction effect of the solid-liquid ratio is 1g:10mL.Conclusion Considering thedegradation of anthocyanin and the actual use effect,combined with the Analysis of Variance data,adding 3 mL of0.5%mandelic acid and 7 mL water to the 1 g blueberry,and extracting it for 5 minutes at 20 i s t h e o p t i ma l me t h o dfor 5 kinds of acids to extract anthocyanin.Keywordsblueberry;anthocyanin;alpha-hydroxy acid;extraction method中图分类号：TS255.7文献标识码：A文章编号：16 7 3-6 0 44(2 0 2 3)0 2-0 0 6 0-0 4D0I:10.3969/j.issn.1673-6044.2023.02.018蓝莓果中含有丰富的花青素，能有效抑制自由基的氧化反应，具有消除炎症、保护视力、杀灭细菌或妨碍细菌生长繁殖及其活性、保护心血管和预防慢性病等作用。花青素中的花色素具有抗氧化作*基金项目：2 0 2 2 年河源市市场监督管理局科技专项资助项目。*陈子凡，男，198 1年出生，2 0 0 4年毕业于广东石油化工学院化学工程与工艺专业。收稿日期：2 0 2 2-10-0 8用，是因为花色素具有黄酮类化合物的C6-C3-C6结构上，含有一个氧结构的0+，相比花色苷具有分子更小，脂溶性更好，更容易通过细胞膜的优点。在自然界中游离态的花色素并不稳定，蓝莓中的花色素通常和糖结合成花色苷，形成较为稳定的结构存在。为提取到有抗氧化的花色素，一般使用酸化的方法，而为了后续将花色素用于食品、化妆品等，需要使用可以作为食用或化妆品添加的有机酸来提取。本研究利用SPSS软件的正交设计功能，在各6月出版61食品分析食品工程2023年第2 期种因素组合均匀分布的前提下设计试验，再使用液相色谱一串联四级杆质谱法（UHPLC-MS/MS）检测提取液中花色素的总含量，采用SPSS进行方差分析，并最后进行验证，获取柠檬酸、杏仁酸、甘醇酸、苹果酸、酒石酸5种-羟基酸提取蓝莓果中花色素的最佳方案。该研究结果可以为蓝莓种植公司、食品药品开发公司的蓝莓花色素产品的开发和创新提供数据支持和理论依据。1材料和方法1.1材料蓝莓，广东省河源市东源县深蓝农业科技发展有限公司2 0 2 2 年产果实，使用匀浆机匀浆后备用。甲醇，色谱纯，Honeywell；甲酸，色谱纯，Aladdin；L-苹果酸（9 8%）、DL-苦杏仁酸（98.5%）、甘醇酸（98%）、Aladdin；L（+）-酒石酸，广州化学试剂厂，AR；一水合柠檬酸，国药集团化学试剂有限公司，AR；氯化飞燕草素（D e l）、氯化矮牵牛素（Pet），H PL C 纯度95%，上海源叶生物科技有限公司；氯化矢车菊素（Cy）、氯化芍药素（Peo），H PL C 纯度95%，Macklin；氯化花葵素（Pel），H PL C 纯度 97%，Aladdin；氯化锦葵素（Mal)，H PL C 纯度95%，Sigma-Aldrich。1.2主要仪器设备U3000超高压液相系统，TSQEndura三重四极杆质谱配ESI电喷雾系统，XCalibur软件质谱数据处理软件；THERMOFISHER产品；SB-C：色谱柱，1.8m，3.0 m m x 10 0 m m，A g i l e n t；PS510.R1天平,苏州培科公司1.3试验方法1.3.1数据处理利用SPSS软件正交设计功能，以酸类型、提取时间、提取温度、料液比为4个影响因素，设计四因素五水平正交试验，其中酸类型：柠檬酸、杏仁酸、甘醇酸、苹果酸、酒石酸；提取时间：0 min、5min、10 m i n、15m i n、2 0 m i n；提取温度：4、10、10、30、40；液料比：以1g蓝莓果浆为基准，添加1mL、3m L、5m L、7 m L、10 m L的5%酸液到15mL离心管中，并用水稀释至10 mL。设置好因子和水平后，输出的试验次数为2 5次，为软件满足分析主效应所需要的最少次数，为得到更好的均值估计数据，本研究在Options选项中，填人至少49个案例，软件生成含有49个单元的正交试验表，按此表格进行试验1.3.20.5%酸液配制称取柠檬酸、杏仁酸、甘醇酸、苹果酸、酒石酸各2.5g于5个50 0 mL容量瓶中，用水稀释定容至刻度，得到质量浓度0.5%的酸溶液。1.3.3花色素的提取蓝莓果浆和酸液在设计温度下恒定至平衡，称取1g蓝莓果浆，放人50 mL离心管中，加人设计体积的酸液，摇动30 s至均匀，在设计温度下，按照设计时间提取花色素。然后40 0 0 r/min离心1min，取上清液，过孔径0.2 2 m水性滤膜，用串联质谱仪检测花色素含量。1.3.4仪器条件液相条件：A，0.1%甲酸水溶液，B，甲醇，流速0.3mL/min，梯度为0.0 0 0 min2.000min，A95%,B5%;2.000min7.999min，A 95%，B5%;6min，A 10%,B90%;7.999m in 8.0 0 0 m in,A 10%,B90%;8.000min10.000min,A95%,B5%;10.000min,停止，柱温箱温度35。质谱条件：离子源参数为，H-ESI模式，正离子电压350 0 V，鞘气35Arb，辅助气5Arb，离子传送管温度32 0，蒸发温度350。扫描参数为：停留时间10 0 ms，Q 1分辨率0.7 FWHM，Q 3分辨率0.7FWHM，碰撞气为99.99%氩气，1.5mTorr，分析峰宽6 sec。6 种花色素采用SRM扫描模式，以TIC模式计算含量，保留时间、离子信息及软件参数见表1。表16种花色素的质谱参数保留时间母离子产物离子CERFlens名称minmz/smz/sVV17333Del6.92303229321572572713733Cy7.18287213311562413024535Pet7.23317274291673022512133Pel7.42271141341571973024231Mav7.43331287301703153020139Peo7.4630325829149286251.3.5花色素标准溶液配制称取Del、Pe t、C y、Pe o、Pe l、M a l 各适量放人100mL容量瓶中，用1+1甲醇水稀释定容到刻度，再稀释成0 ng/mL、10 n g/mL、50 n g/mL、10 0 n g/mL、250ng/mL、50 0 n g/mL 的标准溶液，上机建立曲线，用于定量测定提取样液中花色素的含量。6月出版62食品分析食品工程2023年第2 期1.3.6提取液中花色素含量测定采用外标法测定花色素含量，花色素最终结果为6 种花色素之和。计算公式为：cXVX=xf,m式中：X为提取花色素的含量，ug/kg；c 为由标准曲线中得出的提取溶液中各花色素的浓度之和，ng/mL；V为提取液体积，mL；m 为试样的质量g；f 为稀释系数。2结果与分析2.1主效应的检验在SPSS中使用“一般线性模型功能”的“单变量”，将提取的花色素含量选为因变量，酸类型、提取时间、提取温度选为固定因子，在“设定”选类型选“主效应”，并把各因素加入模型中，结果表2 所示。表2正交设计的方差分析表来源型平方和自由度均方F值P值校正模样473.155a1629.5723.5190.001截距6 199.59216 199.592737.7130.000酸类型32.57648.1440.9690.438提取时间54.743413.6861.6290.191提取温度344.627486.15710.2520.000液料比41.209410.3021.2260.319误差268.922328.404总计8 669.94449校正的总计742.07648注:a.R=0.638(调整R=0.456)。由表2 可知，酸类型、提取时间、料液比的P值都大于0.0 5，说明在这个试验体系中，这3个因素影响作用不显著，但提取时间比其他2 个因素较为显著。提取温度的P值小于0.0 5，说明对试验体系的影响最显著。2.2多重比较后检验采用多个比较，在“一般线性模型功能”的“单变量”中，选两两比较，将因子全部选人，并选用LSD（L）进行均值之间的比较。数据表明，酸类型之间的P值均大于0.0 5，组间差异不大；提取时间0 min和2 0 min的P值为0.0 44，差异最大，0min和5min的P值为0.0 37，5min和2 0 min的P值为0.7 53，差异最小，其余提取时间之间的差异不大；液料比1mL/g和10 mL/g的P值为0.0 48，差异最大，其余料液比之间差异不大；提取温度10 和其他提取温度的P值均小于0.0 5，40 和30 的P值为0.144，差异不大，30 和2 0 的P值为0.542，差异不大，2 0 和10 的P值为0.0 0 2，差异明显。2.3轮廓图绘制在“一般线性模型功能”的“单变量”中，选“绘制”功能，将各因子选入水平轴，添加到图中，生成4个因子的估算边际均值图，如图1所示。由图1可以看出，甘醇酸提取估算均值 14g/kg，提取效果最佳，其余3种酸估算均值没有差异。提取时间0 min的估算均值14g/kg，提取效果最佳；料液比10 mL/g的估算均值15.00(a)15.00(b)14.0013.0013.00#12.0011.00F11.00柠檬酸酒石酸苹果酸杏仁酸甘醇酸05101520酸类型提取时间/min16.00(c)18.00(d)16.00015.00.8/14.0014.0012.0013.00310.0012.00E8.00135710410203040液料比/mgg提取温度/图1花色素含量估算边际均值轮廓图上接第59页）-6月出版63工程食品食品分析2023年第2 期16g/kg，提取效果最佳，1mL/g和7 mL/g的估算均值16g/kg，10 的估算均值 10 g/kg，2 0、30 差异不大，在14g/kg和16 g/kg之间。轮廓图的估算均值和多重比较所得出的结果一致，按轮廓图可以获得直观的最佳提取条件，并且可以看出提取趋向的变化，在分析最优组合条件和实际使用时，可以在趋向变化的拐点处选择适合的条件参数。3结果和讨论在选择提取条件时，应首先考虑对提取结果影响最大的提取温度，40 提取效果最好，但考虑在日常生活使用中，需要进行额外加热，而且温度过高会造成花色素分解，从方差分析结果看，2 0 和30差异不大，并且在轮廓图中处于一个平台趋向，因此考虑2 0 较为合理。第2 个影响较大的因素是提取时间，2 0 min提取效果最好，但是时间过长，5min的提取效果接近2 0 min，因此选用5min。液料比10 mL/g提取效果最佳，但是酸浓度过高会使得pH偏低，不符合如面膜中pH要求，所以考虑在低酸条件下获得最好的提取效果，以轮廓图中可以看出，液料比为1mL/g提取效果不佳，3mL/g符合要求。酸的选择，杏仁酸提取效果好，而且作为化妆品、食品添加剂使用效果更佳，因此选用杏仁酸。根据此试验条件，进行了2 次的提取，提取结果的平均值为14.9g/kg，与分析估计值接近。最后确定在1g蓝莓中加人3mL的0.5%杏仁酸和7 mL水，在2 0 温度下，提取5min为提取花色素的最佳方案。品货架期的基础。本试验通过对干法生产的配方奶粉货架期内的各项营养素指标进行衰减分析，为婴幼儿配方奶粉的配方设计提供参考。参考文献1张会丰，王卫平.微量营养素与儿童健康J.中国儿童保健杂志，2 0 11,19(8)：6 8 6-6 8 8.2中华人民共和国卫生部.GB148802012食品安全国家标准食品营养强化剂使用标准S.北京：中国标准出版社,2 0 13.3王湘竹，陈忠军，马文龙.乳粉生产过程中营养素损失率的研究J.乳业科学与技术，2 0 10,33（2）：7 5-7 7.4孙健，王青云，宫春颖.不同工艺对配方奶粉中营养素稳定性的影响研究J.中国乳业，2 0 18(10)：6 8-7 1.5陈辉，霍贵成.千法生产婴儿配方乳粉J.中国乳品工业,2 0 0 2,30(5)：10 3-10 5.6郭本恒现.现代乳品加工技术丛书乳粉M.北京：化学参考文献1刘迪，张浩，张寒雪，等.花青素和矢车菊素的生物活性及抗氧化功能研究进展J.吉林医药学院学报，2 0 2 142(1):58-60.2景志行.中国野生蓝莓及其总花青素保肝效果的研究D.上海：上海海洋大学,2 0 18.3马越，王丹，张超，等.花青素饮料缓解视疲劳作用的人体试验观察J.中国食品学报，2 0 15，15（8）：42-46.4王二雷，陈晶晶，刘静波.蓝莓花青素糖和苷元制备技术及其抗氧化活性研究J.现代食品科技，2 0 16,32(10):175-181;189.5周理红.蓝莓花青素的抗氧化活性对比及其稳定性分析J.现代食品科技，2 0 2 0,36(3)：6 5-7 1.6黄颖，任廷远，万红琼，等.食用植物酵素中有机酸功能活性研究进展J.食品与机械，2 0 2 1,37（12）：2 0 9-2 14.7夏莹莹，董潮，高增兵.复合有机酸对大肠杆菌攻毒小鼠免疫功能及肠道菌群的影响江西农业大学学报，2022,44(5):1 207-1220.8梁嘉琪.-羟基酸在化妆品中的应用专利技术综述J.山东化工,2 0 2 0,49(14)：7 0-7 1;7 6.9颜艳，王彤.医学统计学（第5版）M.北京：人民卫生出版社，2 0 2 0:55.10陈平雁.SPSS13.0统计软件应用教程M.北京：人民卫生出版社，2 0 10：154.11GeorgeCasella,Roger L.Berger.统计推断（第二版)M.张忠占，傅莺莺，译.北京：机械工业出版社，2 0 16：532.12叶红玲，姚军，刘冬，等.蓝莓果渣花青素的超声提取及组成分析J.食品研究与开发，2 0 19,40（10)：10 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