miR-505通过靶向核因子-κB调控脂多糖诱导的巨噬细胞活性研究.pdf

岭南急诊医学杂志2023年6月第28卷第3期基金项目：贵州省卫生计生委科学技术基金（gzwjkj 2015-1-048）作者单位：1.遵义医科大学附属医院老年医学科（563003）2.遵义医科大学附属医院贵州省细胞工程重点实验室3.中山大学孙逸仙纪念医院急诊科*通信作者miR505通过靶向核因子B调控脂多糖诱导的巨噬细胞活性研究凌丽1王钰莹2曹其莉1薄世兴1张宗敏1张云3*摘要目的：探讨究微小 RNA 505（miR505）通过靶向调控核因子B（NFB）对小鼠巨噬细胞（RAW264.7）活性的影响。方法：通过生物信息学方法预测miR505和NFB潜在的结合位点，扩增NFB基因的3端非编码区，同时对结合位点进行突变，将野生型（WT）及突变型（MUT）序列克隆至pSicheck2载体中，进行双荧光素酶报告实验。利用Liposome 3000将miR505 mimics及inhibitor转染至RAW264.7细胞中，逆转录聚合酶链反应（Realtime PCR）及Western blot实验检测miR505、NFB的表达。用脂多糖（LPS）及miR505共处理RAW264.7细胞，采用CCK8实验检测细胞的活力，ELISA检测炎症因子肿瘤坏死因子（TNF）和白细胞介素6（IL6）的表达。结果：双荧光素酶结果表明miR505可与NFB的3UTR端结合，且miR505与NFB的表达呈负相关。CCK8结果提示miR505可抑制LPS对RAW264.7细胞的毒性作用；ELISA结果表明miR505可抑制LPS作用下炎症因子TNF和IL6的分泌。结论：miR505可通过靶向作用NFB基因以抑制TNF和IL6的分泌，并降低LPS对RAW264.7细胞的损伤。关键词微小RNA 505；核因子B；巨噬细胞；活性；脂多糖DOI：10.3969/j.issn.1671301X.2022.03.001Study on tThe Effect of miR505 on the Activity of Macrophages by TargetingNFBLING Li1，WANG Yuying2，CAO Qili1，BAO Shixing1，ZHANG Zongming1，ZHANG Yun3*1.Department of Geriatric Wards，The Affiliated Hospital of Zunyi Medical College，5630032.Department of Key Laboratory of Cell Engineering，The Affiliated Hospital of Zunyi Medical College3.Department of Emergency，The Sun Yatsen Memorial Hospital of Sun Yatsen University*Corresponding authorAbstractObjectiveTo investigate the role of miR505 in the activity of macrophagesby regulating NF B.Methods：The potential binding sites of miR505 and NFB were predicted by bioinformatics method，and the 3 UTRof NFB gene was amplified.At the same time，the binding sites were mutated，and the wild type（WT）and mutant（MUT）sequences were cloned into pSicheck2 vector for double luciferase reporting assay.miR505 mimics/inhibitorwere transfected into macrophage RAW264.7 cells by Liposome 3000.The mRNA and protein expression of miR505and NFB were detected by Realtime PCR and Western blot assay.After RAW264.7 cells were treated with LPS andmiR505，the viability of RAW264.7 cells was detected by CCK8 assay，and the expression of inflammatory cytokinesTNF and IL6 was detected by ELISA.Results：The double luciferase assay confirmed that miR505 could bind to the3 UTR of NFB，and the negative correlation between the expression of miR505 and NFB.The results of CCK8assay suggested that miR505 could inhibit the toxic effect of LPS on RAW264.7 cells.The ELISA assay showed that miR505 could inhibit the secretion of inflammatory cytokines TNF and IL6 under the action of LPS.Conclusion：miR505 论著与临床 203岭南急诊医学杂志2023年6月第28卷第3期could inhibit the secretion of TNF and IL6 by targeting NFB，and miR505 can suppress LPSinduced injury inRAW264.7 cells.Key wordsmiR505；NFB；Macrophages；Viability；Lipopolysaccharide全身炎症反应综合征（systemic inflammatoryresponse syndrome，SIRS）是一种全身系统性炎症反应，其释放大量炎症因子的同时损伤内皮细胞，最终导致脏器微循环障碍1。巨噬细胞是炎症反应的关键调节细胞，能被 LPS 激活并产生炎症应答。核因子-B（nuclear factorB，NFB）是一种核内转录因子，能高效诱导TNF、IL6等细胞因子表达，研究证实 NFB 及 microRNAs 在 SIRS 发生发展中起着关键调作用，目前miR505对巨噬细胞活性的影响及相关机制还未见相关报道2-3。因此，本文重点探索了 miR505 对脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）对RAW264.7细胞损伤及炎症因子分泌的影响，探讨 miR505 在 SIRS 中的作用机制。1材料与方法1.1细胞来源小鼠巨噬细胞 RAW264.7 购自ATCC细胞库。1.2主 要 试 剂胎 牛 血 清、胰 蛋 白 酶、OptiMEM、DMEM（GIBCO），Lipofectamine 3000（Invitrogen），miR505 inhibitor/mimics（锐博生物），兔抗鼠 NFB 抗体（Abcam）、兔抗鼠 GAPDH 抗体（Abcam）、CCK8检测试剂盒（DOJINDO），双荧光素酶报告基因试剂盒（Promega），RTqPCR试剂盒（Promega），脂多糖、TNFELISA试剂盒、IL6ELISA试剂盒（默克生物）。1.3细胞培养RAW264.7 细胞系用含 10%FBS的 DMEM 培养，置于 37、5%二氧化碳培养箱中培养，定期换液。1.4细胞转染及分组取对数生长期RAW264.7细胞接种到 6 孔板中，每孔 5（105 个细胞，置于37培养箱中孵育24 h后用Lipo3000转染。miR505 3p mimics 序 列：5 CGUCAACACUUGCUGGUUUUCU3，5AGAAAACCAGCAAGUGUUGACG3；mmumiR5053p inhibitor 序列：5AGAAAACCAGCAAGUGUUGACG3。将细胞分成NC mimics组、miR505 mimics组、NC inhibitor组、miR505 inhibitor 组共四组。按照 6 孔板所需 miRNA mimics或 inhibitor 浓度，取 10 L 的 mimics 或 inhibitor 加入预先装有 125 L OptiMEM 的 EP 管中，混匀后室温放置5 min；取5 L lipo3000加入到预先装有125 L OptiMEM 的 EP 管中混匀，然后将两管稀释物混匀静置 20 min。将混合物逐滴均匀加至 6孔板，6 h后更换成含胎牛血清的DMEM培养基。1.5RNA 提取及逆转录聚合酶链反应按照TRIzol reagent试剂盒说明书提取总RNA，miRNA通过 BulgeLoop miRNA qRTPCR Primer 试剂盒提供的逆转录引物进行逆转，总 RNA 根据 HiSciptIII 1st Strand cDNA Sythesis Kit 试剂盒进行逆转录合成cDNA，采用SYBR Green I荧光法进行逆转录聚合酶链反应。1.6Western blot 检测核因子B 蛋白表达水平细胞加入裂解液后冰上裂解 10 min，BCA 法测定各组细胞总蛋白含量。制备 9%SDSPAGE，上样，100 V电泳1 h后Biorad 300 mA转印2 h，室温下 5%脱脂奶粉溶液中封闭 2 h 后加入相应一抗，4孵育过夜，洗膜后加入二抗孵育2 h后洗膜3 次。ECL 工作液显色，Image J 系统进行灰度分析。1.7双荧光素酶报告基因检测根据小鼠NFB序列设计扩增引物，以小鼠基因组DNA为模板扩增 NFB 的 3端非编码区序列，将其克隆到 pSicheck2 载体中，根据 TargetScan 预测的结合位点，设计突变引物，构建突变载体MUT。质粒构建成功 后 与 miR 505 mimics 及 inhibitor 共 转 染 到RAW264.7细胞，48 h后检测荧光强度。1.8CCK8实验检测细胞活力将RAW264.7细胞以 3000 个/孔铺于 96 孔板中，待细胞贴壁后用不同的条件处理，16 h后每孔加入100 L 含10%CCK8的培养基孵育2 h，酶标仪检测450 nm处吸光度值。1.9ELISA 实验检测肿瘤坏死因子-及白细胞表1实时荧光定量PCR引物序列基因名称GAPDHNFB引物名称GAPDHFGAPDHRNFBFNFBR核苷酸序列（53）CCAATGTGTCCGTCGTGGATTGCTGTTGAAGTCGCAGGAGTCCGCTATGTGTGTGAAGGCTGCAAATTTTGACCTGTGGGT 204岭南急诊医学杂志2023年6月第28卷第3期介素-6 的水平转染 24 h 后的 RAW264.7 细胞中，分别加入100 ng/mL的LPS，16 h后收集各组细胞的上清液，采用 ELISA 法检测细胞上清液中TNF、IL6的含量。1.10统计学分析采用 SPSS 20.0 软件进行统计，Graphpad Prism 8 软件作图，数据用（x s）表示，两组间比较时如资料呈正态分布且方差齐则用 t 检验，无则用校正 t 检验或秩和检验；多组间比较时资料呈正态分布且方差齐则用方差分析，P0.05为差异具有统计学意义。2结果2.1双荧光素酶报告基因实验验证 miR505 与NFB 靶向结合TargetScan 预测结果提示 miR505 与 NFB3UTR 的 608633 位点结合（图 1A），双荧光素酶报告实验结果提示与对照组相比，共转染miR505 mimics和野生型的荧光素酶活性显著降低，共转染miR505 inhibitor和野生型的荧光素酶活性显著升高（P0.05）。2.2miR505可抑制靶基因NFB的表达qRTPCR 和 Western blot 实验结果提示过表达 miR505可抑制NFB的表达，而抑制miR505可明显提高NFB的表达（图2）。2.3miR505抑制脂多糖诱导的RAW264.7细胞损伤CCK8 结果表明 100 ng/mL 的 LPS 可抑制RAW264.7的细胞活力（P0.01，图 3A），过表达及抑制miR505对RAW264.7细胞增殖无影响，但过表达miR505可显著抑制LPS对RAW264.7细胞的损伤，而抑制 miR505 则增加 LPS 对 RAW264.7 细胞的损伤（P0.01，图3 B）。2.4miR505抑制炎性因子的分泌ELISA结果发现 LPS 可促进 RAW264.7 细胞中 TNF 及 IL6的分泌，而高表达miR505后抑制LPS诱导的TNF及IL6分泌，沉默miR505后解除LPS对TNF及IL6分泌的抑制作用（P0.01，图4）。3讨论机体发生SIRS会后炎性细胞被激活并释放大量炎症因子，持续损伤患者免疫系统导致SIRS恶化，严重者可发展为多器官功能不全。TNF、IL6是炎性反应的始发因子，并在促炎过程中具有核心作用，巨噬细胞是炎症反应的主要调节细胞，当其被LPS激活时可产生炎症反应4。微小RNA（microRNA，miRNA）与细胞的增殖、凋亡密切相关，被认为是表观遗传效应因子，miR505基因位于X染色体上非编码核苷酸。Liu等5研究发现miR505可过靶向抑制HMGB1的表达抑制 LPS 刺激的子宫内膜上皮细胞炎性改变，Chai等6发现miR5055p可靶向抑制Myd88表达以减轻肝移植的急性排斥反应。本研究探讨了LPS诱导 RAW264.7 细胞活性改变中 miR505 的影响及机制。首先，我们通过生物信息学分析及双荧光素酶实验证实了miR505与NFB存在潜在的结A：序列显示miR505结合到NFB 3端非编码区域，B：双荧光素酶实验显示miR505作用于NFB的3端非编码区域。n=3，12）代表P0.01。图1双荧光素酶活性检测miR505WTNCWTmiR505MUTNCMUTmiR505inWTNCWTmiR505inMUTNCMUT1）2）4003002001000Relative Luciferase ActivityA AB BA：miR505 在 RAW264.7 细胞中的表达水平，BD：NFB 的蛋白及mRNA表达水平。n=3，1-2）代表P0.01。图2qRTPCR和Western blot检测miR505对NFB的mRNA和蛋白表达的影响miR505NCNC in1）1.5NFB Expression Level（Normalized to GAPDH）1）2）1.01.51.0miR505 inmiR505NCNC in150Relative miR505Expression1）2）100500miR505 in21miR505NC8Relative NFBmRNA Expression1）2）640miR505 in21NC inNFBGAPDHmiR505NCNC inmiR505 inA AC CB BD D 205岭南急诊医学杂志2023年6月第28卷第3期合位点，然后将miR505 mimics及inhibitor转染入RAW264.7 细胞中，采用 qPCR 及 Western blot 实验验证 miR505 mimics 组 NFB 表达显著降低，而miR505 inhibitor组NFB表达显著升高。CCK8结果表明LPS100 ng/mL明显抑制细胞的活力，进而将 100 ng/mL 的 LPS 与 miR505 mimics、miR505inhibitor共处理细胞，发现miR505对RAW264.7细胞增殖无明显影响，但高表达miR505可显著降低LPS对RAW264.7的损伤。NFB 与 DNA 特定序列结合后调控靶基因表达并促进TNF、IL6等炎性因子的释放，因此NFB 在炎症反应中起关键作用7。研究表明LPS与细胞膜上受体结合后启动胞内信号转导，激活NFB后促进TNF、IL1、IL6等炎症因子的释放以增强炎症反应。本研究进一步探讨了miR505 对炎症反应的调控作用，ELISA 结果发现 100ng/mL的LPS处理RAW264.7细胞后炎症因子TNF及IL6的分泌明显升高，而高表达miR505可明显抑制LPS诱导的TNF及IL6的分泌，抑制miR505 后 TNF 及 IL6 的分泌高于 LPS 诱导组。综上所述，miR505在炎症反应中发挥着重要调控作用，其机制可能是通过靶向抑制NFB蛋白的激活，抑制炎症发生时巨噬细胞的活性并下调炎症因子TNF和IL6的表达，减轻炎症的进展，该结果为SIRS治疗提供了新的思路。参考文献1 Margraf A，Ludwig N，Zarbock A，et al.Systemic Inflammatory Response Syndrome After Surgery：Mechanisms and ProtectionJ.Anesth Analg，2020，131（6）：1693.2 Zhang Q，Lenardo MJ，Baltimore D.30 Years of NFB：A Blossoming of Relevance to Human PathobiologyJ.Cell，2017，168（12）：37.3 Lin HJ，Yu SL，Su TC，et al.Statininduced microRNAome alterations modulating inflammation pathways ofperipheral blood mononuclear cells in patients with hypercholesterolemiaJ.Biosci Rep，2020，40（9）：BSR20201885.4 Tang H，Lv W，Sun W，et al.miR505 inhibits cellgrowth and EMT by targeting MAP3K3 through the AKTNFB pathway in NSCLC cellsJ.Int J Mol Med，2019，43（3）：1203.A：不同浓度的LPS溶液对RAW264.7细胞增殖的影响，B：miR505能抑制LPS诱导的RAW264.7细胞损伤。n=3，12）代表P 0.01。图3miR505对LPS诱导下RAW264.7细胞损伤的保护作用1.51.01.50.0Relative Absorbance Value1）A AB BmiR505NCmiR505 inNC in1）1）400200100501001.5Relative Absorbance Value1.01.50.0DMSO100 ng/mL LPS2）2）2）2）2）LPSCon40003000200010000TNF（ng/mL）1）2）miR505 in+LPSA A2）miR505+LPSB BLPSCon200IL6（ng/mL）1）2）miR505 in+LPSmiR505+LPS1501005040200A：miR505抑制了LPS诱导的TNF分泌，B：miR505抑制了LPS诱导的IL6分泌。n=3，1-2）代表P0.01。图4miR505对RAW264.7细胞炎症因子分泌的影响（下转第221页）206岭南急诊医学杂志2023年6月第28卷第3期激甲状腺细胞释放T4增多；本研究结果与此生理学变化相符。研究中林芝地区妊娠早期妇女 FT3的中位数及参考值范围为4.50（3.40-6.05）pmol/L，与非妊娠健康女性比较无明显差异。这与我国其他研究结果不尽相同：新疆乌鲁木齐8及宁波市妊娠早期妇女9测得的 FT3值均较非妊娠女性下降；这可能与人群选择、检测方法等不同有关。但由于人体内的FT3仅25%来自甲状腺合成和分泌，75%来自 T4脱碘，因此并不推荐用于妊娠期甲状腺功能评估。甲状腺疾病的诊断离不开甲状腺功能检测，妊娠期特异性甲状腺功能参考值范围的确定十分重要。高原高海拔地区由于地理环境特点，可能不宜使用平原地区得到的妊娠期甲状腺功能参考值；本研究首次建立了林芝地区妊娠早期特异性甲状腺功能正常参考值范围，有助于减少该地区妊娠期甲状腺疾病的漏诊、误诊，为相关疾病的早期诊治提供参考依据。参考文献1 中华医学会内分泌学分会，中华医学会围产医学分会.妊娠和产后甲状腺疾病诊治指南（第 2 版）J.中华内分泌代谢杂志，2019，35（8）：636.2 Alexander EK，Pearce EN，Brent GA，et al.2017Guidelines of the American Thyroid Association for theDiagnosis and Management of Thyroid Disease DuringPregnancy and the 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