miR-296抑制自噬促进角膜新生血管生成.pdf

收稿日期:基金项目:江西省自然科学基金(A C B );江西省中医药科技计划项目(A );江西省卫健委科技计划项目(,)作者简介:刘珏伶(),女,硕士研究生,主要从事眼表疾病的研究.通信作者:俞益丰,副主任医师,E m a i l:q q c o m.m i R 抑制自噬促进角膜新生血管生成刘珏伶,徐静静,王庆,刘杰,祝泽宇,罗潇,俞康,杨夏玲,俞益丰(南昌大学第二附属医院眼科中心,南昌 )摘要:目的本研究探讨m i R 在角膜新生血管生成中的作用以及其对自噬蛋白L C B /、p 的调控作用.方法利用血管内皮生长因子诱导人脐静脉内皮细胞(HUV E C s)建立体外角膜新生血管模型.实验分为组(C o n t r o l组、模型组、V E G Fm i R m i m i cN C组、V E G Fm i R m i m i c组、V E G Fm i R i n h i b i t o rN C组、V E G Fm i R i n h i b i t o r组).采用R T q P C R检测m i R 在体外新生血管中的表达;转染过表达或者低表达m i R ,采用C C K 、划痕实验、成管实验探究m i R 在体外角膜新生血管生成中的作用;采用K E G G和GO分析预测m i R 参与的通路及其靶基因的作用;采用W e s t e r nb l o t检测m i R 对自噬蛋白L C B /、p 表达的影响.结果R T q P C R结果显示,与C o n t r o l组相比,模型组中m i R 表达升高()比(),t,P ;与V E G Fm i R m i m i cN C组 相 比,V E G Fm i R m i m i c组 细 胞 的 吸 光 度()比(),t,P 、迁移数()比(),t ,P 、分支数()比(),t,P 升 高;与V E G Fm i R i n h i b i t o rN C组 相 比,V E G Fm i R i n h i b i t o r组细胞的吸光度()比(),t ,P 、迁移数()比(),t ,P 、分支数()比(),t,P 降低;K E G G和GO分析预测 了m i R 及 其靶 基因 可能 参 与血 管生 成类 通 路 和 自 噬 水 平 的 调 控;w e s t e r nb l o t显 示,与V E G Fm i R m i m i cN C组相比,V E G Fm i R m i m i c组细胞中L C B 蛋白表达降低()比(),t,P ,p 蛋白表达升高()比(),t ,P ;相反,与V E G Fm i R i n h i b i t o rN C组相比,V E G Fm i R i n h i b i t o r组细胞中L C B 蛋白表达升高()比(),t ,P ,p 蛋白表达降低()比(),t,P .结论m i R 在体外可促进角膜新生血管生成,且此过程与自噬水平的下调有关.关键词:角膜新生血管;m i c r o R NA ;自噬;L C B /;p 中图分类号:R ;R 文献标志码:A文章编号:()D O I:/j c n k i n c d m m i R I n h i b i t sA u t o p h a g y t oP r o m o t eC o r n e a lN e o v a s c u l a r i z a t i o nL I UJ u e l i n g,X UJ i n g j i n g,WA N GQ i n g,L I UJ i e,Z H UZ e y u,L U OX i a o,Y UK a n g,Y A N GX i a l i n g,Y UY i f e n g(E y eC e n t e r,t h eS e c o n dA f f i l i a t e dH o s p i t a l o fN a n c h a n gU n i v e r s i t y,N a n c h a n g ,C h i n a)A B S T R A C T:O b j e c t i v e T oi n v e s t i g a t et h er o l eo fm i R i nc o r n e a ln e o v a s c u l a r i z a t i o na n di t sr e g u l a t o r ye f f e c t o na u t o p h a g yp r o t e i n sL C B /a n dp M e t h o d s H u m a nu m b i l i c a l v e i ne n d o t h e l i a l c e l l s(HUV E C s)w e r e i n d u c e db yv a s c u l a r e n d o t h e l i a l g r o w t h f a c t o r(V E G F)t oe s t a b l i s hac o r n e a l n e o v a s c u l a r i z a t i o nm o d e li nv i t r o T h e c e l l sw e r ed i v i d e d i n t os i xg r o u p s:c o n t r o l g r o u p,m o d e l g r o u p,V E G Fm i R m i m i cN Cg r o u p,V E G Fm i R m i m i cg r o u p,V E G Fm i R i n h i b i t o rN Cg r o u p,a n dV E G Fm i R i n h i b i t o rg r o u p T h ee x p r e s s i o no fm i R i nt h em o d e l o fc o r n e a ln e o v a s c u l a r i z a t i o nw a sd e t e c t e db yR T q P C R A f t e rt r a n s f e c t i o nw i t h m i R 南昌大学学报(医学版)年第 卷第期J o u r n a l o fN a n c h a n gU n i v e r s i t y(M e d i c a lS c i e n c e s),V o l N o m i m i co r i n h i b i t o r,t h er o l eo fm i R i nc o r n e a ln e o v a s c u l a r i z a t i o nw a s i n v e s t i g a t e db yC C K ,s c r a t c hw o u n dh e a l i n ga n dt u b ef o r m a t i o na s s a y s T h em i R i n v o l v e dp a t h w a y sa n di t st a r g e tg e n e sw e r ep r e d i c t e db yK E G Ga n dGOa n a l y s e s T h ee f f e c t so fm i R o nt h ee x p r e s s i o no f a u t o p h a g yp r o t e i n sL C B /a n dp w e r ed e t e c t e db yW e s t e r nb l o t R e s u l t s R T q P C Rs h o w e dt h a tm i R e x p r e s s i o n i nt h em o d e lg r o u pw a sh i g h e rt h a nt h a t i nt h ec o n t r o lg r o u p()v s(),t,P)C o m p a r e dw i t hV E G Fm i R m i m i cN Cg r o u p,V E G Fm i R m i m i c t r a n s f e c t i o ns i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e dt h ea b s o r b a n c eo f c e l l s()v s(),t,P),m i g r a t i o nn u m b e r()v s(),t ,P),a n db r a n c hn u m b e r()v s(),t,P)C o m p a r e dw i t hV E G Fm i R i n h i b i t o rN Cg r o u p,V E G Fm i R i n h i b i t o r t r a n s f e c t i o nr e m a r k a b l yr e d u c e dt h ea b s o r b a n c e()v s(),t ,P),m i g r a t i o nn u m b e r()v s(),t ,P),a n db r a n c hn u m b e r()v s(),t,P)K E G Ga n dGOa n a l y s e sp r e d i c t e dt h ep o s s i b l e i n v o l v e m e n to fm i R a n d i t s t a r g e tg e n e s i nt h er e g u l a t i o no fa n g i o g e n i c l i k ep a t h w a y sa n da u t o p h a g yl e v e l s C o m p a r e dw i t h V E G F m i R m i m i cN Cg r o u p,V E G F m i R m i m i ct r a n s f e c t i o nd e c r e a s e dL C B p r o t e i ne x p r e s s i o n()v s(),t,P),b u t i n c r e a s e dp p r o t e i ne x p r e s s i o n()v s(),t ,P)C o m p a r e dw i t hV E G Fm i R i n h i b i t o rN Cg r o u p,V E G Fm i R i n h i b i t o rt r a n s f e c t i o nu p r e g u l a t e dL C B p r o t e i ne x p r e s s i o n()v s(),t ,P),b u td o w n r e g u l a t e dp p r o t e i ne x p r e s s i o n()v s(),t,P)C o n c l u s i o nm i R c a np r o m o t ec o r n e a ln e o v a s c u l a r i z a t i o n i nv i t r ot h r o u g hd o w n r e g u l a t i n ga u t o p h a g y l e v e l s K E Y WO R D S:c o r n e a ln e o v a s c u l a r i z a t i o n;m i c r o R NA ;a u t o p h a g y;L C B /;p 角 膜 新 生 血 管(c o r n e a ln e o v a s c u l a r i z a t i o n,C NV)是指新生毛细血管突破角膜缘长入透明的角膜,从而带来角膜炎症、水肿、瘢痕等不良影响的眼表病理现象.目前对于角膜新生血管的治疗主要使用 抗 血 管 内 皮 生 成 因 子(v a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o r,V E G F)等药物,但其治疗效果具有一定的局 限 性 .微 小R NA(m i c r o R NA,m i R NA)是一类由 个核苷酸组成的微小R NA序列,大量m i R NA参与调控角膜新生血管的 生成 .m i R 是一种促血管生成的m i R NA,其参与如深静脉血栓形成、脑缺血损伤后血管生成等许多血管方面的疾病 .自噬是指细胞靶向溶酶体降解细胞质物质或回收产物循环利用的一个高度保守机制.在眼部新生血管疾病中,自噬的调控具有双重性,抑制或促进自噬能够促进眼部病理性血管生成 .已有研究证明m i R NA通过调控自噬水平影响细胞的生物学功能,其中包括血管生成.然而,在角膜新生血管中,m i R 是否起作用及其对于自噬调控仍有待研究.本研 究 利 用V E G F诱 导HUV E C s(h u m a nu m b i l i c a l v e i ne n d o t h e l i a l c e l l,HUV E C s)建立体外角膜血管生成模型,探讨m i R 对于角膜新生血管的作用与自噬的调控关系.材料与方法细胞与材料永生化人脐静脉内皮细胞购买自美国AT C C;m i R m i m i c、m i R i n h i b i t o r、对照物及其转染试剂购自广州锐博生物技术有限公司;引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司;C C K 试剂购自美国G L P B I O公司;兔抗人L C B /、p 抗体购自艾比玛特(上海)生物医药有限公司.实验方法实验分组实验分为组.C o n t r o l组:加入等体积P B S溶液;模型组:加 入 质 量 浓 度 为 n gm L的V E G F建立体外角膜新生血管模型;V E G Fm i R m i m i cN C组:转染m i R m i m i cN C;V E G Fm i R m i m i c组:转染m i R m i m i c;V E G Fm i R i n h i b i t o rN C组:转染m i R i n h i b i t o rN C;V E G Fm i R i n h i b i t o r组:转染m i R i n h i b i t o r.细胞培养与转染HUV E C s培养于添加 胎牛血清和青南昌大学学报(医学版)年月,第 卷第期霉素/链 霉 素 的 低 糖DMEM培 养 基 中,置 于 含C O、的 湿 化 培 养 箱 中.细 胞 生 长 至 约 融合时传代,选取 代细胞进行实验.将HUV E C s铺于孔板中,转染时使其达到 密度.将 L的m i R m i m i c、m i R i n h i b i t o r或对照物与缓冲液混合,然后加入 L的转染试剂,共同孵育 m i n后加入各孔中,然后放入培养箱中继续培养.C C K 实验将HUV E C s以 个细胞孔的密度接种于 孔板上.待细胞贴壁后进行转染,转染完成后更换完全培 养基继续 培养 h.测定 时 添 加 LC C K 试剂至每个孔中,使细胞在 环境中孵育h,采用多功能酶标仪在 n m波长读取吸光度值.划痕实验将HUV E C s接种到孔板中.细胞贴壁后进行转染,转染完成后更换完全培养基继续培养直到细胞长满.细胞长满后使用灭菌后的 L一次性移液管尖端划个伤口.继续培养 h后使用倒置显微镜进行拍照.每组重复次.成管实验基质提前在冰箱中融化后以 L孔加入 孔板中,待基质胶凝固后将转染后的各组细胞以 个细胞孔密度种于板中.孵育h后使用倒置显微镜进行拍照.每组重复次.W e s t e r nb l o t实验使用裂解液在冰上裂解转染 h后的HU V E C s以获得细胞蛋白样品,并测定样品浓度.样品通过不同浓度S D S P AG E分离,转移到P V D F膜上,用脱脂奶粉封闭h,然后将膜与特异性一抗(L C B /,;p ,)在 摇床中孵育过夜.一抗孵育完成后充分洗膜,在室温摇床中与二抗孵育h.采用E C L化学发光法对条带进行显影和曝光.q R T P C R实验使用R NA提取试剂盒提取R NA.将R NA逆转录成c D NA并保存于 冰箱中备用,根据说明书配置体系进行反应以获得C T值,采用C T法计算m i R 的相对表达量.相关引物序列见表.表相关引物序列基因名称上游()下游()m i R A C A C T C C A G C T G G GA G G G C C C C C C C T C AAT G G T G T C G T G GA G T C GU C T C G C T T C G G C A G C A C A TA T A C TA C G C T T C A C GAA T T T G C G T G T CK E G G分析和GO分析利 用S T A R B A S E数 据 库 对m i R 进 行K E G G通路分析,利用t a r g e t s c a n、p i c t a r、p i t a数据库对m i R 靶基因进行预测并取交集,然后对其进行GO分析,并将结果制作成气泡图.统计学方法采用G r a p h P a dP r i s m软件进行统计分析.结果数据用均数标准误表示,比较采用t检验和单因素方差分析.以P 为差异有统计学意义.结果m i R 在V E G F诱导的H U V E C s中高表达与C o n t r o l组相比,模型组中的m i R 表达显著升高()比(),t,P ,表明m i R 在体外角膜血管生成模型中呈高表达.m i R 促进H U V E C s的增殖、迁移、成管与V E G F m i R m i m i cN C组相比,V E G Fm i R m i m i c组细胞的吸光度()比(),t ,P 、迁移数()比(),t ,P 、分支数()比(),t,P 升高;与V E G Fm i R i n h i b i t o rN C组相比,V E G F m i R i n h i b i t o r组 细 胞 的 吸 光 度()比(),t ,P 、迁移数()比(),t ,P 、分支数()比(),t,P 降低.提示m i R 在体外促进角膜血管生成.见封三图.m i R 及其靶基因可能参与了血管生成类通路和自噬水平的调控对m i R 进 行K E G G通 路 分 析(封 三 图 A),发现前 条富集途径中大多数通路与血管生成有关,包括MA P K通路、V E G F信号通路等;GO分析m i R 靶基因与自噬相关的结果(自噬负调控、自噬体组装、核自噬)见封三图 B.结果说明m i R 在促进角膜新生血管生成时有可能对自噬产生调控作用.刘珏伶等:m i R 抑制自噬促进角膜新生血管生成m i R 下调H U V E C s中的自噬水平如封三图所示,与V E G Fm i R m i m i cN C组 相 比,V E G F m i R m i m i c组 细 胞 中L C B 蛋白表达降低()比(),t,P ,p 蛋 白 表 达 升 高()比(),t ,P ;相反,与V E G Fm i R i n h i b i t o rN C组相比,V E G Fm i R i n h i b i t o r组细胞中L C B 蛋白表达升高()比(),t ,P ,p 蛋白表达降低()比(),t ,P .提示m i R 在促进体外角膜血管生成的过程中下调了自噬水平.讨论角膜新生血管是一种严重影响视力的角膜病理现象,其形成机制有待探究.利用HUV E C s建立体外 角 膜 血 管 生 成 的 模 型 已 被 用 于 许 多 实 验中,.本研究通过转染调控HUV E C s中m i R 的表达,发现m i R 在体外能够降低自噬水平,促进角膜新生血管的生成.有研究,表明,m i R 是一种促血管生成的m i R NA,m i R 能够促进脑胶质瘤中以及脑缺血损伤后的血管生成.J I等 发现m i R 在碱烧伤小鼠中表达升高,然而m i R 对于角膜新生血管的作用仍不明确.本研究采用C KK 实验、迁移实验 和 成 管 实 验 证 明 过 表 达m i R 可 促 进HUV E C s的增殖、迁移和成管形成,表明m i R 促进体外角膜新生血管生成,m i R 可作为角膜新生血管的治疗靶点,这与先前J I等 的研究具有一致性.F E NG等发现,m i R 通过调控V E G F和N o t c h 通路促进血管形成,WR D I NG E R等 发现m i R 通过调控V E G F R 和P D G F促进血管生成,提示m i R 可能通过调控不同机制参与血管生成过程.本研究通过K E G G分析和GO分析发现,m i R 可能参与MA P K和V E G F通路等血管生 成 相 关 通 路 和 自 噬 水 平 的 调 控,并 通 过w e s t e r nb l o t实验证明m i R 可抑制L C B 的蛋白表达、增加p 的蛋白表达.L C B /和p 是自噬过程中重要的一部分,检测其表达水平是监测自噬水平的一种方法.L C B 蛋白表达减低,p 蛋白表达升高表明在角膜新生血管生成过程中m i R 抑制了自噬水平.有研究 发现自噬有助于维持内皮细胞的内稳态和静止表型,m i R 可能通过抑制这种自噬从而增强促血管生成信号,进而导致角膜新生血管生成.总之,本研究证明m i R 能够促进体外角膜新生血管生成,并且通过L C B 、p 蛋白抑制自噬水平.未来将进一步在体内研究中探讨m i R NA 调控自噬的靶点与机制.参考文献:N I C HO L A SMP,MY S O R ENC o r n e a l n e o v a s c u l a r i z a t i o nJE x pE y eR e s,:R O S HA N D E LD,E S L A N IM,B A R A D A R A N R A F I IA,e ta l C u r r e n t a n de m e r g i n gt h e r a p i e s f o rc o r n e a ln e o v a s c u l a r i z a t i o nJO c u lS u r f,():YAN G WJ,YAN GYN,WANSS,e t a l E x p l o r i n g t h em e c h a n i s mo f t h em i R NA /p a x i l l i na x i s i nc e l lm e t a b o l i s md u r i n gV E G F A i n d u c e dc o r n e a la n g i o g e n e s i sJI n v e s tO p h t h a l m o lV i sS c i,():MUKWAYA A,J E N S E N L,P E E B OB,e ta l M i c r o R NA si nt h ec o r n e a:r o l ea n d i m p l i c a t i o n s f o r t r e a t m e n to f c o r n e a ln e o v a s c u l a r i z a t i o nJ O c u lS u r f,():P ANZC,Z HAN G Y,L ICY,e ta l M i R pa m e l i o r a t e sd e e pv e n o u st h r o m b o s i sb yi n a c t i v a t i n gS A J E x pB i o lM e d(M a y w o o d),():F E N GJ,HUA N GTX,HUA N GQ,e t a l P r o a n g i o g e n i cm i c r o R N A u p r e g u l a t e sv a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o ra n dd o w n r e g u l a t e sN o t c h f o l l o w i n gc e r e b r a li s c h e m i ci n j u r yJ M o lM e dR e p,():Z HUXR,D UJH A u t o p h a g y:ap o t e n t i a l t a r g e t f o r t h e t r e a t m e n to f i n t r a o c u l a rn e o v a s c u l a r i z a t i o nJI n tJO p h t h a l m o l,():V I L L A R E J OZ O R IB,J I M N E ZL OY GO R R IJI,Z A P AT AMUO ZJ,e t a l N e wi n s i g h t s i n t o t h e r o l e o f a u t o p h a g y i n r e t i n a l a n de y ed i s e a s e sJ M o lA s p e c t sM e d,:L UZQ,S H E NJJ,C H E NXB,e ta l P r o p o f o lu p r e g u l a t e sM i c r o R N A b t o i n h i b i te x c e s s i v ea u t o p h a g ya n da p o p t o s i sa n da t t e n u a t e s i s c h e m i a/r e p e r f u s i o n i n j u r y i nv i t r oa n di np a t i e n t sJO x i dM e dC e l lL o n g e v,:L I USL,GAOJ,C HE NJB K n o c k d o w no f l n c RNA TUG s u p p r e s s e sc o r n e a l a n g i o g e n e s i st h r o u g hr e g u l a t i n gm i R p/V E G F AJ M i c r o v a s cR e s,:WR D I N G E RT,T ANNOU SBA,S AY D AM O,e ta l m i R r e g u l a t e sg r o w t hf a c t o r r e c e p t o ro v e r e x p r e s s i o n i na n g i o g e n i ce n d o t h e l i a l c e l l sJC a n c e rC e l l,():J IKB,L I N GL,Z HANG Q,e ta l M i c r o R NA m e d i a t e dc o r n e a ln e o v a s c u l a r i z a t i o ni n a n a n i m a l m o d e lo fc o r n e a lb u r n sa f t e ra l k a l i e x p o s u r e sJ E x pT h e rM e d,():WU W W,XU H,WAN GZM,e ta l P I NK p a r k i n m e d i a t e dm i t o p h a g yp r o t e c t sm i t o c h o n d r i a l i n t e g r i t ya n dp r e v e n t sm e t a b o l i cs t r e s s i n d u c e de n d o t h e l i a l i n j u r yJ P L o SO n e,():e (责任编辑:钟荣梅)南昌大学学报(医学版)年月,第 卷第期m i R 抑制自噬促进角膜新生血管生成(正文见第页)0 h48 h5432165432161.51.00.50543216细胞吸光度#*A150100500546321*#迁移细胞数B150100500546321*#分支数CA:C C K 实验;B:划痕实验;C:成管实验.:C o n t r o l组;:模型组;:V E G Fm i R m i m i cN C组;:V E G Fm i R m i m i c组;:V E G Fm i R i n h i b i t o rN C组;:V E G Fm i R i n h i b i t o r组.P,P,P,P.图m i R 对H U V E C s增殖、迁移、成管的影响ABA:K E G G富集分析;B:GO分析.图m i R 相关的K E G G分析与G O分析546321*#LC3-蛋白表达量B3210543216LC3B-LC3B-actinP62-actin16 kB14 kB42 kB62 kB42 kB546321*#p62蛋白表达量C1.51.00.50AA:蛋白电泳条带;B:L C 的蛋白表达量;C:p 的蛋白表达量.:C o n t r o l组;:模型组;:V E G Fm i R m i m i cN C组;:V E G Fm i R m i m i c组;:V E G Fm i R i n h i b i t o rN C组;:V E G Fm i R i n h i b i t o r组.P,P,P.图m i R 对自噬相关蛋白的调控