血红蛋白的提取和分离专家讲座.pptx

血红蛋白的提取和分离第1页 本课题学习目标本课题学习目标 体验从复杂体系中提取生物大分子基本过程体验从复杂体系中提取生物大分子基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子基本原理。大分子基本原理。1 1 1 1、主要概念：、主要概念：、主要概念：、主要概念：凝胶色谱法凝胶色谱法 电泳法电泳法 缓冲溶液缓冲溶液 它们在血红蛋白提取中分别起到什么作用。它们在血红蛋白提取中分别起到什么作用。2.2.主要原理：主要原理：主要原理：主要原理：凝胶色谱法分离蛋白质原理凝胶色谱法分离蛋白质原理 电泳法分离样品原理电泳法分离样品原理 缓冲溶液组成和作用机理缓冲溶液组成和作用机理血红蛋白的提取和分离第2页 本课题学习重点和难点本课题学习重点和难点 体验从复杂体系中提取生物大分子基本过程体验从复杂体系中提取生物大分子基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子基本原理。大分子基本原理。3 3、课题重点：、课题重点：凝胶色谱法原理和方法凝胶色谱法原理和方法 4 4、课题难点：课题难点：样品预处理样品预处理 色谱柱填料处理和色谱柱装填。色谱柱填料处理和色谱柱装填。血红蛋白的提取和分离第3页 4 4 4 4月月月月14141414日宣告人类基因组序列图完成，这标志着日宣告人类基因组序列图完成，这标志着日宣告人类基因组序列图完成，这标志着日宣告人类基因组序列图完成，这标志着进入了后基因组和蛋白质组时代进入了后基因组和蛋白质组时代进入了后基因组和蛋白质组时代进入了后基因组和蛋白质组时代人类基因组：人类基因组：人类基因组：人类基因组：指指指指DNADNADNADNA分子所携带全部遗传信息分子所携带全部遗传信息分子所携带全部遗传信息分子所携带全部遗传信息 蛋白质组：蛋白质组：蛋白质组：蛋白质组：生物个体表示蛋白质分子总和。主要是对生物个体表示蛋白质分子总和。主要是对生物个体表示蛋白质分子总和。主要是对生物个体表示蛋白质分子总和。主要是对蛋白质功效研究。蛋白质功效研究。蛋白质功效研究。蛋白质功效研究。血红蛋白的提取和分离第4页血血血血液液液液血浆血浆血浆血浆水水水水 分分分分固体物质：固体物质：固体物质：固体物质：血浆蛋白、血浆蛋白、血浆蛋白、血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等血细血细血细血细 胞胞胞胞白细胞白细胞白细胞白细胞血小板血小板血小板血小板红细胞红细胞红细胞红细胞（最多）（最多）（最多）（最多）血红蛋白血红蛋白血红蛋白血红蛋白（90909090）两个两个两个两个肽链肽链肽链肽链两个两个两个两个一肽链一肽链一肽链一肽链四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团2.2.提问：提问：提问：提问：血液有哪些成份？血液有哪些成份？血液有哪些成份？血液有哪些成份？1.1.1.1.提问：提问：提问：提问：用鸡红细胞提取用鸡红细胞提取用鸡红细胞提取用鸡红细胞提取DNADNADNADNA，用猪、牛、羊红细，用猪、牛、羊红细，用猪、牛、羊红细，用猪、牛、羊红细胞提取血红蛋白原因是什么？胞提取血红蛋白原因是什么？胞提取血红蛋白原因是什么？胞提取血红蛋白原因是什么？鸡红细胞含有细胞核，含有鸡红细胞含有细胞核，含有鸡红细胞含有细胞核，含有鸡红细胞含有细胞核，含有DNADNADNADNA，便于进行，便于进行，便于进行，便于进行DNADNADNADNA提提提提取；人红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量取；人红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量取；人红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量取；人红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。丰富，便于提取血红蛋白。丰富，便于提取血红蛋白。丰富，便于提取血红蛋白。血血血血红红红红蛋白蛋白蛋白蛋白血红蛋白的提取和分离第5页血红蛋白血红蛋白血红蛋白血红蛋白两个两个两个两个肽链肽链肽链肽链两个两个两个两个一肽链一肽链一肽链一肽链四个亚铁四个亚铁四个亚铁四个亚铁血血红素基团红素基团红素基团红素基团每个肽链围绕一个每个肽链围绕一个亚铁血红素基团，亚铁血红素基团，此基团可携带此基团可携带一分子氧或一分子二一分子氧或一分子二氧化碳，氧化碳，血红蛋白因含有血红蛋白因含有血红素血红素而而呈呈红色。红色。血红蛋白特点：血红蛋白特点：血红蛋白特点：血红蛋白特点：血红蛋白的提取和分离第6页1.1.分离生物大分子基本思绪：分离生物大分子基本思绪：选取一定选取一定物理或化学物理或化学方法分离含有不一样物理方法分离含有不一样物理或化学性质或化学性质生物大分子生物大分子。2.2.蛋白质分离和提取原理：蛋白质分离和提取原理：依据蛋白质依据蛋白质各种特征各种特征差异，如差异，如分子形状和大小、分子形状和大小、所带电荷性质和多少、溶解度、吸附性质和对其它所带电荷性质和多少、溶解度、吸附性质和对其它分子亲和力分子亲和力等等，能够用来分离等等，能够用来分离不一样种类不一样种类蛋白质。蛋白质。一、血红蛋白提取和分离一、血红蛋白提取和分离3.3.高温灭菌和酒精灭菌结果：高温灭菌和酒精灭菌结果：使微生物使微生物蛋白质发生蛋白质发生变性变性、蛋白质蛋白质空间结构空间结构被破坏。被破坏。血红蛋白的提取和分离第7页（一）（一）凝胶色谱法（凝胶色谱法（分配色谱法分配色谱法）2.凝胶：大多数凝胶是由大多数凝胶是由多糖类化合物多糖类化合物（如（如葡聚糖或葡聚糖或琼脂糖琼脂糖）组成）组成多孔多孔小球体，小球体，内部有许多贯通内部有许多贯通通道通道。依据被分离物质蛋白质依据被分离物质蛋白质相对分子质量相对分子质量大大 小，利用含有小，利用含有网状结构网状结构凝胶，来进行分离。凝胶，来进行分离。1.概念：3.凝胶色谱法原理 当相对分子量不一样蛋白质经过凝胶时，相对分当相对分子量不一样蛋白质经过凝胶时，相对分子量较小蛋白质轻易进入凝胶内部通道，旅程较长，移子量较小蛋白质轻易进入凝胶内部通道，旅程较长，移动速度较慢动速度较慢;而相对分子量较大蛋白质无法进入凝胶内而相对分子量较大蛋白质无法进入凝胶内部通道，只能在凝胶外部移动，旅程较短，移动速度较部通道，只能在凝胶外部移动，旅程较短，移动速度较快。快。相对分子质量不一样蛋白质分子所以得以分离。相对分子质量不一样蛋白质分子所以得以分离。依据特征是：依据特征是：依据特征是：依据特征是：蛋白质分子量大小。蛋白质分子量大小。蛋白质分子量大小。蛋白质分子量大小。血红蛋白的提取和分离第8页4.4.凝胶色谱法分离蛋白质分离蛋白质原理和详细过程详细过程血红蛋白的提取和分离第9页凝胶色谱法分离蛋白质过程动画演示凝胶色谱法分离蛋白质过程动画演示血红蛋白的提取和分离第10页 （二）缓冲溶液（二）缓冲溶液 1.1.概念概念:在一定范围内，凡是能够抵制在一定范围内，凡是能够抵制外加少许强外加少许强酸或强碱酸或强碱影响使原来溶液影响使原来溶液PHPH值基本保持值基本保持不变混不变混合溶液。合溶液。能够抵制能够抵制外界酸和碱外界酸和碱对溶液对溶液PHPH值值影响，影响，维持维持PHPH基本不变。基本不变。2.2.作用作用:3.3.缓冲溶液配制缓冲溶液配制:通常由通常由1 12 2 种缓冲剂种缓冲剂溶解于水溶解于水中配制而成。调整缓冲剂中配制而成。调整缓冲剂使用百分比使用百分比就能够制得在就能够制得在不不一样一样PHPH范围内范围内使用缓冲液。使用缓冲液。4.4.4.4.提问：在本课题中使用缓冲液是提问：在本课题中使用缓冲液是提问：在本课题中使用缓冲液是提问：在本课题中使用缓冲液是:_:_:_:_,其目标是其目标是其目标是其目标是:利用缓冲液模拟细胞内利用缓冲液模拟细胞内PHPH环境，确保环境，确保 血红蛋白正常结构和功效，便于观察血红蛋白正常结构和功效，便于观察(红色红色红色红色)和科和科 学研究学研究(活性活性活性活性)磷酸缓冲液磷酸缓冲液血红蛋白的提取和分离第11页 缓冲溶液组成及分类缓冲溶液组成及分类弱酸及其对应盐：弱酸及其对应盐：弱碱及其对应盐：弱碱及其对应盐：多元弱酸酸式盐及其对应次级盐多元弱酸酸式盐及其对应次级盐:H H H H2 2 2 2COCOCOCO3 3 3 3NaHCONaHCONaHCONaHCO3 3 3 3；CHCHCHCH3 3 3 3COOHCHCOOHCHCOOHCHCOOHCH3 3 3 3COONaCOONaCOONaCOONaNHNHNHNH3 3 3 3HHHH2 2 2 2ONHONHONHONH4 4 4 4CL;NHCL;NHCL;NHCL;NH4 4 4 4OHNHOHNHOHNHOHNH4 4 4 4CLCLCLCLNaHCONaHCONaHCONaHCO3 3 3 3NaNaNaNa2 2 2 2COCOCOCO3 3 3 3 ；NaHNaHNaHNaH2 2 2 2POPOPOPO4 4 4 4NaNaNaNa2 2 2 2HPOHPOHPOHPO4 4 4 4 缓冲溶液由足够浓度共轭酸碱对组成。其中，缓冲溶液由足够浓度共轭酸碱对组成。其中，能反抗外来强碱称为能反抗外来强碱称为共轭酸共轭酸；能反抗外来强酸称为能反抗外来强酸称为共轭碱共轭碱。这一共轭酸碱通常称为这一共轭酸碱通常称为缓冲对、缓冲剂或缓冲系缓冲对、缓冲剂或缓冲系。常见缓冲对主要有以下三种类型：常见缓冲对主要有以下三种类型：血红蛋白的提取和分离第12页 （三）（三）电泳：电泳：1.1.概念：概念：带电粒子在电场作用下发生迁移过程。带电粒子在电场作用下发生迁移过程。2.2.原理：原理：许多主要生物大分子，如多肽、许多主要生物大分子，如多肽、核酸等都含有可解离基团，在一定核酸等都含有可解离基团，在一定PHPH下，这些基下，这些基团会带上正电或负电。团会带上正电或负电。在电场作用下，这些带在电场作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反电极移动。电分子会向着与其所带电荷相反电极移动。电电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质差异以泳利用了待分离样品中各种分子带电性质差异以及分子本身大小，形状不一样，使带电分子产生及分子本身大小，形状不一样，使带电分子产生不一样迁移速度，从而实现样品中各种分子分离不一样迁移速度，从而实现样品中各种分子分离。3.3.类型类型:琼脂糖琼脂糖凝胶电泳、凝胶电泳、聚丙稀酰胺聚丙稀酰胺凝胶电泳。凝胶电泳。血红蛋白的提取和分离第13页 在在在在电场电场电场电场作用下，作用下，作用下，作用下，这这这这些些些些带电带电带电带电分子分子分子分子会会会会向着向着向着向着与与与与其所其所其所其所带电带电带电带电荷相反荷相反荷相反荷相反电极电极电极电极移移移移动动动动琼脂糖凝胶电泳示意图琼脂糖凝胶电泳示意图琼脂糖凝胶电泳示意图琼脂糖凝胶电泳示意图血红蛋白的提取和分离第14页 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 1 1、在测定蛋白质分子量时惯用、在测定蛋白质分子量时惯用十二烷基硫酸十二烷基硫酸钠（钠（SDSSDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-N,N-亚甲基双丙亚甲基双丙烯酰胺在烯酰胺在引发剂引发剂和和催化剂催化剂作用下聚合交联成含有作用下聚合交联成含有三维网状结构凝胶。三维网状结构凝胶。N,N-亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）丙烯酰胺和交联剂丙烯酰胺和交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺交联共聚反应亚甲基双丙烯酰胺交联共聚反应血红蛋白的提取和分离第15页 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中迁移率迁移率取决取决于它所带于它所带净电荷净电荷多少以及多少以及分子大小分子大小等原因。等原因。（SDSSDSSDSSDS作用）作用）作用）作用）为了消除为了消除净电荷对迁移率影响，净电荷对迁移率影响，能够在凝胶中加入能够在凝胶中加入SDSSDS。2.2.原理：原理：SDSSDSSDSSDS能使蛋白质发生完全变性能使蛋白质发生完全变性能使蛋白质发生完全变性能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成。由几条肽链组成蛋白质复合体蛋白质复合体在在SDSSDS作用下会作用下会解聚成单条肽链解聚成单条肽链解聚成单条肽链解聚成单条肽链，所以，所以测定结果只是测定结果只是单条肽链分子量单条肽链分子量单条肽链分子量单条肽链分子量。SDSSDS能与各种蛋白质能与各种蛋白质形成形成蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质SDSSDSSDSSDS复合物复合物复合物复合物，SDSSDS所带负电荷量大大超所带负电荷量大大超出了蛋白质分子出了蛋白质分子原有电荷量原有电荷量原有电荷量原有电荷量。因而掩盖了。因而掩盖了不一样种不一样种不一样种不一样种蛋白质间电荷差异蛋白质间电荷差异蛋白质间电荷差异蛋白质间电荷差异，使电泳迁移率完全取决于分子，使电泳迁移率完全取决于分子大小。大小。3.SDS3.SDS作用机理作用机理:血红蛋白的提取和分离第16页用用SDSSDS测定蛋白质分子量方法测定蛋白质分子量方法 使用使用SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋测定蛋白质分子量时，可选取一组白质分子量时，可选取一组已知分子量标已知分子量标准蛋白准蛋白同时进行电泳，依据已知分子量标同时进行电泳，依据已知分子量标准蛋白准蛋白电泳区带位置电泳区带位置，用，用电泳迁移率和分电泳迁移率和分子量对数作标准曲线子量对数作标准曲线，能够测定，能够测定未知蛋白未知蛋白质质分子量。分子量。市场上有高分子量、次高分子市场上有高分子量、次高分子量及低分子量标准蛋白试剂出售。量及低分子量标准蛋白试剂出售。血红蛋白的提取和分离第17页 二、试验操作二、试验操作样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度判定纯度判定1.1.1.1.样品处理：样品处理：样品处理：样品处理：（一）蛋白质提取和分离步骤（一）蛋白质提取和分离步骤（二）操作过程（二）操作过程 本课题可选取猪、牛、羊或其它脊椎本课题可选取猪、牛、羊或其它脊椎 动物血液来分离血红蛋白。动物血液来分离血红蛋白。(1)(1)(1)(1)红细胞洗涤红细胞洗涤红细胞洗涤红细胞洗涤:洗涤目标洗涤目标洗涤目标洗涤目标:去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白分离纯化，洗涤次数不可过少。分离纯化，洗涤次数不可过少。洗涤操作：洗涤操作：洗涤操作：洗涤操作：1 1、采集血样。、采集血样。2 2、低速短时间离心、低速短时间离心（速（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离效果），达不到分离效果）3 3、吸收血浆：上层透明黄色血浆。、吸收血浆：上层透明黄色血浆。4 4、盐水洗涤：用五倍体积质量分数为、盐水洗涤：用五倍体积质量分数为0.90.9氯化钠溶液氯化钠溶液洗涤。洗涤。5 5、低速离心、低速离心（低速短时间）（低速短时间）6 6、重复、重复4 4、5 5步骤三步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤洁净。次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤洁净。血红蛋白的提取和分离第18页采集得到血液血红蛋白的提取和分离第19页柜式离心机血红蛋白的提取和分离第20页首次离心后结果血红蛋白的提取和分离第21页3次洗涤后结果血红蛋白的提取和分离第22页(2)(2)(2)(2)血红蛋白释放：血红蛋白释放：血红蛋白释放：血红蛋白释放：加蒸馏水到加蒸馏水到原血液体积原血液体积，再加，再加4040体积体积甲苯甲苯 ，置于，置于磁力搅拌器磁力搅拌器上充分搅拌上充分搅拌1010分钟分钟（加速细胞破裂加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。细胞破裂释放出血红蛋白。(3)(3)(3)(3)分离血红蛋白溶液：分离血红蛋白溶液：分离血红蛋白溶液：分离血红蛋白溶液：过程：过程：过程：过程：将搅拌好混合液转移到离将搅拌好混合液转移到离心管内，以心管内，以r/minr/min速度离心速度离心10 min10 min。试管中溶液层次：试管中溶液层次：试管中溶液层次：试管中溶液层次：第第1 1层（最上层）：层（最上层）：甲苯层（甲苯层（无色透明无色透明）；第）；第2 2层（中上层）层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体白色薄层固体）；）；第第3 3层（中下层）：血红蛋白水溶液层层（中下层）：血红蛋白水溶液层（红色透明液体红色透明液体）；第）；第4 4层（最下层）：层（最下层）：杂质沉淀层（杂质沉淀层（暗红色暗红色）。）。分离：分离：分离：分离：用滤用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层斗中静置片刻后，分出下层红色透明液红色透明液体体。二、试验操作二、试验操作血红蛋白的提取和分离第23页磁力搅拌器血红蛋白的提取和分离第24页搅拌器转子血红蛋白的提取和分离第25页搅拌器正在工作血红蛋白的提取和分离第26页甲苯层甲苯层甲苯层甲苯层（无色透明无色透明无色透明无色透明）白色薄层固体白色薄层固体白色薄层固体白色薄层固体红色透明液体红色透明液体红色透明液体红色透明液体杂质沉淀层杂质沉淀层杂质沉淀层杂质沉淀层（暗红色暗红色暗红色暗红色）试管中溶液层次试管中溶液层次血红蛋白的提取和分离第27页(4)(4)(4)(4)透透透透 析：析：析：析：过程：过程：过程：过程：取取1ml1ml血红蛋白溶液装入透析袋中，将透血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有析袋放入盛有300ml300ml物质量浓度为物质量浓度为20mmol/l20mmol/l磷酸缓冲磷酸缓冲液液中（中（pHpH为为7.07.0），透析），透析1212小时。小时。透析目标：透析目标：透析目标：透析目标：除去样品中分子量较小杂质。除去样品中分子量较小杂质。二、试验操作二、试验操作血红蛋白的提取和分离第28页透析过程动画演示透析过程动画演示血红蛋白的提取和分离第29页利用透析袋透析血红蛋白的提取和分离第30页2.2.凝胶色谱操作凝胶色谱操作:（1 1 1 1）凝胶色谱柱制作：）凝胶色谱柱制作：）凝胶色谱柱制作：）凝胶色谱柱制作：取长取长4040厘米，内径厘米，内径1.61.6厘米玻璃管，厘米玻璃管，两端需用砂纸磨平。两端需用砂纸磨平。底塞制作：底塞制作：打孔打孔挖出凹穴挖出凹穴安装移液管头部安装移液管头部覆盖尼龙网，覆盖尼龙网，再用再用100100目尼龙纱包好，插到玻璃管一端目尼龙纱包好，插到玻璃管一端。注意事项注意事项注意事项注意事项：底塞中底塞中插入玻璃管上部不得超出橡皮塞凹穴底面，不然难以铺实尼龙插入玻璃管上部不得超出橡皮塞凹穴底面，不然难以铺实尼龙网，还会造成液体残留，蛋白质分离不彻底。网，还会造成液体残留，蛋白质分离不彻底。顶塞制作：顶塞制作：打打孔孔安装玻璃管安装玻璃管。组装：组装：将上述三者按对应位置组装成一个将上述三者按对应位置组装成一个整体整体。安装其它从属结构。安装其它从属结构。血红蛋白的提取和分离第31页（2 2）凝胶色谱柱装填）凝胶色谱柱装填 凝胶选择：凝胶选择：凝胶选择：凝胶选择：A A、材料：、材料：交联葡聚糖凝胶（交联葡聚糖凝胶（G-G-7575）。）。B B、代表意义：、代表意义：“G”“G”表示凝胶交联程度，膨胀表示凝胶交联程度，膨胀程度及分离范围程度及分离范围。7575表示凝胶得水值，即每克凝胶膨表示凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水胀时吸水7.57.5克。克。凝胶前处理：凝胶前处理：凝胶前处理：凝胶前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成定量凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。凝胶悬浮液。凝胶色谱柱装填方法：凝胶色谱柱装填方法：凝胶色谱柱装填方法：凝胶色谱柱装填方法：A A、固定：将色谱柱装置、固定：将色谱柱装置固定在支架上。固定在支架上。B B、装填：将凝胶悬浮液一次性迟缓倒、装填：将凝胶悬浮液一次性迟缓倒入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。匀。注意：注意：1 1、凝胶装填时尽可能紧密，以降低凝胶颗、凝胶装填时尽可能紧密，以降低凝胶颗粒之间空隙。粒之间空隙。2 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质洗脱次序，降低分离效为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质洗脱次序，降低分离效果果。血红蛋白的提取和分离第32页装配好凝胶柱血红蛋白的提取和分离第33页 洗涤平衡：洗涤平衡：洗涤平衡：洗涤平衡：装填完成后，装填完成后，马上用缓冲液洗脱瓶，在马上用缓冲液洗脱瓶，在50cm50cm高操作压下，用高操作压下，用300ml20mmol/l300ml20mmol/l磷酸缓冲液磷酸缓冲液（pHpH为为7.07.0）充分洗涤平衡充分洗涤平衡1212小时小时。注意：注意：注意：注意：1 1、液面不要低、液面不要低于凝胶表面，不然可能有气泡于凝胶表面，不然可能有气泡混入，影响液体在柱内流动与混入，影响液体在柱内流动与最终生物大分子物质分离效果。最终生物大分子物质分离效果。2 2、不能发生洗脱液流干，露、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒现象出凝胶颗粒现象。（2 2）凝胶色谱柱装填）凝胶色谱柱装填50cm50cm高高高高血红蛋白的提取和分离第34页（3 3）样品加入与洗脱）样品加入与洗脱 调整缓冲液面：调整缓冲液面：调整缓冲液面：调整缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液迟缓下降打开下端出口，使柱内缓冲液迟缓下降到与凝胶面平齐，关闭出口。到与凝胶面平齐，关闭出口。滴加透析样品：滴加透析样品：滴加透析样品：滴加透析样品：吸管吸吸管吸1ml1ml样品加到色谱柱顶端，滴加样样品加到色谱柱顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁围绕移动加样，同时注意不要破坏凝品时，吸管管口贴着管壁围绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。胶面。样品渗透凝胶床：样品渗透凝胶床：样品渗透凝胶床：样品渗透凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗透凝加样后打开下端出口，使样品渗透凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。洗脱：洗脱：洗脱：洗脱：小心加入小心加入pH=7.0 20mmol/lpH=7.0 20mmol/l磷酸缓冲液到适当高度，磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。搜集：搜集：搜集：搜集：待红色蛋白质靠近色谱柱底端时，用试管搜集流待红色蛋白质靠近色谱柱底端时，用试管搜集流出液，每出液，每5ml5ml搜集一试管，连续搜集。搜集一试管，连续搜集。（在分离过程中，假如（在分离过程中，假如红色区带均匀一致移动，说明色谱柱制作成功）红色区带均匀一致移动，说明色谱柱制作成功）注意：注意：注意：注意：正确加样操作：正确加样操作：1 1、不要触及并破坏凝胶面。、不要触及并破坏凝胶面。2 2、贴壁加样。贴壁加样。3 3、使吸管管口沿管壁围绕移动。、使吸管管口沿管壁围绕移动。血红蛋白的提取和分离第35页（3 3）样品加入与洗脱）样品加入与洗脱注意：注意：注意：注意：正确加样操作是：正确加样操作是：1 1、不要触及并破坏凝胶面。、不要触及并破坏凝胶面。2 2、贴壁加样。、贴壁加样。3 3、使吸管管口沿管壁围绕移动。、使吸管管口沿管壁围绕移动。血红蛋白的提取和分离第36页开始进行层析开始进行层析血红蛋白的提取和分离第37页搜集得到纯化后蛋白血红蛋白的提取和分离第38页思索下面问题：思索下面问题：让血红蛋白处于稳定让血红蛋白处于稳定pHpH范围内，维持结构和功效。范围内，维持结构和功效。1 1 1 1、在血红蛋白整个过程中不停用磷酸缓冲液处理目标是什、在血红蛋白整个过程中不停用磷酸缓冲液处理目标是什、在血红蛋白整个过程中不停用磷酸缓冲液处理目标是什、在血红蛋白整个过程中不停用磷酸缓冲液处理目标是什么？么？么？么？2 2 2 2、与其它真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对、与其它真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对、与其它真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对、与其它真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质得分离有什么意义？你进行蛋白质得分离有什么意义？你进行蛋白质得分离有什么意义？你进行蛋白质得分离有什么意义？血红蛋白是有色蛋白，所以在凝胶色谱分离时能够经过观察血红蛋白是有色蛋白，所以在凝胶色谱分离时能够经过观察颜色来判断什么时候应该搜集洗脱液。这使血红蛋白分离过程非颜色来判断什么时候应该搜集洗脱液。这使血红蛋白分离过程非常直观，大大简化了试验操作。常直观，大大简化了试验操作。3 3 3 3、你能描述血红蛋白分离完整过程吗？、你能描述血红蛋白分离完整过程吗？、你能描述血红蛋白分离完整过程吗？、你能描述血红蛋白分离完整过程吗？血红蛋白提取和分离程序可分为四大步，包含：血红蛋白提取和分离程序可分为四大步，包含：样品处理、样品处理、样品处理、样品处理、粗分离、纯化和纯度判定粗分离、纯化和纯度判定粗分离、纯化和纯度判定粗分离、纯化和纯度判定。首先经过洗涤红细胞、血红蛋白释。首先经过洗涤红细胞、血红蛋白释放、离心等操作搜集到放、离心等操作搜集到血红蛋白溶液血红蛋白溶液，即，即:样品处理；再经过样品处理；再经过透析去除分子量较小杂质，即样品粗分离；然后透析去除分子量较小杂质，即样品粗分离；然后经过凝胶色谱经过凝胶色谱经过凝胶色谱经过凝胶色谱法法法法将相对分子质量较大将相对分子质量较大杂质蛋白除去杂质蛋白除去，即，即:样品纯化；最终经样品纯化；最终经聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度判定。进行纯度判定。血红蛋白的提取和分离第39页（三）（三）SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做）聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做）2.2.2.2.试剂配制：试剂配制：试剂配制：试剂配制：判定血红蛋白纯度。判定血红蛋白纯度。1.1.1.1.目标：目标：目标：目标：3.方法步骤：（略）方法步骤：（略）血红蛋白的提取和分离第40页 观察你处理血液样品离心后观察你处理血液样品离心后是否分层是否分层（见教科书图（见教科书图5-185-18），），假如分层不显著，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白原因。假如分层不显著，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白原因。另外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同另外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净红细胞，影响后续血红蛋白提取纯度。沉淀，也得不到纯净红细胞，影响后续血红蛋白提取纯度。三、试验结果分析与评价三、试验结果分析与评价 1 1、你是否完成了对血液样品处理？你能描述处理、你是否完成了对血液样品处理？你能描述处理后样品发生了哪些改变吗？后样品发生了哪些改变吗？2 2、你装填凝胶色谱柱是否有气泡产生？你色谱柱装、你装填凝胶色谱柱是否有气泡产生？你色谱柱装填得成功吗？你是怎样判断？填得成功吗？你是怎样判断？因为凝胶是一个半透明介质，所以能够在凝胶柱旁放一支与因为凝胶是一个半透明介质，所以能够在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直日光灯，检验凝胶是否装填得均匀。另外，还能够加凝胶柱垂直日光灯，检验凝胶是否装填得均匀。另外，还能够加入大分子有色物质，入大分子有色物质，比如蓝色葡聚糖比如蓝色葡聚糖或红色葡聚糖，或红色葡聚糖，观察色带观察色带移动情况。假如色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱性能良移动情况。假如色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱性能良好。好。假如色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，假如色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。消除不了时要重新装柱。血红蛋白的提取和分离第41页 假如凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确话，假如凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确话，能清楚地看到血红蛋白红色区带均匀、狭窄、平整，伴随洗脱能清楚地看到血红蛋白红色区带均匀、狭窄、平整，伴随洗脱液迟缓流出；液迟缓流出；假如红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离效果假如红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离效果不好，这与凝胶色谱柱装填相关。不好，这与凝胶色谱柱装填相关。3 3 3 3、你能观察到蛋白质分离过程中红色区带移动吗、你能观察到蛋白质分离过程中红色区带移动吗、你能观察到蛋白质分离过程中红色区带移动吗、你能观察到蛋白质分离过程中红色区带移动吗？请描述红色区带移动情况，并据此判断分离效果？请描述红色区带移动情况，并据此判断分离效果？请描述红色区带移动情况，并据此判断分离效果？请描述红色区带移动情况，并据此判断分离效果？血红蛋白的提取和分离第42页（三）（三）SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳2.2.2.2.试剂配制：试剂配制：试剂配制：试剂配制：判定血红蛋白纯度。判定血红蛋白纯度。1.1.1.1.目标：目标：目标：目标：丙烯酰胺和丙烯酰胺和丙烯酰胺和丙烯酰胺和N,N-N,N-N,N-N,N-亚甲基双丙烯酰胺亚甲基双丙烯酰胺亚甲基双丙烯酰胺亚甲基双丙烯酰胺:用去离子水配制用去离子水配制29%29%（29 g/100 mL29 g/100 mL，下同）丙烯酰胺和，下同）丙烯酰胺和1%N,N-1%N,N-亚甲基双丙烯酰亚甲基双丙烯酰胺贮存液。胺贮存液。十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDSSDSSDSSDS）:用去离子水配成用去离子水配成10%10%贮存贮存液，于室温保留。液，于室温保留。用于制备分离胶和浓缩胶用于制备分离胶和浓缩胶用于制备分离胶和浓缩胶用于制备分离胶和浓缩胶TrisTrisTrisTris缓冲液。缓冲液。缓冲液。缓冲液。TEMED TEMED TEMED TEMED：作用经过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与作用经过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺聚合。双丙烯酰胺聚合。用去离子水配制用去离子水配制用去离子水配制用去离子水配制10%10%10%10%过硫酸铵：过硫酸铵：过硫酸铵：过硫酸铵：作用是提供作用是提供驱动丙烯酰胺和双驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需自由基。此溶液须配制丙烯酰胺聚合所必需自由基。此溶液须配制新鲜液。新鲜液。TrisTrisTrisTris甘氨酸电泳缓冲液：甘氨酸电泳缓冲液：甘氨酸电泳缓冲液：甘氨酸电泳缓冲液：25 mmol/L Tris25 mmol/L Tris，250 250 mmol/L mmol/L 甘氨酸甘氨酸(pH 8.3)(pH 8.3)，0.1%SDS0.1%SDS。样品处理液：样品处理液：样品处理液：样品处理液：50 50 mmol/L TrisHCl(pH 6.8)mmol/L TrisHCl(pH 6.8)，100 mmol/L DTT(100 mmol/L DTT(巯基苏糖醇巯基苏糖醇)或用或用5%5%巯基乙醇，巯基乙醇，2%SDS2%SDS，0.1%0.1%溴酚蓝，溴酚蓝，10%10%甘油。甘油。染色液：染色液：染色液：染色液：0.1%0.1%考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250R250，40%40%甲醇，甲醇，10%10%冰醋酸。冰醋酸。脱色液：脱色液：脱色液：脱色液：10%10%甲甲醇和醇和10%10%冰醋酸。冰醋酸。血红蛋白的提取和分离第43页 1 1、因为制备凝胶丙烯酰胺和双丙烯酰胺含、因为制备凝胶丙烯酰胺和双丙烯酰胺含有很强神经毒性，而且轻易被皮肤吸收，所以有很强神经毒性，而且轻易被皮肤吸收，所以操作必须在通风橱内或通风处进行。操作必须在通风橱内或通风处进行。2 2、TEMEDTEMED和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组织、眼睛、皮肤等有很大破坏作用，吞服可致织、眼睛、皮肤等有很大破坏作用，吞服可致命。命。3 3、在进行电泳操作时一定按照试验要求和、在进行电泳操作时一定按照试验要求和步骤完成。操作时要戴好一次性手套。步骤完成。操作时要戴好一次性手套。注意事项：注意事项：（三）（三）SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳血红蛋白的提取和分离第44页 SDS-SDS-SDS-SDS-聚丙烯酰胺分离胶制备：聚丙烯酰胺分离胶制备：聚丙烯酰胺分离胶制备：聚丙烯酰胺分离胶制备：用去离子水用去离子水用去离子水用去离子水4.6 mL4.6 mL4.6 mL4.6 mL，30%30%30%30%丙丙丙丙烯酰胺烯酰胺烯酰胺烯酰胺2.7 mL2.7 mL2.7 mL2.7 mL，1.5mol1.5mol1.5mol1.5mol、pH 8.8TrispH 8.8TrispH 8.8TrispH 8.8Tris缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液2.5 mL2.5 mL2.5 mL2.5 mL，10%SDS 0.1 10%SDS 0.1 10%SDS 0.1 10%SDS 0.1 mLmLmLmL，10%10%10%10%过硫酸胺过硫酸胺过硫酸胺过硫酸胺0.1 mL0.1 mL0.1 mL0.1 mL，TEMED 0.006mLTEMED 0.006mLTEMED 0.006mLTEMED 0.006mL，混合均匀，快速灌注，混合均匀，快速灌注，混合均匀，快速灌注，混合均匀，快速灌注在两玻璃板间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间在两玻璃板间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间在两玻璃板间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间在两玻璃板间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间(梳子齿长再梳子齿长再梳子齿长再梳子齿长再加加加加0.5 cm)0.5 cm)0.5 cm)0.5 cm)，再在胶液面上小心注入一层水（约高，再在胶液面上小心注入一层水（约高，再在胶液面上小心注入一层水（约高，再在胶液面上小心注入一层水（约高23 mm23 mm23 mm23 mm），以），以），以），以阻止氧气进入凝胶溶液。阻止氧气进入凝胶溶液。阻止氧气进入凝胶溶液。阻止氧气进入凝胶溶液。分离胶聚合完全后（约分离胶聚合完全后（约分离胶聚合完全后（约分离胶聚合完全后（约30 min30 min30 min30 min），倾），倾），倾），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。配制配制配制配制SDSSDSSDSSDS聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液用去离子水胶电泳浓缩胶溶液用去离子水胶电泳浓缩胶溶液用去离子水胶电泳浓缩胶溶液用去离子水2.7 mL2.7 mL2.7 mL2.7 mL，30%30%30%30%丙烯酰胺丙烯酰胺丙烯酰胺丙烯酰胺0.67 mL0.67 mL0.67 mL0.67 mL，1.0 mol1.0 mol1.0 mol1.0 mol、pH 6.8TrispH 6.8TrispH 6.8TrispH 6.8Tris缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液0.5 mL0.5 mL0.5 mL0.5 mL，10%SDS0.041 mL10%SDS0.041 mL10%SDS0.041 mL10%SDS0.041 mL，10%10%10%10%过硫过硫过硫过硫酸胺酸胺酸胺酸胺0.04 mL0.04 mL0.04 mL0.04 mL，TEMED 0.004 mLTEMED 0.004 mLTEMED 0.004 mLTEMED 0.004 mL，混合均匀，直接灌注在聚合分，混合均匀，直接灌注在聚合分，混合均匀，直接灌注在聚合分，混合均匀，直接灌注在聚合分离胶上，并马上在浓缩胶溶液中插入洁净梳子。离胶上，并马上在浓缩胶溶液中插入洁净梳子。离胶上，并马上在浓缩胶溶液中插入洁净梳子。离胶上，并马上在浓缩胶溶液中插入洁净梳子。整个操作过程应整个操作过程应整个操作过程应整个操作过程应注意防止气泡产生。然后再补加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间注意防止气泡产生。然后再补加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间注意防止气泡产生。然后再补加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间注意防止气泡产生。然后再补加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚合。空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚合。空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚合。空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚合。（1 1 1 1）依据厂家说明书安装电泳用玻璃板）依据厂家说明书安装电泳