遗传工程动物专家讲座.pptx

遗传工程动物 管敏强管敏强试验动物中心试验动物中心 遗传工程动物第1页主主 要要 内内 容容第一第一 转基因动物转基因动物第二第二 基因敲除动物基因敲除动物遗传工程动物第2页 一一.转基因动物转基因动物（transgenic animals）遗传工程动物第3页一.概述概述概念概念:指用人工方法将外源基因导入或整指用人工方法将外源基因导入或整合到基因组内，并能稳定传代一类动物。合到基因组内，并能稳定传代一类动物。特点：分子及细胞水平操作，组织和整体特点：分子及细胞水平操作，组织和整体水平表示。水平表示。目标：培育新种，获取人类所需生物产品，目标：培育新种，获取人类所需生物产品，或进行基因功效研究。或进行基因功效研究。遗传工程动物第4页转基因动物研究大事记1.1.追溯追溯2020世纪世纪6060年代末和年代末和7070年代初就有些人向蛙卵年代初就有些人向蛙卵和小鼠胚胎注射和小鼠胚胎注射mRNAmRNA，研究，研究mRNAmRNA能不能在动物卵能不能在动物卵细胞和早期胚胎中翻译。细胞和早期胚胎中翻译。2.19742.1974年，年，JaenischJaenisch和和MintzMintz首次报道应用显微首次报道应用显微注射法取得注射法取得SVSV4040DNADNA转基因小鼠。转基因小鼠。3.19823.1982年年PalmiterPalmiter成功取得了含金属巯基成功取得了含金属巯基(MTI)(MTI)基基因开启子与大鼠生长基因融合基因转基因小鼠。因开启子与大鼠生长基因融合基因转基因小鼠。体重远大于正常对照，被称为体重远大于正常对照，被称为“超级小鼠超级小鼠”(Supermice)(Supermice)。4.19874.1987年，世界上第一只商业化转基因绵羊在英国年，世界上第一只商业化转基因绵羊在英国著名罗斯林研究所诞生。这只转基因母羊乳汁中著名罗斯林研究所诞生。这只转基因母羊乳汁中能够分泌能够分泌抗胰蛋白酶。抗胰蛋白酶。遗传工程动物第5页1989年，意大利学者用精子作为载体，成功地取年，意大利学者用精子作为载体，成功地取得了纯系转基因小鼠。得了纯系转基因小鼠。1997年年2月，英国罗斯林研究所维尔穆特博士科月，英国罗斯林研究所维尔穆特博士科研组公布体细胞研组公布体细胞克隆羊克隆羊“多利多利”培育成功。培育成功。1997年年10月，英国罗斯林研究所宣告已克隆出月，英国罗斯林研究所宣告已克隆出3只携带有些人凝血因子只携带有些人凝血因子基因转染绵羊。基因转染绵羊。1999年年2月，上海遗传研究所宣告月，上海遗传研究所宣告转基因试管牛转基因试管牛“滔滔滔滔”诞生，其体内被检测到带有些人血清白诞生，其体内被检测到带有些人血清白蛋白基因，这项结果被评为当年蛋白基因，这项结果被评为当年“中国十大科技中国十大科技进展进展”之一。之一。年年6月月22日晚日晚8时整，生物胚胎工程教授张涌教授时整，生物胚胎工程教授张涌教授在西北农林科技大学种羊场顺利接生了一只在西北农林科技大学种羊场顺利接生了一只雌性雌性体细胞克隆山羊阳阳体细胞克隆山羊阳阳。年英国PPL 企业宣告取得世界首例转基因克隆猪诞生。遗传工程动物第6页转基因超级鼠转基因超级鼠转基因超级鼠转基因超级鼠1982年，英国自然杂志发表了一篇文章：有两个美国试验小组年，英国自然杂志发表了一篇文章：有两个美国试验小组利用转基因技术，将大鼠生长激素重组基因导入到小鼠受精卵中利用转基因技术，将大鼠生长激素重组基因导入到小鼠受精卵中,培育出具快速生长期有效应培育出具快速生长期有效应“转基因超级鼠转基因超级鼠”。转基因鼠比与它同。转基因鼠比与它同胎所生小鼠生长速度快胎所生小鼠生长速度快23倍，体积大一倍。倍，体积大一倍。遗传工程动物第7页Supermice遗传工程动物第8页上海医学遗传研究所宣告：取名为“滔滔”我国首例转基因试管牛于1999年2月19日在上海市奉贤县奉新动物试验场诞生，出生时体重38千克，经检测它携带有些人血清白蛋白基因。这是继去年成功地培育出在乳汁中含有些人凝血因子IX转基因山羊后，该所取得又一项重大科研结果。遗传工程动物第9页年6月，张涌教授培育成功世界首批体细胞克隆山羊“元元”、“阳阳”。图为利用体细胞克隆山羊“阳阳”（左）和它克隆体山羊。遗传工程动物第10页.12.头口、蹄及舌头展现出绿色荧光转基因克隆小猪日前在东北农业大学顺利降生。这是中国培育出首例绿色荧光转基因猪，也是世界上第四例经过体细胞核移植技术培育该类转基因猪。遗传工程动物第11页二、转基因动物基本程序二、转基因动物基本程序(一）待转移目标基因取得与设计一）待转移目标基因取得与设计(二二)动物遗传背景及种系选择动物遗传背景及种系选择在进行转基因动物研究时要考虑遗传背景及种问在进行转基因动物研究时要考虑遗传背景及种问题。题。(三三)惯用细胞惯用细胞1）受精卵：受精卵）受精卵：受精卵基因操作基因操作注射假孕动注射假孕动物子宫物子宫胚胎胚胎个体。个体。2）胚胎干细胞胚胎干细胞：从着床前动物胚胎中分离多：从着床前动物胚胎中分离多功效胚胎干细胞功效胚胎干细胞基因操作基因操作注射入动物囊注射入动物囊胚胚形成嵌合体胚胎形成嵌合体胚胎嵌合个体。嵌合个体。(四四)外源基因导入方法外源基因导入方法(五五)转基因动物中外源基因检测和转基因动物中外源基因检测和传代传代遗传工程动物第12页(一）待转移目标基因取得与设计一）待转移目标基因取得与设计遗传工程动物第13页1、目标基因起源、目标基因起源采取限制性内切酶，从生物组织中获取目标基因；采取限制性内切酶，从生物组织中获取目标基因；经过经过mRNA合成合成cDNA；人工合成人工合成DNA片段；片段；聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）扩增特定基因片段。）扩增特定基因片段。遗传工程动物第14页2、目标基因克隆、目标基因克隆经过载体在适当宿主中克隆经过载体在适当宿主中克隆选择载体目标基因与载体连接重组体导入受体细胞经过经过PCR反应克隆目标基因反应克隆目标基因遗传工程动物第15页3、基因构建 当代转基因技术中“基因”不是仅仅是目标蛋白编码序列(coding sequence)DNA片断，而是包含基因表示一整套顺式作用元件(cis-acting elements)。遗传工程动物第16页、开启子（promotor）开启子位于基因转录起始位点上游不远处，往往含有TATA框以及一些短调控序列，也有一些开启子不含TATA框而还有Inr序列。开启子序列是构建转基因表示载体时首先要具备生物元件。遗传工程动物第17页组织特异性开启子(tissue-specific)在动物体中，除了那些担负基本生命功效持家基因(House-keeping gene)以外，绝大多数基因呈组织特异性表示。要使转入外源基因在特定组织中表示，就要使用组织特异性开启子。遗传工程动物第18页对大多数基因来讲，我们还只能分离它近5端开启子。及近5端和近3端增强子，有时还要将一个或几个内含子包含在内，即便如此，往往还是不能到达完全组织特异性.得到组织特异性表示开启子开启子表示组织CMV各种组织WAP乳腺-Lactoglobulin乳腺Albumin enhancer肝脏 myosin heavy chain心脏遗传工程动物第19页、增强子（enhancer）真核基因表示除了受位于转录起始位点附近DNA序列调控外，还要受到距离很远一类调控序列调控。这类序列叫做增强子，其本身不含有开启子功效，但能够使开启子转录活性提升数百倍。遗传工程动物第20页、目标基因 目标基因序列应该包含最少一个开放阅读框（ORF），即含有起始密码子和终止密码子一段基因序列。以往构件目标基因时普通使用基因文库中cDNA序列，但实践证实仅仅有cDNA序列往往难以得到有效表示，最少一个内含子与cDNA序列结合会使基因得到更加好表示。遗传工程动物第21页、汇报基因（reporter gene）或标识基因惯用汇报基因有-半乳糖苷酶(lacZ)、大肠杆菌氯霉素乙酰基转移酶CAT(chloramphenicol acetyltransferase gene)、萤火虫荧光素酶基因（firefly luciferase gene）、绿色荧光蛋白基因（GFP）和人生长激素基因（hGH）等。这些汇报基因都能产生各自特有化学或发光反应，使对结果观察变得简单明了。遗传工程动物第22页、多聚腺苷酸化信号 真核生物mRNA在完成转录后，其3、端要经历深入修饰，其间相当一段原始转录物被切掉，并在结尾之处装上可多达200个腺苷酸残基。遗传工程动物第23页(二二)动物遗传背景及种系选择动物遗传背景及种系选择 在进行转基因动物研究时要考虑遗在进行转基因动物研究时要考虑遗传背景及传背景及 种系问题种系问题遗传工程动物第24页遗传工程动物第25页遗传工程动物第26页（三）（三）外源基因导入受精卵或胚胎细胞惯用方法外源基因导入受精卵或胚胎细胞惯用方法u显微注射法显微注射法u逆转录病毒感染法逆转录病毒感染法u胚胎干细胞法胚胎干细胞法u精子载体导入法u细胞核移植法细胞核移植法u生殖细胞转染法生殖细胞转染法遗传工程动物第27页（一）、显微注射法（一）、显微注射法1.目标基因制备与纯化目标基因制备与纯化2.卵供体母鼠和假孕母鼠卵供体母鼠和假孕母鼠准备准备3.超排卵与取卵超排卵与取卵4.基因显微注射基因显微注射5.受精卵移植受精卵移植6.目标基因表示整合判定目标基因表示整合判定和检测和检测7.建系建系遗传工程动物第28页遗传工程动物第29页遗传工程动物第30页遗传工程动物第31页遗传工程动物第32页遗传工程动物第33页优点：优点：转基因范围广，转移基因大，可达数百kb；且转基因不含任何 病毒基因组片段，绝对安全。缺点：缺点：缺点：缺点：整合机制不明确，无规律随机整合，多拷贝整合造成转基因不 表示；整合位点随机会造成转动物基因组重排、突变、易位缺 失等；需显微操作仪，技术性要求强。显微注射法显微注射法遗传工程动物第34页(二二)逆转录病毒介导法逆转录病毒介导法遗传工程动物第35页遗传工程动物第36页逆转录病毒结构逆转录病毒结构LTR:Long terminate repeat 1 1、逆转录病毒法制备转基因动物、逆转录病毒法制备转基因动物、逆转录病毒法制备转基因动物、逆转录病毒法制备转基因动物目标基因插入区域遗传工程动物第37页逆转录病毒法基本步骤构建病毒载体构建病毒载体转染包装细胞转染包装细胞搜集病毒颗粒搜集病毒颗粒感染受精卵感染受精卵胚胎移植胚胎移植表示gag,pol,env 细胞遗传工程动物第38页逆转录病毒法制备转基因动物优缺点逆转录病毒法制备转基因动物优缺点 优点优点转基因效率高转基因效率高单位点、单拷贝整合，易分析插入位点单位点、单拷贝整合，易分析插入位点鸡卵等含卵黄多受精卵适宜鸡卵等含卵黄多受精卵适宜 缺点缺点随机整合随机整合携带外源携带外源DNADNA片段大小受限，普通小于片段大小受限，普通小于10kb10kb易产生嵌合体（易产生嵌合体（mosaic)mosaic)，试验周期长，试验周期长有安全隐患，有可能因有安全隐患，有可能因DNADNA重组产生活病毒。重组产生活病毒。遗传工程动物第39页（三）（三）.胚胎干细胞胚胎干细胞法法这种方法首先是用外源基因转化胚胎干细胞，这种方法首先是用外源基因转化胚胎干细胞，经过筛选，经过筛选，把阳性细胞注人受体动物囊胚腔中，把阳性细胞注人受体动物囊胚腔中，生产嵌合体动物，当胚胎干细胞分化为生殖干生产嵌合体动物，当胚胎干细胞分化为生殖干细胞时外源基因可经过生殖细胞遗传给后代，细胞时外源基因可经过生殖细胞遗传给后代，在第二代取得转基因动物。这种方法可对阳性在第二代取得转基因动物。这种方法可对阳性细胞进行选择，实现外源细胞进行选择，实现外源DNA定点整合。定点整合。遗传工程动物第40页利用胚胎干细胞法制备转基因小鼠过程利用胚胎干细胞法制备转基因小鼠过程1.分离培养分离培养ES细胞。细胞。2.ES细胞基因操作。细胞基因操作。3.获取囊胚期胚胎，以作为获取囊胚期胚胎，以作为ES细细胞移植受体。胞移植受体。4.经过显微操作将经过显微操作将ES细胞注射到细胞注射到囊胚期胚胎囊胚腔内，形成嵌合囊胚期胚胎囊胚腔内，形成嵌合体。体。5.将注射过将注射过ES细胞胚胎，移植到细胞胚胎，移植到交配后交配后3d假孕母鼠子宫内，培育假孕母鼠子宫内，培育出转基因小鼠。出转基因小鼠。遗传工程动物第41页优点：基因转移效率大大提升，且能进行定位基因转移。缺点：需要多代才能得到纯合转基因动物，这对喂养成本高，产 仔数较少大型哺乳类动物来说，要取得转基因动物是一件 需要大量资金投入事情。遗传工程动物第42页四四.精子载体法精子载体法它是利用哺乳动物获能精子能结合外源它是利用哺乳动物获能精子能结合外源DNADNA特征，经过受精过程把外源特征，经过受精过程把外源DNADNA导入受精卵，取导入受精卵，取得转基因动物。它优点是方法简单，转基因效率得转基因动物。它优点是方法简单，转基因效率高。缺点是效果不稳定，外源高。缺点是效果不稳定，外源DNADNA分子可能会受分子可能会受到受精液中内切酶作用而影响整合后功效。到受精液中内切酶作用而影响整合后功效。遗传工程动物第43页精子载体法是精子载体法是精子和外源精子和外源DNA混合培养时，外混合培养时，外源源DNA可直接进可直接进入精子头部，经入精子头部，经过受精将外源基过受精将外源基因引入动物细胞因引入动物细胞中。中。外源DNA导入精细胞方法有DNA与精子共育法、电穿孔导入法、脂质体转染法。遗传工程动物第44页（五）细胞核移植法（五）细胞核移植法 这种方法是伴随哺乳动物体细胞核移植技术这种方法是伴随哺乳动物体细胞核移植技术发展而建立。首先用外源发展而建立。首先用外源DNADNA对培养体细胞或胚对培养体细胞或胚胎干细胞进行转染，然后选择阳性细胞作供体，胎干细胞进行转染，然后选择阳性细胞作供体，经过细胞核移植，取得基因动物。这种方法是非经过细胞核移植，取得基因动物。这种方法是非常理想转基因伎俩，因为它可与基因打靶技术结常理想转基因伎俩，因为它可与基因打靶技术结合，实现外源基因定点整合，消除外源合，实现外源基因定点整合，消除外源DNADNA随机随机整合带来负作用。这种方法转基因效率可达整合带来负作用。这种方法转基因效率可达100%100%，大大降低转基因家畜生产成本。不过，这种方，大大降低转基因家畜生产成本。不过，这种方法广泛应用还依赖于体细胞克隆技术发展，当前法广泛应用还依赖于体细胞克隆技术发展，当前还难以实现。还难以实现。遗传工程动物第45页遗传工程动物第46页（六）生殖细胞转染法（六）生殖细胞转染法遗传工程动物第47页遗传工程动物第48页遗传工程动物第49页四、外源DNA整合、转录及表示分子检测1）外源基因整合检测）外源基因整合检测:检测动物基因组中是否携检测动物基因组中是否携检测动物基因组中是否携检测动物基因组中是否携带外源带外源带外源带外源DNADNA。方法是先扩增目标基因，再经过电泳。方法是先扩增目标基因，再经过电泳。方法是先扩增目标基因，再经过电泳。方法是先扩增目标基因，再经过电泳检测是否含有目标基因，最终用检测是否含有目标基因，最终用检测是否含有目标基因，最终用检测是否含有目标基因，最终用SouthernSouthern杂交检测杂交检测杂交检测杂交检测PCRPCR阳性个体是否含目标基因。阳性个体是否含目标基因。阳性个体是否含目标基因。阳性个体是否含目标基因。2）外源基因转录检测：）外源基因转录检测：用用用用NorthernNorthern杂交法检测杂交法检测杂交法检测杂交法检测转基因动物某一组织转基因动物某一组织转基因动物某一组织转基因动物某一组织mRNAmRNA进行分析检测，出现阳进行分析检测，出现阳进行分析检测，出现阳进行分析检测，出现阳性表明外源基因含有转录活性。性表明外源基因含有转录活性。性表明外源基因含有转录活性。性表明外源基因含有转录活性。3）外源基因表示检测：）外源基因表示检测：转基因动物组织中是否转基因动物组织中是否转基因动物组织中是否转基因动物组织中是否含有目标基因编码外源蛋白质。惯用酶联免疫法、含有目标基因编码外源蛋白质。惯用酶联免疫法、含有目标基因编码外源蛋白质。惯用酶联免疫法、含有目标基因编码外源蛋白质。惯用酶联免疫法、免疫荧光法和免疫荧光法和免疫荧光法和免疫荧光法和WesternWestern杂交法。杂交法。杂交法。杂交法。遗传工程动物第50页4.4.基因动物品系或品种建立基因动物品系或品种建立 第一代转基因动物是半合子转基因动物，因第一代转基因动物是半合子转基因动物，因为外源基因仅在一条染色体上稳定整合。只有经为外源基因仅在一条染色体上稳定整合。只有经过选种选配，将两个半合子转基因动物成功交配，过选种选配，将两个半合子转基因动物成功交配，才能得到纯合子转基因动物，建立转基因动物家才能得到纯合子转基因动物，建立转基因动物家系，外源系，外源DNADNA才能在后代中稳定遗传才能在后代中稳定遗传 遗传工程动物第51页纯系转基因动物培育 Founder小鼠正常小鼠 F1阳性小鼠（AO）F1阳性小鼠（AV）正常小鼠近亲繁殖以得到纯合小鼠近亲繁殖以得到纯合小鼠F2阳性小鼠（AO）F2（AO）F2（AO）F3（1/4AA，1/2AO，1/4OO）F3（AA）F3（AA）纯合子小鼠交配得到稳定品系纯合子小鼠交配得到稳定品系F4（AA）遗传工程动物第52页G0代编号检测（3周龄）PCRSouthern遗传工程动物第53页G0G0代代整合检测整合检测-：弃去：弃去+：保留：保留 X X 野生型野生型G1G1代代-：弃去：弃去+：半合子：半合子 X X 半合子半合子-：弃去：弃去+：纯合子：纯合子G2G2代代表型检测表型检测founder鼠互交遗传工程动物第54页五五.转入基因整合和表示转入基因整合和表示外源基因进入细胞后命运外源基因进入细胞后命运整合到染色体内整合到染色体内随机整合随机整合定点整合定点整合游离在细胞浆内暂态表示游离在细胞浆内暂态表示在核酸酶作用下降解在核酸酶作用下降解遗传工程动物第55页随机整合（随机整合（Randominsertion）外源基因随机插入到染色体任意部位。外源基因随机插入到染色体任意部位。插入到致死基因序列内：胚胎死亡插入到致死基因序列内：胚胎死亡插入到功效基因序列内：基因失活插入到功效基因序列内：基因失活插入到某调控区作用范围：插入到某调控区作用范围：外源基因表示增外源基因表示增强强/减弱减弱遗传工程动物第56页转基因整合和表示特征 1-100拷贝左右外源基因以头尾相连成串方式整合到小鼠染色体上;外源基因整合绝大部分是随机整合;转入基因整合是稳定，一部分按孟德尔方式遗传给后代，还有一部分为嵌合体 转基因表示强弱与整合拷贝数无关，而与“位置效应”相关;遗传工程动物第57页转基因特异性表示能够只在一个类型细胞中或少数几个不一样类型细胞中，也能够在许多类型细胞中表示;转基因构件中原核生物序列可能会抑制一些基因表示;没有内含子cDNA基因表示比基因组DNA基因表示要弱得多;少数转基因位点两侧序列有重排现象。遗传工程动物第58页提升转基因表示策略1.导入大片段（LCR序列）2.共整合和基因搭救 这可能是一个很有用策略，即将表示水平较高基因与另外一些表示水平低基因一同整合进宿主细胞基因组中(同一位点串联整合)，这么处理对增强表示水平低基因构件表示含有显著作用。3.增添基质附着区 核基质附着区(MAR)可能是结构基因界域，它将染色质分成许多可独立调控单元。构件太大MARLCR转基因构件不受位置效应表示遗传工程动物第59页六、哺乳动物转基因技术研究意义六、哺乳动物转基因技术研究意义在基础生物学中在基础生物学中在基础生物学中在基础生物学中在基础医学研究中在基础医学研究中在基础医学研究中在基础医学研究中在畜牧业中在畜牧业中在畜牧业中在畜牧业中研究真核细胞基因转录、表示和调控规律以及个体发育分子调控规律。遗传疾病DNA被克隆后，经过转基因技术制备动物疾病模型，可研究遗传疾病发生、发展规律和治疗方案 选择。生长激素或促生长因子基因加紧生长速度，提升饲料酬劳；病毒衣壳基因提升疾病抵抗力；药用蛋白或营养蛋白与组织特异性表示调控元件偶联，用于家畜造血系统或泌乳系统生产 药用蛋白或营养蛋白，提升畜牧业经济效益；转基因猪器官作为人类器官移植供体，处理器官移植过程中供体相对不足问题。遗传工程动物第60页肿瘤转基因小鼠模型肿瘤转基因小鼠模型SV40T小鼠肿瘤模型建立猿猴病毒小鼠肿瘤模型建立猿猴病毒SV40作为作为一个致瘤一个致瘤DNA肿瘤病毒被广泛证实可引发物肿瘤病毒被广泛证实可引发物各种肿瘤形成各种肿瘤形成，其致瘤作用主要经过其早期，其致瘤作用主要经过其早期区域基因编码产物大区域基因编码产物大T抗原实现。抗原实现。SV40T影影响细胞周期调控蛋白响细胞周期调控蛋白P53功效；功效；SV40T与肿与肿瘤抑制蛋白瘤抑制蛋白RB，使其丧失功效，使其丧失功效。另外还与各。另外还与各种转录因子和细胞周期调控蛋白作用，致使细种转录因子和细胞周期调控蛋白作用，致使细胞分裂加速，形成肿瘤，是致癌机理研究较为胞分裂加速，形成肿瘤，是致癌机理研究较为透彻一个蛋白。透彻一个蛋白。遗传工程动物第61页脑癌胰腺癌遗传工程动物第62页1987年，美国NIH科学家首次在小鼠奶中生产出一个医用蛋白质tPA,展示了用动物乳腺生产高附加值产品可能性。遗传工程动物第63页转基因生物反应器转基因生物反应器 定义：定义：将目标基因导入动物将目标基因导入动物体内形成转基因生物，因为基体内形成转基因生物，因为基因表示，能够从转基因动物特因表示，能够从转基因动物特定组织或器官（乳汁、血液等）定组织或器官（乳汁、血液等）取得目标基因产物。使转基因取得目标基因产物。使转基因动物象一个活发酵罐一样来生动物象一个活发酵罐一样来生产目标基因产物。产目标基因产物。步骤（图）步骤（图）：采取上述方：采取上述方法取得转基因羊，可从羊奶中法取得转基因羊，可从羊奶中提取出治疗心脏病药品提取出治疗心脏病药品tPA（组（组织溶解酶原激活剂）。织溶解酶原激活剂）。遗传工程动物第64页遗传工程动物第65页十大神奇转基因动物 这些五彩斑斓脑细胞是单个神经元，鲜艳色彩帮助科学家将它们区分开来。哈佛大学杰夫-里奇曼为首科研小组在试验鼠基因组中导入水母绿色荧光蛋白基因，使其在紫色光线照射下展现出绿色荧光。这种绿色荧光基因对小鼠无害，只起到标识作用。荧光鼠遗传工程动物第66页七.转基因动物存在问题发展趋势 1.转基因动物成功率和成活率极低2.难以控制转基因在宿主基因组中行为3.大部分转基因表示水平极低，而极少部分转基因表示水平过高4.阳性转基因动物筛选不易遗传工程动物第67页八八.转基因动物安全性问题转基因动物安全性问题外源基因插入可能对宿主动物本身有影响,造成基因污染对生态平衡以及物种多样性造成不良影响;转基因移植可能加大“人畜共患病”传输机会,给人类带来灾难性损坏;转基因动物制品安全性也是值得慎重一个步骤,因为它有可能造成过敏等反应;转基因动物研究将造成一场社会伦理大讨论。遗传工程动物第68页小小 结结转基因技术是在基因重组基础上建立新多转基因技术是在基因重组基础上建立新多细胞真核生物方法。这是一个含有重大意细胞真核生物方法。这是一个含有重大意义革命性突破。它为我们培育新物种提供义革命性突破。它为我们培育新物种提供了新思绪，为我们研究基因功效，研究疾了新思绪，为我们研究基因功效，研究疾病发生机理提供了有力伎俩病发生机理提供了有力伎俩.遗传工程动物第69页 二.基因敲除动物 (gene knock out animals)遗传工程动物第70页 什么是基因敲除技术？什么是基因敲除技术？遗传工程动物第71页1987-89年年 Martin Evans，Oliver Smithies 和 Mario Capecch 领导几个研究小组首次对胚胎干细胞中特定目标基因进行失活，培育出了第一只基因敲除小鼠。到当前为止，已经培育出上千种基因敲除小鼠。遗传工程动物第72页遗传工程动物第73页三种技术融合遗传工程动物第74页二、基因敲除基本程序二、基因敲除基本程序1、构建打靶载体、构建打靶载体1）同源序列）同源序列2）打靶载体常含两种筛选标志打靶载体常含两种筛选标志neor：新霉素抗性基因，阳性筛选标志，：新霉素抗性基因，阳性筛选标志，neor基因插入用于打靶外源基因插入用于打靶外源DNA中，当中，当重组后，细胞能在含新霉素培养基中生重组后，细胞能在含新霉素培养基中生长。长。neorHSV-tk遗传工程动物第75页HSV-tk(更昔洛韦更昔洛韦)：单纯疱疹病毒胸腺嘧啶单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶基因，阴性筛选标志，激酶基因，阴性筛选标志，该基因产物可该基因产物可分解单核苷酸类似物而生成毒性产物，产分解单核苷酸类似物而生成毒性产物，产生自杀效果。生自杀效果。HSV-tk基因插入外源基因外侧载体序基因插入外源基因外侧载体序列中。同源重组时，列中。同源重组时，Tk-基因往往丢失；随基因往往丢失；随机整合时，机整合时，Tk-基因连同打靶载体整合到核基因连同打靶载体整合到核基因组上，而同时取得基因组上，而同时取得neo和和HSV-tk两个两个基因打靶细胞。基因打靶细胞。遗传工程动物第76页开启子开启子HSV-TK同源序列同源序列同源序列同源序列Neo遗传工程动物第77页2、将载体导入将载体导入ES细胞细胞选取发育第选取发育第4-5天胚胎干细胞天胚胎干细胞(ES)。把外来基因转入胚胎干细胞。把外来基因转入胚胎干细胞。并筛选打靶成功细胞。并筛选打靶成功细胞。遗传工程动物第78页随机整合随机整合同源重组同源重组遗传工程动物第79页3、将基因敲除、将基因敲除ES细胞注射入胚泡，形成嵌细胞注射入胚泡，形成嵌合胚胎。合胚胎。4、将、将10-20个胚泡植入假孕小鼠子宫。个胚泡植入假孕小鼠子宫。5、取得子代小鼠，筛选带有靶基因小鼠。、取得子代小鼠，筛选带有靶基因小鼠。常有方法有：常有方法有：Southern印记、印记、Northern印印记记把胚胎注入把胚胎注入假孕小鼠假孕小鼠Southern印记印记把细胞注入胚泡把细胞注入胚泡遗传工程动物第80页6、杂合小鼠（、杂合小鼠（+/-）间杂交，取得子二代）间杂交，取得子二代小鼠（小鼠（+/+、-/-、+/-）。）。7、筛选、筛选-/-、+/-子二代小鼠。子二代小鼠。（+/-）（+/-）（+/-）（-/-）（+/+）（+/-）（+/-）（+/-）（+/-）（+/+）（-/-）遗传工程动物第81页基因敲除技术应用基因敲除技术应用1、研究基因调控和基因功效；、研究基因调控和基因功效；2、建立人类疾病转基因动物模型，为医学、建立人类疾病转基因动物模型，为医学研究提供材料；研究提供材料；3、改造动物基因型，判定新基因和、改造动物基因型，判定新基因和/或其或其新功效，研究发育生物学；新功效，研究发育生物学；4、治疗遗传病，即基因治疗。、治疗遗传病，即基因治疗。5、改造生物、培育新生物品种。、改造生物、培育新生物品种。遗传工程动物第82页1.与肿瘤相关基因敲除p53基因敲除纯合子鼠在6个月龄前易自发产生不一样类型肿瘤，尤其是淋巴瘤和肉瘤遗传工程动物第83页2.心血管疾病载脂蛋白ApoE在脂蛋白代谢中起主要作用，ApoE基因敲除小鼠表现出高胆固醇症和扩散性动脉粥样硬化。遗传工程动物第84页3.免疫相关Smad3 knockoutSmad3敲除后造成黏膜免疫缺点遗传工程动物第85页基因敲除技术缺点首先，许多基因在功效上是冗余，敲掉一个在功效上冗余基因，并不能造成轻易识别表型，因为基因家族其它组员能够提供一样功效。另首先，对于一些必需基因，敲除后会造成细胞致死性，也就无法对这些必需基因进行对应研究了。遗传工程动物第86页The knockout mouse project（KOMP）Launched by NIH特点：1.试图把小鼠全部基因依次逐一knockout 2.建立一个含有null mutationES细胞库 3.在C57BL/6小鼠而不是129小鼠上进行knockout遗传工程动物第87页与另两大敲除小鼠计划合作欧洲小鼠突变计划加拿大北美小鼠突变计划遗传工程动物第88页遗传工程动物第89页