响应面法优化克氏原螯虾虾头酶解工艺研究_燕瑜翰.pdf

农产品加工2022 年第 12 期摘要：以克氏原鳌虾虾头为原料，通过碱性蛋白酶酶解制备虾头酶解液，以水解度为评价指标，探讨酶添加量、酶解时间、酶解温度、酶解 pH 值、料液比对酶解效果的影响。通过单因素试验及响应面法确定最佳酶解条件为碱性蛋白酶添加量 2 000 U/g，料液比 11.2，pH 值 8.92，酶解时间 3.11 h，酶解温度 60.66，在此条件下，蛋白质水解度达到最大值，为 25.31%。关键词：克氏原螯虾；虾头；酶解；响应面法；水解度中图分类号：TS254.9文献标志码：Adoi：10.16693/ki.1671-9646（X）.2022.12.035Optimization of Enzymatic Hydrolysis of Procambarus clarkii Headby Response Surface MethodologyYAN Yuhan1，2，*LU Jingjing1（1.College of Food&Biology Science and Technology，Wuhan Institute of Design and Sciences，Wuhan，Hubei 430205，China；2.College of Food and Bioengineering，Jiangsu University，Zhenjian，Jiangsu 212023，China）Abstract：In this study，the Procambarus clarkii head was used as raw material to prepare the enzymatic hydrolysis solution ofshrimp head by alkaline protease.The degree of hydrolysis was used as the evaluation index to investigate the effects of enzymeaddition amount，enzymatic hydrolysis time，enzymatic hydrolysis temperature，enzymatic hydrolysis pH，and solid-liquidratio on the enzymatic hydrolysis effect.According to the single factor and response surface，the optimal enzymatic hydrolysisconditions were alkaline protease dosage of 2 000 U/g，solid-liquid ratio of 11.2，pH 8.92，enzymatic hydrolysis time of3.11 h，and enzymatic hydrolysis temperature of 60.66.Under these conditions，the degree of proteolysis reached the max-imum of 25.31%.Key words：Procamborus clarkii；shrimp head；enzymolysis；response sruface method；degree of hycholysis响应面法优化克氏原螯虾虾头酶解工艺研究燕瑜翰1，2，*卢静静1（1.武汉设计工程学院 食品与生物科技学院，湖北 武汉430205；2.江苏大学 食品与生物工程学院，江苏 镇江212023）收稿日期：2022-08-31作者简介：燕瑜翰（2000），女，在读硕士，研究方向为粮油食品加工。*通讯作者：卢静静（1987），女，硕士，讲师，研究方向为粮油食品加工。0引言克氏原螯虾因其味道鲜美、蛋白质含量丰富、营养价值高、烹饪方式多样，受到广大消费者的青睐。在克氏原螯虾加工和消费过程中，产生了大量的虾头、虾壳等副产废弃物，目前常见的处理方法是将虾头等废弃物粉碎后与鱼粉混合加工饲料，但其附加值较低1。虾头富含蛋白质、脂肪酸及风味物质，作为副产废弃物之一，其回收加工再利用研究备受关注，以虾头为原料加工开发水产调味品，成为目前的研究热点。解万翠等人2以南美白对虾虾头酶解蛋白粉为原料，加工开发得到虾味浓郁的虾风味料。任艳艳等人3以中国对虾虾头为原料，利用木瓜蛋白酶和风味蛋白酶进行复合酶解，对酶解液进行处理，得到香味浓郁的虾调味料。郑捷等人4采用风味蛋白酶和碱性蛋白酶复合酶法对虾下脚料进行酶解，以酶解液为原料处理后，进行调配，得到香味浓郁、虾味鲜美的复合调味料。另外，汤丹剑等人5、徐坤华等人6分别以哈氏仿对虾虾头、中华管鞭虾虾头为原料，进行研究，制备虾味调味料。但关于克氏原螯虾虾头利用的研究报道较少，因此试验以克氏原螯虾虾头为原料，利用碱性蛋白酶进行水解，并对酶解工艺进行了优化，为虾头副产物综合利用提供理论支持。1材料与方法1.1材料与试剂克氏原螯虾虾头，购自农贸市场；碱性蛋白酶，安徽天悦生物科技有限公司提供；水合茚三酮、磷文章编号：1671-9646（2022）12b-0020-03第 12 期（总第 566 期）农产品加工No.122022 年 12 月Farm Products ProcessingDec.2022 年第 12 期酸二氢钠、磷酸二氢钾等，国药集团化学试剂有限公司提供。1.2仪器与设备AL104 型分析天平、722 型可见分光光度计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司产品；TG-16WS 型高速离心机，长沙湘智离心机仪器有限公司产品；UV-2800 型紫外分光光度计，上海舜宇恒平科学仪器有限公司产品。1.3试验方法1.3.1克氏原螯虾虾头酶解条件优化虾头解冻后洗净，加水粉碎磨浆，取虾头浆于锥形瓶中，按料液比（10.5，11.0，12.0，13.0，14.0）加水混匀，调溶液 pH 值为（6.0，7.0，8.0，9.0，10.0），加入碱性蛋白酶（500，1 000，1 500，2 000，2 500，3 000 U/g），在适当的温度下（40，50，60，70，80 ），酶解（2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 h）后，沸水浴 10 min 灭酶，然后以转速4 500 r/min 离心 10 min，取上清液测游离氨基酸含量，计算水解度，研究酶解条件对酶解效果的影响1。在单因素试验基础上，应用 Design Expert 软件设计响应面试验，以水解度为响应值进行优化。1.3.2酶解液水解度测定（1）游离氨基酸含量测定7。采用茚三酮比色法，准确吸取 200 g/mL 的异亮氨酸标准溶液 0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL，置于 25 mL 容量瓶中，加水定容至 4.0 mL，加入缓冲溶液 1 mL，混匀后水浴加热 15 min，冷却至室温，定容摇匀。静置 15 min，于波长 570 nm 处测吸光度，绘制标准曲线 Y=0.001 1X+0.075 1。（2）蛋白质含量的测定参考凯氏定氮法 GB5009.52016。2结果与分析2.1底物料液比对虾头酶解效果的影响料液比对虾头酶解效果的影响见图 1。由图 1 可知，随着体系溶剂量的增大，底物浓度逐渐减小，虾头水解度先上升后下降，在料液比为 11（gmL）时，体系水解度达到最大，随后水解度开始下降，可能是由于底物浓度降低，不利于碱性蛋白酶与蛋白质的结合8，因此当料液比为11 时酶解效果最好。2.2酶用量对虾头酶解效果的影响酶用量对虾头酶解效果的影响见图 2。由图 2 可知，随着碱性蛋白酶用量的增大，水解度呈现先增大后趋于稳定的趋势。酶用量由500 U/g 增大至 1 500 U/g，底物水解度由 8.74%升高至 20.44，达到最大值，可能是在一定范围内，随着酶用量的增大，酶浓度增加，酶与底物蛋白的结合位点逐渐增多，酶解效果不断增强，达到一定浓度，酶与蛋白的结合位点达到饱和，水解度达到最大，而后继续增加酶用量，但由于底物浓度固定，水解度基本保持稳定，酶解效果变化不大。因此酶用量为 2 000 U/g 时，虾头酶解效果最好。2.3酶解 pH 值对虾头酶解效果的影响酶解 pH 值对虾头酶解效果的影响见图 3。由图 3 可知，随着 pH 值的增大，水解度呈先升高后下降的趋势，当 pH 值由 6.0 增至 9.0，底物水解度由 5.55%增至 22.3%，继续增大 pH 值至 10.0，水解度开始下降。原因在于酶的活性受 pH 值的影响，在酶最适 pH 值时酶的活性最大，此时酶解效果最好，试验所用碱性蛋白酶的最适 pH 值可能是 9.0，此时体系内生成的游离氨基氮含量最大，水解度最高。所以，当初始 pH 值为 9.0 时，酶解效果最好。2.4酶解时间对虾头酶解效果的影响酶解时间对虾头酶解效果的影响见图 4。由图 4 可知，随着酶解时间由 2 h 增加至 3 h，图 1料液比对虾头酶解效果的影响水解度/%252015105010.511.012.013.014.0料液比/gmL图 2酶用量对虾头酶解效果的影响水解度/%25201510505001 0001 5002 0002 0003 000酶用量/U g-1图 3酶解 pH 值对虾头酶解效果的影响水解度/%25201510506.07.08.09.010.0酶解 pH 值燕瑜翰，等：响应面法优化克氏原螯虾虾头酶解工艺研究21农产品加工2022 年第 12 期虾头水解度显著增加，由 9.63%增至 22.57%，但反应至 3 h 后，水解度基本趋于平稳，不再有显著变化。可能是由于酶与底物结合需要一定的时间，随着反应时间的延长，底物与酶活性位点逐渐结合，酶解程度逐渐增大，当底物蛋白与酶活性位点完全结合时，水解度增至最大，继续延长反应时间，无多余的酶活位点参与反应，水解程度不再增加。因此，当酶解 3 h 时，酶解效果最好。2.5酶解温度对虾头酶解效果的影响酶解温度对虾头酶解效果的影响见图 5。由图 5 可知，随着酶解温度的升高，水解度呈先增大后减小的趋势，60 时，水解度最大。可能由于随着温度的升高，酶活性逐渐增大，加速酶与蛋白质之间的酶解反应速率，达到酶最适温度 60 时，酶活最大，酶解效果最好，体系水解度最大，继续升温，温度过高会抑制蛋白酶的活性甚至失活，影响酶解反应的速率，导致水解度降低。因此，当酶解温度为 60 时，酶解效果最好。2.6响应面优化虾头酶解试验响应面设计方案及分析结果见表 1，方差分析结果见表 2。由表 2 可知，模型 p0.000 1 表明回归方程达到极显著水平；相关系数 R2=0.937 6，校正决定系数R2Adj=0.952 5，说明该模型可靠，可用于克氏原螯虾虾头酶解条件的分析和预测。通过对二次多元回归模型进行优化处理，得到最优酶解条件为料液比 11.2，初始 pH 值 8.92，酶解时间 3.11 h，酶解温度 60.66，得到酶解液水解度为 24.89%。为验证该条件的可靠性，重复 3 次进行试验，得到酶解液水解度为 25.31%，与理论值的图 4酶解时间对虾头酶解效果的影响图 5酶解温度对虾头酶解效果的影响表 1响应面设计方案及分析结果表 2方差分析结果水解度/%25201510502.02.53.03.54.0酶解时间 t/h水解度/%25201510504050607080酶解温度 /试验号A 料液比/gmLB 酶解pH 值123456789101112131415161718192021222324252627282910.511.011.011.010.512.010.510.511.011.011.010.511.011.011.011.012.011.011.012.012.012.012.011.011.010.511.011.011.098889910910999109899910910899989109C 酶解时间t/h3.52.53.03.53.03.03.02.53.03.03.53.03.53.53.03.02.53.03.03.53.03.03.02.52.53.03.02.53.0D 酶解温度/6060706070506060706050506070506060605060606070507060606060吸光度0.5450.3170.4050.3740.6100.5720.4760.4340.4680.7260.5160.4420.4940.6380.6020.7150.1810.5520.4240.6660.4190.4540.5560.3020.3450.4940.7160.1780.709水解度/18.269.3912.8111.6120.7819.3115.5613.9415.2525.3117.1314.2516.2821.8920.4924.874.1218.5413.5622.9813.3814.7418.698.8110.4916.2824.913.9824.65方差来源平方和F 值p 值显著性模型ABCDABACADBCBDCDA2B2C2D2848.185.143.32265.273.370.1068.3912.7820.6121.952.3743.26239.59285.4638.509.650.820.5342.240.540.01610.892.043.283.500.386.8938.1545.466.130.000 10.381 10.479 30.000 10.475 90.900 20.005 30.175 60.091 50.082 60.548 70.020 00.000 10.000 10.026 7显著自由度1411111111111111均方60.585.143.32265.273.370.1068.3912.7820.6121.952.3743.26239.59285.4638.50残差失拟纯误差总和 l87.9154.9732.94936.090.670.7253不显著14104286.285.508.24R2=0.937 6R2Adj=0.952 5（下转第 28 页）22农产品加工2022 年第 12 期相对误差为 1.7%，说明该模型与实际情况拟合较好，结果可靠。3结论以克氏原鳌虾虾头为原料，采用碱性蛋白酶酶解制备酶解液，通过单因素试验及响应面法确定最佳酶解条件为碱性蛋白酶添加量 2 000 U/g，料液比11.2，初始 pH 值 8.92，酶解时间 3.11 h，温度60.66，该条件下水解度 25.31%。参考文献：赵利，李婷，汪清，等.克氏原螯虾蛋白肽的制备及其抗氧化性的研究 J.中国调味品，2017，42（6）：22-28.解万翠，杨锡洪，陈昊林，等.固相美拉德反应增香法制备虾风味料工艺及 SPME-GC-MS 测定 J.食品科学，2010，31（24）：199-205.任艳艳，张水华.虾头酶解及反应型虾味香料的研究 J.中国食品添加剂，2005（6）：38-45.郑捷，王平，尹诗，等.酶解虾下脚料制备海鲜味复合调味料 J.中国调味品，2011，36（11）：48-51.汤丹剑，吴汉民.酶法制备虾头调味品的研究 J.浙江水产学院学报（自然科学版），1998，17（1）：19-24.徐坤华，张燕平，戴志远，等.碱性蛋白酶水解中华管鞭虾虾头的工艺优化 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