响应面法优化毛大丁草总香豆...提取工艺及其抗氧化作用研究_高奇.pdf

化学试剂 第 卷第 期响应面法优化毛大丁草总香豆素提取工艺及其抗氧化作用研究高奇，李齐激，杨柳，杨娟，孙超，（贵州医科大学 药学院，贵州 贵阳；贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵州 贵阳）摘要：以毛大丁草为研究对象，选择提取温度、提取溶剂、料液比和提取时间进行单因素试验，在单因素试验基础上，采用 响应面法优化其总香豆素提取工艺，并测定不同产地毛大丁草总香豆素提取率及评价其体外抗氧化活性。结果表明，其最佳提取工艺为提取温度 ，乙醇体积分数，料液比（），提取时间 。不同产地中清除率最高的为广西百色市样品，为.；最低的是贵州黔南州样品，为.。不同产地兰香草总黄酮具有一定的总抗氧化能力，能够有效地清除 自由基，效果弱于同浓度条件下。经验证该工艺合理、简便，总香豆素提取率可达.。关键词：毛大丁草；总香豆素；提取工艺；响应面法；抗氧化活性中图分类号：文献标识码：文章编号：（）：，（，；，）：，：，（），.；，.，.：；收稿日期：；网络首发日期：基金项目：贵州省科技创新能力建设专项项目（黔科合服企）；贵州省发展和改革委员会项目（黔财建）；贵州省教育厅高等学校特色重点实验室项目（黔教合 字）。作者简介：高奇（），女，内蒙古赤峰人，硕士生，研究方向为天然药物化学及活性物质研究。通讯作者：孙超，：。引用本文：高奇，李齐激，杨柳，等响应面法优化毛大丁草总香豆素提取工艺及其抗氧化作用研究化学试剂，（）：。毛大丁草为菊科兔耳一支箭属多年生草本植物兔耳风 （）的全草，别名白头翁、白薇等，长于林缘、草丛中或旷野荒地上。在中国主要产于贵州、西藏、云南等省区，在日本、尼泊尔等地也有分布。毛大丁草主要以全草入药，具有宣肺止咳、发汗等作用。其化学成分主要为香豆素类、黄酮类、糖苷类、苯乙酮类等。其中又以香豆素类化合物为主，包括简单香豆素、呋喃香豆素、吡喃香豆素等，。现代药理学研究发现，香豆素类化合物具有较为广泛的生物活性。毛大丁草的镇咳、平喘、抗炎、抗氧化等功效与其主要成分的香豆素类化合物紧密关联，如 甲氧补骨脂素化合物是具有强的超氧化负离子自由基的有效抑制剂，可通过增加血液中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽硫转移酶等酶的活性，降低过氧化氢酶活性，发挥抗氧化作用。童天娇等对秦皮的研究中发第 卷第 期高奇等：响应面法优化毛大丁草总香豆素提取工艺及其抗氧化作用研究现，同等浓度条件下香豆素提取液的抗氧化能力均强于。从陆俊霞等的实验中得知，实验所用香豆素类化合物都具有良好的抗氧化活性。研究发现，具有抗氧化活性的天然产物被广泛应用于预防和治疗氧化应激所导致的各种疾病，。香豆素类成分是毛大丁草中的特征性功效成分，对其提取工艺研究可使其总香豆素含量最大化。因此本文通过对提取因素进行响应面实验，以总香豆素的提取率为检测指标，优选毛大丁草总香豆素的最佳提取工艺。同时考察毛大丁草中总香豆素对 自由基和 自由基的清除作用，以期为进一步探讨其药理活性和开发利用提供实验基础。实验部分.主要仪器与试剂 型紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；型多功能酶标仪（美国 公司）；型水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；型超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；型电子天平（上海菁海仪器有限公司）。羟基香豆素（贵州迪大科技有限责任公司）；维生素、（梯希爱化成工业有限公司）；试剂盒、试剂盒（南京建成生物工程研究所）；其余试剂均为分析纯。个产地毛大丁草由贵州中医药大学孙庆文教授鉴定为 （）的干燥全草，烘干备用。药材信息见表。表 毛大丁草采收信息 编号采集地区药用部位贵州黔南全草贵州毕节全草贵州贵阳全草广西玉林全草广西百色全草云南大理全草云南昆明全草安徽亳州全草河北保定全草福建三明全草.实验方法.毛大丁草的提取将毛大丁草洗净，真空干燥，粉碎，过 号筛，以石油醚进行超声脱色处理，回收溶剂后烘干备用。精密称取.毛大丁草，按照一定的料液比加入一定浓度的乙醇，在一定的温度下回流提取一定时间后，过滤、稀释，作为待测溶液。.香豆素标准曲线的制备精密称定.羟基香豆素对照品，用的乙醇溶解并定容至 ，配制成.香豆素标准溶液，再将其稀释得到一定浓度梯度的标准品溶液，在 波长处测定其吸光度值。以标准品的浓度 为横坐标、吸光度值 为纵坐标，绘制标准曲线后得到回归方程 .（.）。.单因素试验.提取方法对总香豆素提取率的影响精密称定.毛大丁草粉末，在固定乙醇浓度、料液比（）、提取时间 的条件下，分别考察冷浸提取法、超声提取法、回流提取法对毛大丁草香豆素提取率的影响。每个实验平行 次，取平均值。毛大丁草总香豆素提取率 （）式中：为在回归方程中求出的毛大丁草总香豆素的质量浓度，；为提取溶剂体积，；为稀释倍数；为毛大丁草质量，。在乙醇体积分数、料液比 （）、提取温度 、提取时间 、提取 次的条件下，考察超声提取法、回流提取法、冷浸提取法对毛大丁草香豆素提取率的影响。.料液比对总香豆素提取率的影响精密称取 份.毛大丁草粉末，固定乙醇体积分数为、提取时间为、提取温度为 ，按料液比 、（）进行回流提取。每个实验平行 次，取平均值。.乙醇体积分数对总香豆素提取率的影响精密称取 份.毛大丁草粉末，固定料液比（）、提取温度为 、提取时间为 ，按乙醇体积分数为、进行回流提取。每个实验平行 次，取平均值。.提取时间对总香豆素提取率的影响精密称取 份.毛大丁草粉末，固定料液比（）、乙醇体积分数为、提取温度为 ，按提取时间为、化学试剂 第 卷第 期进行回流提取。每个实验平行 次，取平均值。.提取温度对总香豆素提取率的影响精密称取.毛大丁草粉末，固定料液比（）、乙醇体积分数为、提取时间为，按提取温度为、进行回流提取。每个实验平行 次，取平均值。.响应面实验以单因素考察为基础，将料液比、乙醇体积分数、提取时间、提取温度 个因素作为自变量，香豆素提取率为响应值，设计响应面优化实验。数据处理运用 .软件对响应面结果进行分析处理试验。实验自变量因素变化水平设计见表。表 响应面实验设计的因素与水平 水平乙醇浓度料液比（）提取时间提取温度.不同产地毛大丁草香豆素含量的比较按照响应面实验的最佳提取工艺对 个产地的毛大丁草进行回流提取，计算不同产地的毛大丁草香豆素的提取率，进行含量的差异比较。.抗氧化实验精密称取.不同产地的毛大丁草粉末，按响应面下的最佳提取工艺进行总香豆素的提取，将所得提取液分别配制成浓度为.、.、.、.、.的样品溶液，分析其抗氧化能力。.毛大丁草香豆素清除 自由基能力的测定毛大丁草香豆素清除 自由基的测定参照文献 的方法。精确称取.的 于棕色容量瓶中，用无水乙醇进行溶解定容制成浓度为.的 溶液。将 香豆素乙醇溶液与 溶液加入 孔板中，振摇均匀后室温避光 ，使用酶标仪在 处测定其吸光度值，记为；同时，将 与 乙醇溶液加入 孔板中，测定其吸光度值，记为；将 香豆素乙醇溶液与 乙醇溶液加入到 孔板中，测定其吸光度值，记为。按清除率 （），计算不同浓度的香豆素溶液对 自由基清除率的影响。在以香豆素乙醇溶液的浓度为横坐标，清除率为纵坐标绘制浓度清除率曲线。阳性对照组将香豆素提取液替换为 进行测定。.毛大丁草香豆素清除 自由基的测定 在适当的氧化剂作用下氧化生成绿色的，在抗氧化物存在时，的产生会被抑制，在 处测定其吸光度值，则可计算出样品的总抗氧化能力。实验操作按说明书进行。.毛大丁草香豆素总抗氧化能力的测定在酸性条件下抗氧化物质可以还原 产生蓝色的，在 处测吸光度可以计算出样品的总抗氧化能力，实验操作按说明书进行。结果与讨论.单因素试验的确定.提取方法的确定在乙醇体积分数、料液比为（）、提取温度 、提取时间 、提取 次的条件下，考察超声提取法、回流提取法、冷浸提取法对毛大丁草总香豆素提取率的影响。由图 可知，回流提取时总香豆素的提取率最高，故选择回流提取法进行后续实验。图 提取方法对总香豆素提取率的影响 .料液比的确定由图 可知，当料液比（）时，总香豆素的提取率随着料液比的增加而增加，当料液比为（）时，香豆素的提取率达到最大值，继续增加料液比，香豆素的提取率有所下降。当提取溶剂过大时，会造成水溶性蛋白和多糖的析出，使香豆素溶出受到阻碍，而且过高的料液比会造成成本增加，所以将 （）作为最佳料液比。第 卷第 期高奇等：响应面法优化毛大丁草总香豆素提取工艺及其抗氧化作用研究料液比；乙醇体积分数；提取时间；提取温度图 单因素对总香豆素提取率的影响 .乙醇体积分数的确定由图 可知，当乙醇体积分数为 时，总香豆素提取率达到最高值，继续增加乙醇浓度，总香豆素提取率呈现出直线下降的趋势，这是因为香豆素类成分在乙醇中的溶出率比在水中的高，所以在乙醇浓度由 上升到 时，总香豆素提取率出现一个升高的趋势；但是当乙醇体积分数过高时，毛大丁草中其他脂溶性成分会溶出，对香豆素的提取产生不利的影响，所以将 乙醇作为最佳体积分数。.提取时间的确定由图 可知，范围内，总香豆素提取率随时间延长而不断增加。这是由于随时间延长可使药材粉末与提取溶剂接触更加完全和充分，使香豆素的溶出率更高。但当 后继续延长提取时间，总香豆素的提取率出现一定的下降；在 时间内，总香豆素的提取率趋于稳定，因为长时间的加热导致物质的结构遭到破坏，增大杂质的析出，故将 定为最佳提取时间。.提取温度的确定由图 可知，在 的温度范围内，总香豆素的提取率呈现出上升的趋势。当温度升到，提取率达到最大值。原因是植物细胞在较高温度时容易破裂，且分子运动随着温度的升高而逐渐剧烈，可以促进香豆素的溶出。当温度继续升高时，香豆素的提取率不增反减。故最佳提取温度应为 。.响应面实验设计.响应面实验设计结果以单因素考察为基础，响应面实验及设计结果见表，方差分析见表。运用.进行回归分析，得到毛大丁草总香豆素提取率（）对乙醇体积分数、料液比、提取温度、提取时间 的回归方程为：.。表 实验设计与结果 编号乙醇浓度料液比（）提取时间提取温度提取率.化学试剂 第 卷第 期续表编号乙醇浓度料液比（）提取时间提取温度提取率.表 响应曲面方差分析及显著性检验 方差来源离均差平方和自由度均方 值 值显著性模型.残差.失拟项.纯误差.总差.响应面分析由表 可知该模型极显著（.），失拟项不显著（.，.），.，说明该模型拟合度好，可用于毛大丁草总香豆素回流提取的预测与分析。回归方程的各项分析表明，一次项、的影响极显著（.），、的影响不显著；二次项、的影响极显著，的影响显著，的影响不显著；交互项 影响极显著，影响显著（.），、的影响不显著；由 值可知 个因素对 的影响大小依次为（提取时间）（乙醇体积分数）（料液比）（提取温度）。交互作用对毛大丁草总香豆素提取率影响见图。由图可知，总香豆素提取率随提取时间、料液比先上升后下降，等高线均为椭圆形，说明料液比和提取时间的交互作用对总香豆素的提取率影响较大。料液比提取时间响应面图；料液比提取温度响应面图；料液比提取时间等高线图；料液比提取温度等高线图图 响应面和等高线分析图 .最佳提取工艺的验证运用.软件分析得到的毛大丁草总香豆素的最佳提取工艺条件为：乙醇体积分数.、料液比 .（）、提取时间.、提取温度 ，在此条件下毛大丁草香豆素的提取率为.。为检验该工艺的可靠性，对其进行了验证试验，结合实际操作的可行性，将条件修正为：乙醇体积分数、料液比（）、提取时间 、提取温度 ，第 卷第 期高奇等：响应面法优化毛大丁草总香豆素提取工艺及其抗氧化作用研究平行 次试验后得到的香豆素提取率为（.），说明利用响应面优化的毛大丁草提取工艺具有较高的可靠性和可行性。.不同产地毛大丁草总香豆素提取率的比较 个产地的毛大丁草总香豆素提取率的结果见图，由图可知，不同产地毛大丁草总香豆素提取率有所差异，其中提取率最高的是广西百色市样品，总香豆素提取率为.，最低的是贵州贵阳市样品，总香豆素提取率为.。图 不同产地毛大丁总草香豆素提取率 .抗氧化实验.毛大丁草总香豆素清除 自由基能力的测定由图 可知，个产地的毛大丁草香豆素对 具有一定的清除能力，且清除率随着香豆素浓度增加而增加，与样品浓度存在量效关系。不同产地的样品存在一定的差异性。个产地样品和阳性药 对 的半数抑制浓度分别.、.、.、.、.、.、.、.、.、.、.。其中清除率最高的是广西百色市样品，清除率最低的是贵州黔南州样品。图 不同产地毛大丁草总香豆素对 自由基清除能力 .毛大丁草总香豆素清除 自由基的测定按照试剂盒说明书要求配制所用工作液。将标准品 溶液用蒸馏水稀释成.、.、.、.、.，室温反应 ，在 波长处测定其吸光度值。以标准品 值为横坐标，各 值浓度为纵坐标制成标准曲线，回归曲线为.（.）。将测定孔测得 值带入标准曲线中，计算得出 个产地样品总抗氧化能力。图 所示，不同产地的毛大丁草总抗氧化能力有明显的差异，其中抗氧化能力最强的是广西百色市样品，抗氧化能力最弱的是贵州黔南州样品。图 不同产地总香豆素对 自由基清除作用 .毛大丁草总香豆素总抗氧化能力的测定按照试剂盒说明书上的试剂组成和配制，自行配制工作液。精密称定.用 蒸馏水溶解，取适量 溶液再稀释 成.、.、.、.、.和.。孵育 ，在 波长处测定其吸光度值。各孔减去空白孔 值后，以标准品 值为横坐标，相对应浓度为纵坐标绘制标准曲线，得到回归曲线为.（.）。经过计算，个产地的总抗氧化能力如图 所示。结果表明，广西百色市的样品总抗氧化能力最强，云南昆明市的样品总抗氧化能力最弱。图 不同产地总香豆素总抗氧化能力 化学试剂 第 卷第 期.总香豆素提取率与抗氧化活性分析 个不同产地的毛大丁草进行了提取率及抗氧化活性的差异性研究表明，毛大丁草总提取率最高的是广西百色市样品，提取率最低的是贵州贵阳市样品。通过 种抗氧化实验研究发现，毛大丁草总香豆素具有良好的抗氧化能力，且抗氧化能力的强弱与香豆素含量成正比。即总香豆素提取率最高样品的抗氧化能力最强，反之最弱。结论本实验以乙醇为溶剂，乙醇回流法对不同产地毛大丁草的香豆素提取进行研究。在单因素试验的基础上，应用 法优选其提取工艺，该法简单可靠，首次对毛大丁草总香豆素的提取工艺进行优化。确定最佳提取条件为乙醇体积分数、料 液 比 （）、提 取 时 间、提取温度 。通过文献调研发现，毛大丁草在中国西南地区少数民族中应用比较广泛，本实验研究的毛大丁草香豆素的抗氧化活性与少数民族的应用联系起来，阐明其民族药用价值，促进民族药药材的标准化和规范化。本文构建了毛大丁草香豆素的提取工艺，并筛选了不同产地的抗氧化活性，这为毛大丁草作为天然抗氧化剂的开发提供了可靠的实验依据。同时，对毛大丁草的深入研究可以进一步对其有效部位、有效成分进行阐明，为新药的开发与研究奠定理论基础，使毛大丁草的使用更加广泛，提高这一植物资源的合理应用度，为少数民族创造经济价值。参考文献：中国科学院中国植物志编辑委员会中国植物志北京：科学出版社，：张贝西，王建军，雷启义，等民族药用植物毛大丁草的化学成分及药理作用研究进展南京中医药大学学报，（）：，（）：郑玲，赵挺，孙立新香豆素类化合物的药理活性和药代动力学研究进展时珍国医国药，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：代英宏，赵艳敏，张美媛，等香豆素类化合物生理药理活性的研究山东化工，（）：王凯，刘翔，徐浩然，等天然呋喃香豆素类成分药理活性、药动学及毒性研究进展中国药理学与毒理学杂志，（）：童天娇，刘伟，胥鑫萌，等秦皮中香豆素提取工艺优化及其抗氧化活性研究 保鲜与加工，（）：陆俊霞，李珂珂，王平，等儿茶酚香豆素清除自由基能力测定及作用机制探索中国现代中药，（）：左玉抗氧化剂在食品中的应用粮食与油脂，（）：史娟，葛红光，郭少波，等响应曲面法优化白花前胡总香豆素提取及抑菌和抗氧化活性中国粮油学报，（）：陈如一，史悦悦，张晓熙，等艾柱挥发油和燃烧产物成分 分析及抗氧化活性比较中成药，（）：，（）：，：，（）：，（）：谭荣，李本鹏，蒋向辉，等长毛风毛菊中总香豆素的提取工艺及抗氧化活性研究世界科学技术中医药现代化，（）：