细胞焦亡相关蛋白NLRP3...性结肠炎黏膜中的表达及意义_陈凤英.pdf

基金项目:海南省自然科学基金(821MS126);海南省研究生创新科研课题(Hys2020-373)第一作者简介:陈凤英,硕士,住院医师,研究方向:消化系病。E-mail:15060827057 通讯作者:苗新普,教授,主任医师,硕士生导师,研究方向:消化系病。E-mail:miaoxinpu doi:10.3969/j.issn.1006-5709.2023.01.011细胞焦亡相关蛋白 NLRP3、IL-1、Caspase-1 在溃疡性结肠炎黏膜中的表达及意义陈凤英,苗新普 海南医学院附属海南医院 海南省人民医院消化内科,海南 海口 570100【摘要】目的通过研究细胞焦亡相关蛋白 NLRP3、IL-1、Caspase-1 在溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)患者结肠黏膜中的表达,比较其差异性,探讨其在 UC 发病机制中的作用及相关性。方法取 27 例 UC 患者结肠黏膜标本,根据内镜及组织学进行分级,其中轻度 13 例,中重度 14 例。同时收集确诊为结直肠癌并行外科手术切除的结直肠断端正常的结肠黏膜标本 25 例。采用免疫组化 SP 法检测所有患者肠黏膜中 NLRP3、IL-1、Caspase-1 的表达情况。结果NLRP3、IL-1、Caspase-1 在 UC 患者结肠黏膜中的蛋白表达高于癌旁组织对照组,差异均有统计学意义(H=110.57,P0.01)。IL-1 的表达与病理分级呈正相关(r=0.511,P0.01)。NLRP3、Caspase-1 蛋白表达与病理分级无相关性。结论IL-1 与 UC 炎症的发生发展密切相关,NLRP3、Caspase-1 参与炎症损伤,介导细胞焦亡,从而影响 UC 炎症的发生发展,提示细胞焦亡参与 UC 的发病过程。【关键词】溃疡性结肠炎;炎症小体;细胞焦亡;白介素-1;半胱天冬酶-1;免疫组织化学中图分类号:R574文献标识码:A文章编号:1006-5709(2023)01-0049-04收稿日期:2021-09-23Expression and significance of NLRP3,IL-1 and Caspase-1 in ulcerative colitisCHEN Fengying,MIAO XinpuDepartment of Gastroenterology,Hainan Affiliated Hospital of Hainan Medical University,Hainan General Hospital,Haikou 570100,China【Abstract】ObjectiveTo study the expression of NLRP3,IL-1 and Caspase-1 in the colonic mucosa of patients with ulcerative colitis(UC),compare their differences,and to explore their role and correlation in the pathogenesis of UC.MethodsColonic mucosa specimens were collected from 27 UC patients and graded according to endoscopy and histology,including 13 mild cases and 14 moderate severe cases.Meanwhile,25 colonic mucosal specimens were col-lected from normal controls who were diagnosed with colorectal cancer and underwent surgical resection.Immunohisto-chemical SP method was used to detect the expression of NLRP3,IL-1 and Caspase-1 in intestinal mucosa of all pa-tients.ResultsThe protein expressions of NLRP3,IL-1 and Caspase-1 in the colon mucosa of UC patients were sig-nificantly higher than those of the control(H=110.57,P0.01).The expression of IL-1 was positively correlated with pathological grade(r=0.511,P0.05),所取对照标本均经病理检查确认为癌旁正常组织。1.2诊断标准以上研究对象纳入标准:符合中华医学会消化病学分会炎症性肠病学组炎症性肠病诊断与治疗的共识意见(2018 年北京)中相关诊断标准17,经过临床表现、内镜、影像学、实验室检查以及病理组织学检查等诊断为 UC。Mayo 评分系统参照炎症性肠病诊断与治疗的共识意见(2018 年 北京)17。2 位病理科医师阅片按 Riley-Mani-goodman分级法进行组织学分级。1.3免疫组化 SP 法测定 NLRP3、IL-1、Caspase-1在 UC 患者结肠黏膜中的表达组织切片脱蜡,高压锅加压修复抗原,3%过氧化氢处理,5%的山羊血清封闭 30 min,依 次 滴 加 兔 抗 人 NLRP3 多 克 隆 抗 体(1 800),兔抗人 Caspase-1 多克隆抗体(1800),兔抗人 IL-1 多克隆抗体(1800),4 过夜。滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素,SP 复合物、DAB 显色、苏木素复染。用缓冲盐液替代一抗作阴性对照,用已知阳性切片作阳性对照。通过使用 Image-Pro plus 6.0图像分析软件来计算显微镜下染色图片中棕黄色沉淀的平均积分光密度值(integral optical density,IOD)。兔抗人 NLRP3 多克隆抗体、兔抗人 Caspase-1 多克隆抗体、兔 抗 人 IL-1 多 克 隆 抗 体 均 购 自 Proteintech公司。1.4统计学处理采用 SPSS 24.0 软件进行统计学分析,对所有计量资料进行正态分布检验及方差齐性检验。计量资料符合正态分布时用均数 标准差表示。计量资料符合偏态分布时用中位数的形式来表示。计量资料符合正态分布且符合方差齐性检验,进行单组间方差分析(One-way ANOVA),若不符合正态分布时,等级资料多组之间比较采用 H 检验(Kruskal-Wallis 法),两组间比较采用秩和检验,NLRP3、IL-1、Caspase-1 相关 性采用 Spearman 等级 相关分析,P 0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1UC 结肠黏膜组织中 NLRP3、IL-1、Caspase-1蛋白的表达 27 例均为活动期 UC 患者;病理组织学分级:级 8 例,级 15 例,级 4 例。UC 结肠黏膜组织中 NLRP3、IL-1、Caspase-1 蛋白 IOD 值用中位数05胃肠病学和肝病学杂志2023 年 1 月第 32 卷第 1 期Chin J Gastroenterol Hepatol,Jan 2023,Vol.32,No.1表示,分 别 为 0.26、0.11、0.21。癌 旁 组 织 分 别 为0.02、0.03、0.03;三者在 UC 患者结肠黏膜组织与正常组织 比 较,差 异 有 统 计 学 意 义(H=110.57,P 0.01)。UC 结肠黏膜组织中 NLRP3、IL-1、Caspase-1蛋白表达高于对照组(P0.01)。免疫组化检测各组肠黏膜 NLRP3、IL-1、Caspase-1 的表达:在 UC 组的肠上皮组织中,NLRP3、IL-1、Caspase-1 表达与对照组相比,UC 患者的结肠组织 IHC 切片内棕黄色颗粒的IOD 值较高,且染色强度增强,可见较多的棕色颗粒(见图 1)。IL-1 蛋白表达与组织分级呈正相关(r=0.511,P0.01)。IL-1 蛋白表达在病理级与病理级比较,差异有统计学意义(P0.05),病理级与病理级比较,差异无统计学意义(P0.05)。NLRP3、Caspase-1 蛋白表达与病理分级无相关性,在病理级与病理级比较,差异无统计学意义(P 0.05),病理级与病理级比较,差异无统计学意义(P0.05),病理级与病理级比较,差异无统计学意义(P0.05)。表 1免疫组化检测 NLRP3、IL-1、Caspase-1 在各组的表达Tab 1Immunohistochemical expression of NLRP3,IL-1 and Caspase-1 in different groups组别例数NLRP3(IOD 值)IL-1(IOD 值)Caspase-1(IOD 值)P 值对照组250.020.030.030.01UC 组270.110.260.21 病理级8 0.110.200.19 病理级150.110.300.2病理级40.130.400.25 图 1结肠组织 IL-1、NLRP3 和 Caspase-1 的免疫组化(放大 200 倍)Fig 1Immunohistochemistry of IL-1,NLRP3 and Caspase-1 in colon tissues2.2NLRP3、IL-1、Caspase-1 蛋白表达的相关性UC 结肠黏膜组织中 NLRP3 蛋白和 IL-1 蛋白表达呈正相关(r=0.744,P0.01);Caspase-1 蛋白和 IL-1蛋白表达呈正相关(r=0.756,P0.01);Caspase-1 蛋白和 NLRP3 蛋白表达呈正相关(r=0.778,P0.01)。3讨论UC 与多种致病因素有关,包括环境变化、一系列易感基因变异、定性和定量异常的肠道微生物群和广泛失调的免疫反应18。炎症小体属于先天性免疫的一个组成部分,也是炎症的一种形式,其功能是保护机体免受内外威胁因素的侵袭19。NLRP3 炎症小体由传感器、适配器和一个效应体组成。最近的研究表明,NLRP3 基因的单核苷酸多态性(single nucleotide poly-morphisms,SNPs)与 UC 易感性有关20。有证据表明,NLRP3 在 UC 的发病中占有一定的作用,促使 UC 的发生发展。UC 发病机制中最重要的是 NLRP3 在一系列刺激下,Caspase-1 被激活,IL-1 和 IL-18 被合成,炎性小体复合物被组装21。NLRP3 过度激活可引起Caspase-1 的激活,进而使促炎因子 IL-1 生成过多,导致细胞焦亡的产生。Angelidou 等22发现,IL-1 的存在为炎症性结肠炎的鉴别诊断和 UC 治疗的可能靶点提供了候选生物标志物。还有研究发现 Caspase-1是 NLRP3 炎症小体的效应体。活化的 Caspase-1 可以处理灭活的 IL-1 和 IL-18 的前体分别转化为成熟的IL-1 和 IL-1823。由此可见,NLRP3 是焦亡的触发因子,IL-1 和 IL-18 是其效应因子。也有研究24表明 IL-1 和 IL-18 是诱导 UC 的主要炎性细胞因子。Deng 等25对 DSS 诱导的结肠炎模型小鼠进行研究,结果表明通过抑制 NLRP3 炎症小体的激活及靶向NLRP3 可预防结肠炎。近年来,关于 UC 机制研究大部分来自于动物实验,由于实验条件不同,结果也会有所不同。在大多数实验中,NLRP3 炎症小体与 UC 的研究均基于在 DSS诱导的结肠炎模型小鼠进行,动物实验操作相对复杂,模型的建立也因实验条件不同而存在差异,导致结果也各有不同。NLRP3 和 Caspase-1、IL-1 的临床证据15胃肠病学和肝病学杂志2023 年 1 月第 32 卷第 1 期Chin J Gastroenterol Hepatol,Jan 2023,Vol.32,No.1仍然不足,关于 UC 患者 NLRP3 和 Caspase-1、IL-1 之间关系的研究报道较少。因此,我们选择 UC 患者作为研究对象,通过免疫组化来检测肠组织中焦亡相关蛋白 NLRP3、Caspase-1、IL-1 的表达,探讨其在 UC 发病发展中的作用,本研究有可能为 NLRP3 和 Caspase-1、IL-1 在 UC 中的表达提供更多的临床证据。在本实 验 中,我 们 用 免 疫 组 化 的 方 法 来 研 究NLRP3、Caspase-1 及 IL-1 在肠道黏膜中的表达情况,结果显示 UC 组的肠上皮组织同对照组相比,可见染色范围及强度均增强。提示我们 UC 患者的 NLRP3和 Caspase-1、IL-1 均升高,差异有统计学意义。表明NLRP3 水平与 Caspase-1、IL-1 水平及病情严重程度呈正相关。虽然关于 UC 的研究很多,但 UC 的分子机制尚不清楚,UC 的诊断仍然需要更多有效的生物标志物来进一步证明。本研究也存在一定的局限性。首先,研究的样本量较小,而且比较单一;其次,细胞焦亡相关蛋白 NLRP3 和 Caspase-1、IL-1 在 UC 的发病中分子机制还不清楚,这些问题将需要再进一步的研究。参考文献1 Cao R,Ma Y,Li S,et al.1,25(OH)2 D3 alleviates DSS-induced ul-cerative colitis via inhibiting NLRP3 inflammasome activation J.J Leukoc Biol,2020,108(1):283-295.DOI:10.1002/JLB.3MA0320-406RR.2Ords I,Eckmann L,Talamini M,et al.Ulcerative colitis J.Lancet,2012,380(9853):1606-1619.DOI:10.1016/S0140-6736(12)60150-0.3 Liu Q,Zuo R,Wang K,et al.Oroxindin inhibits 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