A4酶学2003.pptx

复旦大学生物化学系黄伟达第四章、酶学第四章、酶学复旦大学生物化学系黄伟达研究历史研究历史复旦大学生物化学系黄伟达酶酶,enzyme希腊语原意希腊语原意:in yeast生命体内催化化学反应的物质细胞中大部分球蛋白为酶细胞中大部分球蛋白为酶复旦大学生物化学系黄伟达酶为什么能催化生化反应酶为什么能催化生化反应复旦大学生物化学系黄伟达1713171317131713年年 Reaumur Reaumur 1783178317831783年年 Spallamzan Spallamzan 发现鸟的胃液能消化肉发现鸟的胃液能消化肉1814181418141814年年 KirchhoffKirchhoff发发现现稀稀酸酸对对淀淀粉粉的的加加水水分分解解作作用用【麦麦芽芽抽抽提提液液加加入入淀淀粉粉后后能能生生成成麦麦芽芽糖糖,即即麦麦芽芽抽抽 提提 液液 中中 必必 定定 有有 能能 水水 解解 淀淀 粉粉 的的 水水 溶溶 性性 物物 质质ferment(ferment(酵素酵素)】1826182618261826年年 MitscherlichMitscherlich提倡水溶性酵素为提倡水溶性酵素为 unorganized ferment unorganized ferment 1830183018301830年年 KuhlneKuhlne开始使用开始使用EnzymeEnzyme这一术语这一术语1833183318331833年年 Payen&Persoz Payen&Persoz 从麦芽抽提液得到了从麦芽抽提液得到了 ferment,ferment,称称diastase diastase【溶溶于于水水、稀稀酸酸,但但不不溶溶于高浓度酒精于高浓度酒精,即现在的即现在的amylaseamylase】1835183518351835年年 BerzeliusBerzelius提出提出fermentferment起的是催化作用起的是催化作用酶学研究史酶学研究史1 1复旦大学生物化学系黄伟达1857185718571857年年 PasteurPasteur认为发酵分几个阶段进行认为发酵分几个阶段进行,每一步都有特定每一步都有特定的酶参与的酶参与,但酶只在活体细胞中才能起作用但酶只在活体细胞中才能起作用1894189418941894年年 BertrandBertrand发现了水解酶以外的酶发现了水解酶以外的酶1897189718971897年年 BuchnerBuchner兄弟以兄弟以 没有酵母的酒精发酵没有酵母的酒精发酵 证明了酶可证明了酶可以离开细胞起作用以离开细胞起作用1910191019101910年年 Halden&Young Halden&Young 发现酶是蛋白质与耐热性低分子量发现酶是蛋白质与耐热性低分子量化合物化合物(cofactor)(cofactor)的复合物的复合物,提出蛋白质只是担体提出蛋白质只是担体1913191319131913年年 米氏方程建立米氏方程建立1926192619261926年年 SumnerSumner得到了得到了UreaseUrease的结晶的结晶【1 1 2 2年后年后,Northrop,Northrop结结晶化了晶化了Pepsin,TrypsinPepsin,Trypsin等蛋白酶等蛋白酶】结晶中测定不到结晶中测定不到cofactorcofactor1929192919291929年年 WarburgWarburg发现呼吸链诸酶中的血红素发现呼吸链诸酶中的血红素 【1935-19361935-1936年微生素与辅酶的关系的解明年微生素与辅酶的关系的解明】1929192919291929年年 SabbarowSabbarow发现发现ATPATP【1939-19401939-1940年年 F.LipmannF.Lipmann解明高解明高能磷酸化合物的生理意义能磷酸化合物的生理意义】1959195919591959年年 Sutherland cAMPSutherland cAMP的发现的发现-酶与激素的关系酶与激素的关系1970197019701970年年 Restriction enzymeRestriction enzyme的发现的发现-基因工程基因工程1982198219821982年年 Thomas R.CechThomas R.Cech和和Sidney Altman Sidney Altman 在研究在研究RNARNA分子剪分子剪切机理时发现切机理时发现RNARNA分子也有催化能力分子也有催化能力酶学研究史酶学研究史2 2复旦大学生物化学系黄伟达酶的分类酶的分类复旦大学生物化学系黄伟达 全酶全酶(holoenzyme)|酶蛋白（酶蛋白（apoenzyme)+辅助因子辅助因子（cofactor)cofactor 酶的结构概念酶的结构概念辅基，辅基，prosthetic group辅酶，辅酶，co-enzyme金属离子金属离子(也可归入辅基也可归入辅基)结合力强结合力强PP129,Table 5-4复旦大学生物化学系黄伟达ECEC号的第一个数字号的第一个数字1.oxidoreductase 1.oxidoreductase 氧化还原酶类氧化还原酶类2.transferase 2.transferase 转移酶类转移酶类3.hydrolase 3.hydrolase 水解酶类水解酶类4.lyase 4.lyase 裂合酶类裂合酶类5.isomerase 5.isomerase 异构酶类异构酶类6.ligase/synthetase 6.ligase/synthetase 连接酶类连接酶类酶的命名法酶的命名法乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 lactate dehydrogenase,1.1.1.27lactate dehydrogenase,1.1.1.27复旦大学生物化学系黄伟达氧化还原酶氧化还原酶氧化还原酶氧化还原酶转移酶转移酶转移酶转移酶水解酶水解酶水解酶水解酶裂合酶裂合酶裂合酶裂合酶异构酶异构酶异构酶异构酶连接酶连接酶连接酶连接酶复旦大学生物化学系黄伟达米氏方程米氏方程复旦大学生物化学系黄伟达酶催化的反应中各成份的变化酶催化的反应中各成份的变化S+E ES E+PS:substanceP:productE:enzyme发生在发生在发生在发生在很短的很短的很短的很短的时间内时间内时间内时间内复旦大学生物化学系黄伟达酶反应的速度不停在变酶反应的速度不停在变 )复旦大学生物化学系黄伟达酶反应的初速度与酶反应的初速度与底物浓度之间的关系底物浓度之间的关系实验上只有初速度实验上只有初速度的测定才有意义的测定才有意义复旦大学生物化学系黄伟达假设假设 E+S ES 的平衡迅速建立的平衡迅速建立 反应初速由最高速度与底物浓度决定反应初速由最高速度与底物浓度决定 v =Vmax f(S)v =Vmax/(1+C/S)或或 v =Michaelis-Menten方程方程(19131913年年)Vmax SC+S根据实验数据推导根据实验数据推导复旦大学生物化学系黄伟达Briggs&Haldane重新推导重新推导 E+S ES P+E k1(Eo-ES)S=k2ES+k3 ES k2+k3 (Eo-ES)S k1 ES ES=EoS/(Km+S),Km=(k2+k3)/k1 因为因为 v=k3ES,而而 Vmax=k3Eo 因此因此 v =Vmax S/(Km+S)Michaelis-Menten方程方程(19251925年年)k1k2k3k4=复旦大学生物化学系黄伟达米氏方程和米氏常数的意义米氏方程和米氏常数的意义KmKmKmKm值越小值越小值越小值越小,底底底底物与酶的亲和物与酶的亲和物与酶的亲和物与酶的亲和力越强力越强力越强力越强,反应反应反应反应越迅速越迅速越迅速越迅速复旦大学生物化学系黄伟达Lineweaver-Burk plot(双倒数作图双倒数作图)1/v=Km/Vmax*1/S+1/Vmax 复旦大学生物化学系黄伟达Eadie-Hofstee plotHanes plot请从米氏方程推导请从米氏方程推导复旦大学生物化学系黄伟达Cornish-Bowden plotDixon plot这两种作图法的依据为何这两种作图法的依据为何?复旦大学生物化学系黄伟达实际实验数据实际实验数据复旦大学生物化学系黄伟达竞争性抑制竞争性抑制(Competitive inhibition):E +S ES E +P +I Ki EI反竞争性抑制反竞争性抑制(Uncompetitive inhibition):E +S ES E +P +I Ki ESI 酶反应的三种不同抑制酶反应的三种不同抑制Ki=E*I/EI,Eo=E+EI+ESEo=E+ESI+ES复旦大学生物化学系黄伟达非竞争抑制非竞争抑制(Noncompetitive inhibition):E +S ES E +P +I Ki +I Ki EI ESI 复旦大学生物化学系黄伟达不同类型抑制作用的米氏方程不同类型抑制作用的米氏方程复旦大学生物化学系黄伟达I竞争性抑制竞争性抑制反竞争性抑制反竞争性抑制非竞争性抑制非竞争性抑制复旦大学生物化学系黄伟达酶反应的产物生成酶反应的产物生成复旦大学生物化学系黄伟达复旦大学生物化学系黄伟达两种不同模式的双底物反应两种不同模式的双底物反应顺次式顺次式(sequential)乒乓式乒乓式(ping-pong)复旦大学生物化学系黄伟达氧化还原酶氧化还原酶氧化还原酶氧化还原酶转移酶转移酶转移酶转移酶水解酶水解酶水解酶水解酶裂合酶裂合酶裂合酶裂合酶异构酶异构酶异构酶异构酶连接酶连接酶连接酶连接酶复旦大学生物化学系黄伟达双底物反应的米氏方程双底物反应的米氏方程当当P1,P2=0 时时太复杂了太复杂了太复杂了太复杂了,忘了我吧忘了我吧忘了我吧忘了我吧 !复旦大学生物化学系黄伟达酶的分离纯化酶的分离纯化复旦大学生物化学系黄伟达酶的活力单位酶的活力单位:1 Katal 定义为定义为umole/min 的酶的酶 酶的分离纯化酶的分离纯化过程中一定要过程中一定要随时追踪酶的随时追踪酶的活性活性比活比活:specific activity酶单位数酶单位数/mg 蛋白质蛋白质复旦大学生物化学系黄伟达温度和温度和pH对酶的活性的影响对酶的活性的影响复旦大学生物化学系黄伟达酶经常以多酶经常以多(寡寡)聚体的形式存在聚体的形式存在很多酶都有同工酶很多酶都有同工酶,可以聚合在一起可以聚合在一起,也可以单体存在也可以单体存在多亚基酶往往受正协同别构效应的多亚基酶往往受正协同别构效应的调控调控RNARNA可以是酶可以是酶,或酶活性的主要成分或酶活性的主要成分抗体也可以成为酶抗体也可以成为酶 复旦大学生物化学系黄伟达酶反应的机制及相应理论和假说酶反应的机制及相应理论和假说酶活性的调控酶活性的调控:别构效应别构效应什么是什么是 k kcat cat?ECEC的四个数字代表什么的四个数字代表什么?进一步要求进一步要求: