体外受精囊胚培养液中mtD...与囊胚发育潜能的相关性研究_蔡桂丰.pdf

：【收稿日期】；【修回日期】【基金项目】珠海市科技计划医疗卫生项目（重大项目）（）【作者简介】蔡桂丰，男，广东潮州人，本科，主任技师，医学检验专业（通讯作者）体外受精囊胚培养液中 拷贝数与囊胚发育潜能的相关性研究蔡桂丰，徐楗荧，阮永铭，曾伟荣，赵琴，许伟标，吴松（珠海市妇幼保健院，珠海 ；亿康基因科技有限公司，苏州 ）【摘要】目的探讨第天发育囊胚（囊胚）培养液中线粒体 （）拷贝数与胚胎质量的关系。方法收集 年 月在珠海市妇幼保健院生殖中心行胚胎植入前遗传学检测（）的 名患者的 枚 囊胚的活检细胞和培养液样本，应用高通量测序（）方法检测分析囊胚活检细胞的非整倍体性和培养液中 拷贝数。根据囊胚形态学评价分为高质量、一般质量、低质量囊胚组，根据囊胚发育时间分为 和 囊胚组，根据染色体整倍体性分为整倍体和非整倍体囊胚组，比较各组间囊胚培养液中 拷贝数的差异。结果 枚囊胚中 囊胚 枚（囊胚组）、囊胚枚（囊胚组）；高质量囊胚 枚（高质量囊胚组）、一般质量囊胚 枚（一般质量囊胚组）、低质量囊胚枚（低质量囊胚组）；整倍体囊胚 枚（整倍体囊胚组），非整倍体囊胚 枚（非整倍体囊胚组）。高质量囊胚组培养液中 拷贝数（）略高于一般质量囊胚组（）和低质量囊胚组（），但差异无统计学意义（）。囊胚组培养液中 拷贝数（）略高于 囊胚组（），但差异无统计学意义（）。整倍体囊胚组培养液中 拷贝数（）略高于非整倍体囊胚组（），差异亦无统计学意义（）。结论不同形态学评级、囊胚发育时间和染色体整倍体性囊胚培养液中 拷贝数无显著差异，胚胎质量与培养液中 拷贝数的关系有待进一步确认。【关键词】囊胚培养液；胚胎质量；高通量测序【中图分类号】【文献标识码】，【】：（）：（），：，生殖医学杂志 年月第 卷第期 ，：，（）（）；（），（）（）（）（）（），（）（）（），（）（）（），（）：，：；（，（）：）线粒体是人体细胞内细胞器之一，在线粒体（）和核 驱动下它们负责细胞能量物质 生产，因此也被称为细胞的能量工厂，同时也参与介导细胞的增殖、凋亡和分化。线粒体自身拥有一套独立的基因组，其拷贝数量取决于细胞内线粒体的数量。在成熟的人类精子中，大约有 个这样的细胞器被包裹在中段周围，而大量的线粒体分布在卵母细胞的细胞质中。受精后，主要遗传自母系卵母细胞的线粒体会发生不对称分离，有研究表明线粒体在发育中胚胎形成的卵裂球中分布不均衡，直到囊胚阶段才自主复制。在人类生殖过程中，生殖细胞的形成和受精、着床前胚胎的发育及胚胎着床都需要大量的细胞能量供给，线粒体对于成功受精和正确的胚胎植入和发育至关重要，含量不足与受精失败和胚胎发育异常有关，。因此，卵母细胞中线粒体的质量决定了卵母细胞的质量，进而决定了发育中胚胎的质量。在辅助生殖技术（）应用中，胚胎质量是影响辅助生殖治疗的一个关键因素。尽管 取得了实质性进展，但评估胚胎生存能力的临床工具几乎没有发展，胚胎学家在选择最佳移植胚胎时仍然依赖于不精确和高度主观的形态学和形态计量分级系统。重要的是，即使在植入前遗传学检测（）筛选到染色体正常胚胎的情况下，仍然有部分移植胚胎无法植入或活产；同时，作为一种有创性的胚胎选择技术对于胚胎的影响也存在争议。年 等 发现，以上的废弃胚胎培养液样本可以检测到 ，证明培养液中含有 是一种常见现象，且与核 相比含量更高。近年来相关学者通过这种无创的方式探究了培养液中 与胚胎发育潜能的关系 ，但研究数量有限，胚胎培养液中 与胚胎质量的关系有待进一步确认。本研究选择了第或天发育囊胚（或 囊胚）培养液，应用高通量测序（）技术检测培养液中 拷贝数，试图了解 拷贝数与常规胚胎形态、非整倍体性和囊胚发育时间的关系，为新的囊胚质量评价指标提供数据支持。资料和方法一、研究对象选取 年 月于珠海市妇幼保健院生殖中心就诊的 名行 的患者为研究对象。名患者获得正常受精并培养发育至期的 枚囊生殖医学杂志 年月第 卷第期胚，采集囊胚活检细胞和培养液。对夫妇均签署了卵胞浆内单精子注射（）和 知情同意书。医院生殖伦理委员会对此研究项目通过伦理审查。二、研究方法 胚胎培养：将成熟卵母细胞进行 后转移至 培养液（，瑞典），后观察双原核（）形成情况。第天（）根据胚胎质量评分，用合适的剥卵针进一步去除 胚胎 的 颗 粒 细 胞，每 个 胚 胎 清 洗 次 后 转 入 培养液（，瑞典）中培养到，再转入单微滴进行培养，每个培养滴，培养至 进行观察并评分。囊胚形态学评价：采用 囊胚评分法 对培养的囊胚进行形态学评估，参考 囊胚分类标准 对囊胚分组：（）高质量囊胚，包括 和 囊胚；（）一般质量囊胚，包括、及 囊胚；（）低质量囊胚，包括、或 囊胚。胚胎活检及培养液的收集：当囊胚发育到期（一般为 ），评估胚胎等级，选择 以上囊胚进行活检。用记号笔在样本采集管上标号，用移液器在需采样的培养液中反复吹吸次后收集胚胎培养液样本（避免吸到油滴），收集个培养滴更换次枪头，避免交叉污染。将样本采集管置于迷你离心机（珠海黑马）上，瞬时离心（，），确保采集的样本置于采集管底，保存。单细胞全基因组扩增（）和 分析：对收集的囊胚活检细胞和培养液进行，然后通过 （文库制备试剂盒；苏州亿康基因）进行文库制备。使用 （货号 ；，美国）对扩增建 库 产 物进行纯化 和 定 量，然 后 使 用 平台（，美国）进行双端 测序，每个样品产生大约 万个测序读数。下机数据进行引物接头和低质量序列的过滤，过滤后的高质量 序列比对到 人类参考基因组，并进行重复 序列去除和碱基 含量校正，剩余唯一比对 使用 分割算法进行拷贝数变异（）分析。含量以 拷贝数核基因组的形式进行量化，即平均每核基因组下 的拷贝数。把比对到线粒体基因组的测序读取序列进行计数，并通过比对到常染色体的读取序列计数进行均一化；根据以下公式计算和显示每个核基因组的 拷贝数：拷贝数（比对常染色体区域数比对线粒体读取序列数量）（比对常染色体读取序列数比对线粒体区域数）。三、统计学分析采用 语言程序（版本）进行统计分析和作图。拷贝数以（?）表示，组间比较采用独立样本方差分析和 检验。以 为差异有统计学意义。结果一、样本分组本次研究共收集到 枚囊胚，其中 囊胚 枚、囊胚枚。根据形态学评估结果，高质量囊胚 枚、一般质量囊胚 枚、低质量囊胚枚。根据胚胎植入前非整倍体遗传学检测（）结果，整 倍 体 囊 胚 枚，非 整 倍 体 囊 胚 枚（表）。二、不同形态学质量评价囊胚培养液中 拷贝数比较根据发育囊胚形态学质量评价分组，检测结果显示质量评价为高质量、一般质量和低质量胚胎组的 拷贝数分别为（），、（），和 （），组间差异无统计学意义（）（图）。三、和 囊胚培养液中 拷贝数比较根据囊胚发育时间分组，检测结果显示 和 囊胚培养液中 拷贝数分别为（），和（），组间差异无统计学意义（）（图）。四、整倍体和非整倍体囊胚培养液中 拷贝数比较根据囊胚活检细胞整倍体性分组，检测结果显示 份囊胚活检细胞中整倍体囊胚和非整倍体囊胚分别为 枚和 枚，其中整倍体组和非整倍体组培 养 液 中 拷 贝 数 分 别 为 （）和（），组间差异无统计学意义（）（图）。生殖医学杂志 年月第 卷第期表囊胚评价指标情况表囊胚编号囊胚发育时间（）囊胚质量评价囊胚活检细胞整倍体性培养液 拷贝数 高质量非整倍体 高质量非整倍体 一般非整倍体 高质量非整倍体 高质量整倍体 高质量非整倍体 低质量非整倍体 低质量整倍体 高质量非整倍体 高质量非整倍体 高质量整倍体 一般非整倍体 高质量整倍体 高质量整倍体 高质量整倍体 高质量非整倍体 高质量非整倍体 高质量整倍体 高质量整倍体 一般整倍体 一般非整倍体 高质量整倍体 高质量整倍体 高质量整倍体 一般整倍体 一般整倍体 高质量整倍体 高质量整倍体 一般整倍体 一般非整倍体 一般整倍体 一般非整倍体 高质量非整倍体 一般整倍体 一般非整倍体 低质量非整倍体 图不同形态学质量评价囊胚组培养液中 拷贝数比较图 和 囊胚培养液中 拷贝数比较图整倍体和非整倍体囊胚培养液中 拷贝数比较讨论优质胚胎的选择是生殖医学技术发展所关注的一个重点问题。虽然现阶段基于胚胎形态学和遗传学的评估已经在辅助生殖临床治疗应用上取得了良好效果，但这些方法仍然存在着一定的局限性，如形态学评估的主观判断差异、胚胎活检细胞遗传学检测的有创性。近年来，胚胎培养液或腔液中遗传物质的发现引起了学者的关注，已有数据表明包括培养液中细胞核 和 可以被成功分离、检测和分析 ，这为胚胎遗传学的无创评估提供生殖医学杂志 年月第 卷第期了基础。目前，针对核 的无创评估已经取得了一定的进展，但是对于囊胚培养液中 的无创评估研究较少。本研究通过 无创检测囊胚培养液中 拷贝数，探究 拷贝数与胚胎质量的关系。一般而言，在当前胚胎评价中形态学质量评分高和整倍体的囊胚具有更好的胚胎质量或发育潜能。本研究尝试探索不同形态学质量评级、不同整倍体性和不同发育时间（）的囊胚培养液中 拷贝数的差异，研究结果与先前的一些研究有所不同。在 等 的两项研究中，其中一项研究比较了 等级与、等级 胚胎培养液中 核 比值，结果显示两者无明显差异；另一项研究结果显示，可以形成囊胚的 卵裂胚培养液中 核 比值显著高于不能成囊的胚胎，且可在 发育至或期囊胚的 卵裂胚培养液中 核 比值显著 高 于 发 育 较 慢 的 胚 胎，表 明 高 核 比值是高发育潜能胚胎的一个参考指标。李亨利等 对卵裂期胚胎培养液中 拷贝数在不同胚胎形态学质量分组中进行了比较，研究结果提示，形态学优质组（以卵裂球数目判定）显著高于非优质组，发育正常速度组显著高于异常速度组，而高评分组与低评分组无显著差异。本研究中，在高质量、一般质量、低质量囊胚以及 、囊胚分组中并未发现培养液中 拷贝数的显著差异。分析其原因可能因为，不同时期胚胎样本、胚胎形态学评价的标准、检测方法和量化方法造成了研究间结果的不一致。等 进一步对囊胚培养液中 进行了研究，多重因素线性回归分析显示，培养液中 拷贝数与囊胚活检细胞 拷贝数（）、女性年龄（）、囊胚评分（）呈显著正相关，但与囊胚染色体整倍体性无明显相关性（），说明囊胚活检细胞 拷贝数、女性年龄、囊胚评分可能是影响培养液中 拷贝数的因素。本研究未进行线性相关性分析，但从不同分组间平均 拷贝数的数据可以看到，从低质量到高质量囊胚呈现上升趋势，但尚无统计学差异，这可能因为本研究中胚胎形态学评价的标准和 拷贝检测方法不同于上述研究。同时也有研究提出，目前囊胚培养液中 来源不明、产量和完整性较低、潜在外源性污染、培养液或囊腔液样本采集标准不统一、数据处理和分析不一致等问题对培养液中遗传信息的无创研究带来了挑战 ，这也可能是影响目前研究结果差异的重要原因。但本研究仍存在一些不足之处：首先，研究纳入的胚胎样本数量较少，导致最后分组间差异较大；其次，未纳入胚胎移植及妊娠结局的相关数据，导致研究结论有一定的局限性。后续应完善实验设计，开展更大样本量的队列研究加以分析。综上所述，不同形态学评级、囊胚发育时间和染色体整倍体性囊胚培养液中 拷贝数无显著差异，胚胎质量与培养液中 拷贝数的关系有待进一步确认。在当前囊胚培养液 拷贝研究数据较少的情况下，本研究为进一步探究囊胚培养液中 拷贝数与胚胎质量关系提供了参考数据。【参考文献】，：，：，：，：，（），：，：，：，：，：，：，：生殖医学杂志 年月第 卷第期 ，：，：，：，：，：，：李亨利，田东梅，侯建文，等 胚胎培养液中线粒体 拷贝数与胚胎质量关系的研究发育医学电子杂志，：，：，：，：，：，：，：，：，：，：，：，？，：，：，：高明，高媛非侵入性胚胎植入前遗传学检测的研究进展中国科学（生命科学），：编辑：罗宏志生殖医学杂志 年月第 卷第期