化学性食物中毒因子检测技术研究进展.pdf

第 4 卷 第 3 期 食 品 安 全 质 量 检 测 学 报 Vol.4 No.3 2013 年 6 月 Journal of Food Safety and Quality Jun.,2013 基金项目:国家科技支撑计划课题(2011BAK10B06)、北京市卫生系统高层次卫生技术人才培养计划项目 Fund:Supported by the National Key Technology R&D Program(2011BAK10B06)and Beijing Municipal Senior Technical Training Plan in Health System*通讯作者:邵兵,研究员,主要研究方向为食品安全保障技术。E-mail:*Corresponding author:SHAO Bing,Professor,Beijing Center for Disease Control and Prevention,No.16,Hepingli Middle Street,Dongcheng District,Beijing 100013,China.E-mail: 化学性食物中毒因子检测技术研究进展 邵 兵1,2*,张 晶1,2,高馥蝶1,2,郭 娟1,2(1.北京市疾病预防控制中心,食物中毒诊断溯源技术北京市重点实验室,北京 100013;2.北京市预防医学研究中心,北京 100013)摘摘 要要:化学性食物中毒因子的确证因其毒物的不确定性和基质的复杂性一直是卫生检验领域的一个难题。本文从目标毒物分析(亚硝酸盐、农药、杀鼠剂、麻醉品及精神药品、生物毒素以及其它药物等)和非目标毒物筛查(样本前处理技术和仪器筛查技术)两个方面综述了当前化学性毒物检测技术的的主要研究进展,介绍了相关方法的原理、应用、不足及发展方向,以期为化学性食物中毒事件处置及未来研究提供借鉴。关键词关键词:食物中毒;毒物;筛查技术 Research advances on toxicological screening techniques for chemical food poisoning accidents SHAO Bing1,2*,ZHANG Jing1,2,GAO Fu-Die1,2,GUO Juan1,2(1.Beijing Key Laboratory of Diagnostic and Traceability Technologies for Food Poisoning,Beijing Center for Disease Prevention and Control,Beijing 100013,China;2.Beijing Research Center for Preventive Medicine,Beijing 100013,China)ABSTRACT:Toxicological screening for chemical food poisoning accident is always a big challenge in the field of analytical chemistry,due to not only the unknown non-target poisoning substance but also the complex sample matrix.This article summarized the main research advance on target toxin detection(nitrites,pesticides,rodenticides,narcotics and psychotropic drugs,biological toxins and other drugs)and non-target toxin screen-ing techniques(sample pretreatment technologies and instrument analytical methodologies)for chemical food poisoning accident.Principles,applications,limitations as well as possible tendency have been discussed.It will provide useful information for the response of poisoning incident and relevant study in future.KEY WORDS:food poisoning;toxin;toxicological screening techniques 食物中毒是指食用了有毒有害物质污染的食品或者食用了含有有毒有害物质的食品后出现急性、亚急性疾病。根据食物中毒诊断标准及技术处理总则GB 14938-94,食物中毒按照致病因子可分为如下四类:微生物性(包括细菌和真菌)、化学性、有毒动植物及不明原因食物中毒。化学性食物中毒是指由于食用了被有毒有害化学物污染的食品、被误认为是食品以及食品添加剂或营养强化剂的有毒有害物质、添加了非食品级的或伪造或禁止食用的食品添加剂和营养强化剂的食品、超量使用了食品添加剂的食品或营养素发生了化学变化的食品等引起的食物中毒。这类中毒具有发病急、626 食品安全质量检测学报 第 4 卷 中毒症状重、原因难查、致死率高等特点。卫生部办公厅通报的数据显示,2011 年我国食物中毒共发生189 起、中毒人数 8324 人、死亡人数 137 人,其中化学性食物中毒发生 30 起、中毒人数 730 人、死亡人数 57 人,化学性食物中毒死亡人数占全年食物中毒死亡人数的 41.6%1。因此,化学性食物中毒所产生的社会影响往往更大。应对这类食物中毒事件时,快速有效地确定致毒物质是后续临床治疗的关键。此外,我国每年都有一定数量的食物中毒事件找不到中毒原因,为此开展食物中毒因子筛查技术研究势在必行。从目标物范围来看,化学性食物中毒因子筛查技术可分为两部分:目标毒物(某一种或者某一类毒物)的快速筛查检测技术以及非目标型毒物筛查确证技术。本文将对这两个方面进行综述。1 目标毒物快速筛查技术 特定有毒有害物质快速筛查技术主要是针对高发、高危及国家规定禁止使用或限量使用的化学物质。常见的有亚硝酸盐、农药、杀鼠剂、国家管制的麻醉药品、精神药品、生物毒素及部分兽药等。1.1 亚硝酸盐 亚硝酸盐摄入体内后会使血液中 Fe2+转化为Fe3+,使正常血红蛋白转化为高铁血蛋白,失去携氧能力,造成急性中毒,可危及生命。我国亚硝酸盐中毒事件发生频繁,最近的几起较大食物中毒事件包括 2010 年 8 月北京某烩面馆亚硝酸盐中毒、2010 年10 月四川海螺沟中毒以及 2011 年 4 月甘肃平凉散装奶中毒事件;2013 年 5 月 7 日,宁波一面馆发生了一起 28 人染病的亚硝酸盐中毒事件。亚硝酸盐的快速检测方法主要采用纸片法,即重氮偶合法2-4。显色剂为固体格利斯试剂(对氨基苯磺酰胺和 N-1-萘基乙二胺),其原理为硝酸盐与对氨基苯磺酰胺重氮化,再与 N-1-萘基乙二胺产生偶合反应,生成紫红色偶氮染料。亚硝酸盐的实验室确证可采用分光光度法或离子色谱法,这也是食品中亚硝酸盐检测的国家标准方法5。此外,毛细管电泳法、液相色谱荧光法也可用于亚硝酸盐的测定6-8。1.2 农 药 中华人民共和国农药管理条例 规定,农药是指具有预防、消灭或者控制危害农业、林业的病、虫、草、鼠和其他有害生物以及能调节植物、昆虫生长的化学合成或者来源于生物、其他天然物质的一种或者几种物质的混合物及其制剂。按照功能和用途分类,农药可分为杀虫剂、杀鼠剂、杀螨剂、除草剂、杀菌剂、植物生长调节剂等;按照组分分类,包括化学性农药(有机氯类、有机磷类、氨基甲酸酯类、苯甲酰脲类等)、植物性农药(除虫菊、硫酸烟碱等)、生物性农药。农药对人体具有不同程度的危害作用。有机氯农药半衰期长、分解困难,容易在人体内富集,可引起慢性和急性中毒,对人体具有神经毒性和肝脏毒性,我国在 1983 年已经禁止使用。杀鼠剂的毒性很大,由其造成的食物中毒在我国时有发生,该部分在下一小节单独讨论。据统计,我国使用的农药中有机磷类大约占70%,其中剧毒、高毒又占七成9。由于有机磷农药的高效性和持久性,其不规范使用造成了很大的安全隐患,特别是蔬菜和果品尤为严重,中毒事件频繁发生。南京某医院 1988 年 1 月2004 年 6 月收治的502 例中毒病例中有 82.76%属有机磷农药中毒10,我国农业部宣布从 2007 年 1 月 1 日起禁止使用甲胺磷、对硫磷、甲基对硫磷、久效磷和磷铵 5 种有机磷农药。目前针对有机磷和氨基甲酸酯类农药的快速测定方法根据检测原理的不同大致可分为两种,一种根据有机磷农药对乙酰胆碱脂酶的抑制作用,另一种方法是建立在特异性抗体识别基础上的免疫胶体金试纸检测方法。快检方法包括速测卡法、酶抑制率法和免疫胶体金试纸法11。其中有机磷和氨基甲酸酯的速测卡法(GBT5009.199-2003)和酶抑制率法(GBT5009.199-2003)已被列为国家标准。农药的实验室确证技术需要采用气相色谱法(gas chromatography,GC)、液相色谱法(liquid chro-matography,LC)、气相色谱-质谱法(gas chromato-graphy-mass spectrometry,GC-MS)12-14、液相色谱-质 谱 法(liquid chromatography-mass spectrography,LC-MS)15,16等实现。其中,GC-MS 技术通过自动质谱去卷积定性系统(automated mass spectral deconvo-lution and indentification system,AMDIS)对目标化合物进行定性分析,构建了常见的 158 种毒性较大、易引起中毒的农药数据库17。该数据库运用于食物及血浆基质中的毒物筛查,并对 2004 年及 2006 年的食物中毒事件中毒基质进行筛查,青菜样品中毒死蜱的检测浓度为 0.69 mg/mL、血浆中毒鼠强的检测浓第 3 期 邵 兵,等:化学性食物中毒因子检测技术研究进展 627 度为 0.02 mg/mL。GB/T 19648-2006 规定了瓜果蔬菜中 500 种农药的 LC-MS/MS 检测方法。Lehotay18,19等通过传统的或改进的基质分散固相萃取方法建立了适用于谷物、水果、蔬菜等多种食品基质中多种农药的液相色谱-质谱法和气相色谱-质谱法,方法简单、快速,适于食品基质中多种农药的检测。1.3 杀鼠剂 杀鼠剂是通过口服、熏蒸等方式消灭或驱赶鼠类的化学品,在我国已有很长的使用历史。杀鼠剂在成为灭鼠主要工具的同时,也是造成人体中毒的一类重要化合物,尤其是在我国农村地区。有机合成杀鼠剂主要包括七类:(1)有机氟类:如氟乙酰胺、氟乙酸钠、甘氟等;其中氟乙酸钠、氟乙酰胺的大鼠经口的半数致死量(Lethal Dose 50%,简称 LD50)分别为 0.1 mg/kg 和 5.75 mg/kg,且会导致二次中毒和较强的生态毒性20。我国已明确规定禁止生产和使用该类药物,但是由于生产成本低廉,不法商贩为牟取暴利仍会违规生产。(2)含氮杂环类:毒鼠强、三环唑等。(3)香豆素类:如华法林、溴敌隆等。(4)茚二酮类:如敌鼠、氯敌鼠等。(5)有机磷类:如毒鼠磷、溴代毒鼠磷等。(6)氨基甲酸酯类:如灭鼠安、灭鼠优等。(7)硫脲类:如安妥、双鼠脲等。报道较多的杀鼠剂中毒主要为毒鼠强、氟乙酰胺、敌鼠等。现场快检方法包括变色酸法(毒鼠强)、异羟肟酸铁反应法(氟乙酰胺)、三氯化铁定性检测法(敌鼠)等21。杀鼠剂的实验室确证通常采用 GC、GC-MS等22,23。李家涛等24利用 Florisil 固相萃取净化技术,建立了毛细管气相色谱法同时快速检测果蔬食品和土壤中毒鼠强、氟乙酰胺和 8 种氨基甲酸酯类农药、2 种有机磷农药的多残留分析方法,检出限为0.150.02 mg/kg。徐小明等25利用 GC-MS 通过组接两种不同极性的毛细管柱第一次实现了血、尿、呕吐物中的氟乙酰胺和毒鼠强的同时检测。近年来,LC-MS 也被用于杀鼠剂的测定,Owens 等26建立了牛奶、果汁、茶等饮料中毒鼠强的 LC-MSMS 快速检测方法,该方法比GC-MS的定量限低0.05 g/mL。1.4 麻醉药品和精神药品 麻醉药品是指具有依赖性潜力,不合理使用或者滥用可以产生身体依赖性和精神依赖性(即成瘾性)的药品、药用植物或者物质,包括天然、半合成、合成的阿片类、可卡因、大麻类等。精神药品是指作用于中枢神经系统使之兴奋或者抑制,具有依赖性潜力,不合理使用或者滥用可以产生药物依赖性的药品或者物质,包括兴奋剂、致幻剂、镇静催眠剂等,包括第一类精神药品和第二类精神药品。2007 年国家食品药品监督管理局、公安部和卫生部公布了最新的麻醉药品和精神药品目录,包括麻醉药品 123 种,其中25种是我国生产和使用的;精神药品132种,第一类精神药品 53 种(我国生产和使用的有三唑仑、司可巴比妥、哌醋甲酯、马吲哚、丁丙诺啡等 7 种),第二类精神药品 79 种(我国生产和使用的有阿普唑仑、巴比妥、地西泮、艾司唑仑、氟西泮等 33 种)。麻醉药品和精神药品需要国家相关部门的严格控制和监督使用,防治和控制药物滥用或流向不法渠道,造成严重社会危害。麻醉药品和精神药品常被用于自杀及犯罪活动,最典型是苯二氮卓类药物,这是一类临床用于治疗失眠、焦虑、癫痫的精神药物,代表药物包括地西泮(安定)、奥沙西泮等。这类药物常用的检测方法是GC-MS 和 LC-MS,Cartiser 等27采用液液萃取和GC-MS/MS 方法同时检测动物肝脏、心脏等组织及血液、尿样等生物体液中去甲西泮、奥沙西泮、地西泮和替马西泮的含量,Ishida等28,29构建了血浆中同时检测 43 种苯二氮卓类药物及其代谢物的 LC-MS确证方法。自动固相萃取技术与检测仪器联用可有效提高分析效率和方法的精密度,Choi 等30采用RapidTrace 自动化固相萃取处理系统通过 GC-MS有效确定了尿液等生物体液和头发中安非他明、苯甲吗啉等烷基苯胺类精神药物含量。随着质谱技术的发展,串联质谱被广泛运用于药物的检测中,有效提高了方法的准确性。常用的有三重四级杆串联质谱4、四级杆-飞行时间质谱31、四级杆-线性离子肼质谱32等。1.5 生物毒素 生物毒素是一大类生物活性物质的总称,是由动物、植物和微生物等产生的对其它生物物种有毒害作用并不可复制的化学物质。已知化学结构的生物毒素有数千种,根据生物毒素的来源,可以分为动物毒素、植物毒素和微生物毒素。动物毒素是由分子量大小不同的物质的混合物,包括数目不等的多聚肽、酶和胺类等,被包含在特定的软组织中33。目前已知,大约有 1200 种动物能分泌毒液或有毒素,涉及了除628 食品安全质量检测学报 第 4 卷 鸟类以外的所有动物的门和纲34。植物毒素按其致毒成分分为酚类化合物、生氰化合物、生物碱、萜类化合物以及酶、多肽和氨基酸等。在整个植物界有许多植物是有毒的,据不完全统计,在世界各地分布的有毒植物约 118 科 866 属 1900 多种,我国有毒植物约有 402 属 1300 种35。微生物毒素是微生物在生长繁殖过程中产生的一类次级代谢产物。目前已知产毒素的真菌近 200 种,真菌毒素有 150 多种36。由于生物毒素的独特结构及不易找到解毒剂等特点,建立快速、高特异性的检测方法尤为重要。目前,主要的检测方法主要包括高压液相色谱法(high pressure liquid chromatography,HPLC)、质谱检测法和免疫检测法。Chiavaro 等37利用反相 HPLC 对食品中的黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2 和 M1 进行同时测定,对前四种毒素的检出限为 0.3 g/kg,对 M1 的检出限为 0.0005 g/kg。McNabb 等38用 LC-MS 对绿色壳贻贝、东部牡蛎、太平洋牡蛎和文蛤四种贝类中的 六 种 双 鞭 甲 藻 神 经 毒 素 进 行 定 量 分 析。DellAversano等39应用 LC-MS对高毒麻痹性贝类毒素进行快速检测。Brandon 等40采用电化学发光免疫法检测蓖麻毒素污染的鸡蛋。Cho 等人41对全血中的河豚毒素进行了检测,采用 LC-MS 进行分析,方法定量限为 0.32 ng/mL。1.6 其他药物及兽药 中华人民共和国药品管理法 规定药品是用于预防、治疗、诊断人的疾病,有目的地调节人的生理机能并规定有适应症或者功能主治、用法和用量的物质。兽药是指预防、治疗、诊断动物疾病或者有目的地调节动物生理机能的物质。正常使用时,药品和兽药对人体不产生毒害作用。但是由于药物滥用或者相关知识的缺乏易导致人体伤害,有些甚至是致命性的。-激动剂是-肾上腺受体激动剂的简称,指含氮激素中的苯乙胺类药物,临床中主要用于平喘。克伦特罗作为动物饲料喂养动物可以明显促进动物生长,改善脂肪和肌肉的分配比例,提高瘦肉率。20 世纪 80 年代,我国将克伦特罗错误地作为饲料添加剂向养殖户及工厂推广。自从欧洲国家发生多起克伦特罗中毒事件,我国已经禁止使用,但是目前仍然存在非法添加。克伦特罗对人体具有极强的毒性,临床表型为肌肉振颤、心动过速、心悸和紧张等,对人体骨骼肌、心脏、肝、肾功能有显著影响,而且存在生殖分泌毒性;同时,克伦特罗是世界反兴奋剂条例中明文规定在体育竞技活动中禁用的兴奋剂。在我国,由于肾上腺受体激动剂使用不当造成的中毒事件屡见不鲜,如 2006 年 9 月上海的连续发生的瘦肉精食物中毒事故,波及 9 个区、300 多人;2009 年广州瘦肉精中毒事件,累计中毒人数达 70 人42。药物残留的快速筛查方法主要是免疫学快速检测方法,如酶联免疫吸附法和胶体金免疫分析等43。目前,受体激动剂、常用抗生素类均有商品化的检测试剂盒(试纸条)等。这类产品在现场抽检中可发挥较大的作用,如克伦特罗检测试纸条的检出限为 3 ng/mL,覆盖的样品基质包括动物尿液、猪肝、猪肾、瘦肉组织等,整个检测过程仅需 510 min。另外,生物传感器技术也被用于药物快速筛查44。由于药物普遍具有一定的极性和水溶性,其实验室检测主要有赖于 LC 和 LC-MS 技术,如 Ortelli 等45采用超高压液相色谱-飞行时间质谱法(high pressure liquid chromatography time of flight mass spectrography,HPLC-TOF-MS)检测牛奶中 150 种兽药。2 非目标毒物的快速筛查技术 由于食物中毒通常是原因未知的,很难对中毒物质进行准确判定和归类,所以,现有的试剂盒(试纸条)等速测法虽然在某些事件的应对中起到了关键作用,但仍具有很大的局限性。因此,针对特定中毒因子的检测方法很难满足不明原因食物中毒的快速诊断需要。构建高通量的食物中毒因子快速筛查方法变得尤为重要。高性能的高通量快速筛查技术必须具备方便快捷、目标物回收率高的前处理方法,还需采用具备分离度好、灵敏度高的检测方法。2.1 前处理方法 中毒因子筛查技术开发要求目标物覆盖面广,必须包括不同种类、不同理化性质的多种化合物。因此,需要开发多组分、损失少,快速简单的前处理方法,前者是为了尽可能地不遗漏和丢失目标物质,确保信息的准确可靠;后者则是应急检测节省时间的需要,争取实现第一时间判定目标,挽救患者的生命。目前,常用的前处理方法包括液液萃取技术(liquid-liquid extraction,LLE)、固相萃取技术(solid phase extraction,SPE)以及在线固相萃取(on-line SPE)第 3 期 邵 兵,等:化学性食物中毒因子检测技术研究进展 629 技术。对于饮用水、饮料等样品及部分尿样在做液相色谱分析时可直接进样,或做简单稀释后进样分析。Anton 等46将尿样用初始流动相稀释 10 倍后取5 L 用于 LC-MS 检测,筛查目标物包括喹诺酮类、磺胺类、硝基咪唑等 8 大类 108 种药物,检出限为0.345 g/L。LLE 是传统的样品前处理技术,具有操作简单、成本低廉等特点。现有的报道表明,乙腈是提取多种农药、杀鼠剂和药物的最好溶剂,可同时提取有机氯、有机磷、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类农药、镇静剂类药物及杀鼠剂等35。张秋萍等47和叶海媚等48分别用乙腈提取了呕吐物等样品中的镇静剂和杀鼠剂。Lee 等4采用分段提取的方式同时分析了尿液中的300多种常用药物及其代谢物,将待测尿液分为两份,一份用醋酸钠缓冲液调节到 pH 3.5,使用提取液(二氯甲烷:己烷:乙醚:异戊醇,30:50:20:0.5,v/v/v/v)提取酸性组分;另一份用饱和四硼酸二钠溶液调节pH 99.5 提取碱性组分,300 余种目标分析物的最高回收率为 102%、平均回收率为 46%。SPE 是生物样本和食品样本等复杂基质中污染物分析最主要的前处理手段。有研究者采用瓦里安NexusTM系列 SPE 小柱从尿液中提取净化包括利尿剂、-阻断剂、兴奋剂、合成类固醇类等的 49 种药物,回收率达79%49。Ishida等26采用FocusTM(Varian)非特异性 SPE 柱提取净化了血浆中的 43 种苯二氮卓类药物(包括唑吡坦和唑吡酮两种代谢物),平均回收率为 87.1%。实验过程中采用 0.1%TFA-乙腈溶液(酸性)及 0.2%乙腈氨(碱性)两次洗脱,合并后上机,作者认为这种小柱的疏水作用、偶极作用、氢键作用的联合确保了良好的净化效果。Choe 等50采用RapidTrace SPE 小柱对全血进行净化处理。由于牛奶样品中蛋白含量较高,作者先采用乙腈酸法(pH 3.06.0)除蛋白后再采用超滤、SPE 进一步纯化,实现了 150 种药物的同时提取。Ortelli 等51研究了采用超滤法对牛奶中150种兽药的快速检测的影响,最低检测限达 0.5 g/L。QuEChERS(Quick,Easy,Cheap,Effective,Rugged 和 Safe 的简称)方法是近几年发展起来的快速前处理法,可以方便、经济、快速地从食品基质中将目标化合物提取出来。该方法主要用于农产品及与农药相关的土壤中农药残留的分析。Carneiro 等52应用改良的 QuEChERS 方法进行提取,应用液质联用仪实现了香蕉中 128 种农药的快速检测。Rouvire等53采用 QuEChERS 提取方法对土壤中的有机氯农药进行快速提取,并将该方法与加速溶剂萃取(accelerated solvent extraction,ASE)提取方法进行比较,认为前者提取效率更好,更加简便、快速。目前,QuEChERS 方法在兽药残留领域的应用还较为有限。Aguilera-Luiz 等54应用缓冲盐体系的 QuEChERS 方法对婴儿食品中的 29 种兽药进行检测。Lopes 等55对鱼肉中的 32 种不同类兽药进行快速处理,采用串联四级杆质谱仪检测,该方法灵敏、稳定。On-line SPE 技术是通过阀切换实现的一种样品在线富集和净化技术,通常与 LC或 LC-MS联用,该技术改善了传统 SPE 耗时、费力的特点,具有天然的优势,目前在饮用水中痕量污染物的检测方面应用较多。Sturm 等56使用限进型填料的 Spark Holland在线 SPE 小柱,同时检测了人血清和尿液中的 365种药物,有三分之二的药物检出限低于 100 g/L。2.2 检测技术 未知毒物的筛查和确证的顺利进行必须要有特异性好、灵敏度高的仪器检测技术。对于有机毒物而言,其特征的化学信息是实现准确定性的切入点,包括光谱信息和质谱信息等。在此,我们就紫外光谱技术、GC-MS 和 LC-MS 技术进行说明。2.2.1 紫外光谱技术 紫外-可见吸收光谱是有机化合物的特征谱图之一。通过光谱图的比对可以初筛和判定中毒物质。20世纪 90 年代由美国 Bio-Rad 公司推出的快速广谱药物检测系统(automated rapid emergency drug profiling system,REMEDi HS)是一种广谱的临床药物快速检测系统,涵盖 900 多种药物及代谢产物数据,包括了中性药物、碱性药物和少量的弱酸性药物。该系统运用高压液相色谱技术和紫外全光谱技术获得物质的保留时间及全紫外吸收光谱实现定性检测。系统将检测到的全紫外吸收光谱和相对迟留时间与系统库中的标准进行二维数据对比,计算出二者间的相似系数(similarity factor,SF),SF 越小,相似性越大。当 SF0.02 时,系统即作阳性指定,整个过程仅需 30 min。20 世纪末,REMEDi HS 系统被广泛运用于药物中毒的快速筛查57。该系统发展成熟,要求的前处理630 食品安全质量检测学报 第 4 卷 方法简单,只需除去颗粒性杂质即可进样检测;检体可以为血清、尿液或胃内容物、组织脏器等58。苯二氮卓类药物及其代谢物由于热不稳定性不适于GC-MS检测,但多位研究者通过该技术实现了血样、尿样中这类药物的快速筛查59,60。董雪松等61运用REMEDi HS 系统快速筛查 600 余例急性药物中毒,中毒频率较高的前 5 类药物分别是:抗精神病药、苯丙胺类兴奋剂、阿片类毒品、三环类抗抑郁药、苯二氮卓类镇静催眠药。孙成文等60利用该系统实现了20 余种苯二氮卓类药物的快速筛查检测;此外,作者还将 REMEDi HS 系统用于 36 例疑似有机磷农药中毒患者的筛查确证,获得了满意的效果62。2010年 4 月发生在北京怀柔区某度假村的食物中毒事件就是通过 REMEDi HS 系统初步锁定了毒物“可乐定”。乐果是常用的农药,但同时也是人体乙酰胆碱酯酶抑制剂,误食或者其残留量高会威胁生命,采用REMEDi HS在205300 nm处检测其紫外吸收,快速确诊了乐果中毒事件48。REMEDi HS 虽然能对中性、碱性、热不稳定性药物实现快速筛查,但是检测范围有限,不能检测无紫外吸收的物质,检测受基质干扰较为明显,灵敏度和选择性有待提高。此外,系统中包含的药物种类为900 余种,与现有的药物生产和使用种类相比仍然相对有限。该系统目前已停产。2.2.2 GC-MS 技术 随着质谱技术的发展,通过质谱数据库的比对查询来确认未知化合物变得相对简单易行。通过该技术实现中毒因子的快速筛查是现阶段最有效的途径之一。GC-MS 具有与之相匹配的有机质谱数据库,该技术也是到目前为止最为成熟的技术,是未知毒物筛查确证的金标准。现有商品化的质谱库包括美国国家标准研究所的NIST 11质谱库(210000余种化合物,240000 余张谱图)和 Wiley 质谱库(300000 余种化合物,400000 余张谱图),基本涵盖了常见挥发性毒物。目标样品经过一定的前处理后,进行 GC-MS 分析、再采用 NIST 数据库检索,进行搜索比对,系统根据质谱碎片的匹配度给出可能的定性结果。该技术的优势为谱图覆盖面广、信息量大,并适用于不同制造商的 GC-MS 系统,使用较为方便,已被广泛应用于刑侦、食品安全、环境等领域。2007 年,黎乾等63建立了信息型常见毒物质谱库,并应用于法医鉴定中,该库所涵盖的 1000 余种毒物的质谱数据即基于 NIST 数据库基础的筛选和整合,该库需与 GC-MS 联用,可用于毒物的筛查和鉴定。随着高分辨质谱技术的发展,利用 TOF 等质谱的高分辨特点,采用标准品信息构建气相色谱-飞行时间质谱(gas chromatography time of flight mass spectrography,GC-TOF-MS)快速筛查数据库的方法正在研究中,这也将切实提高 GC-MS 毒物筛查的准确性和特异性64。尽管如此,由于分离技术的局限,GC-MS 对于难挥发、强极性、热不稳定化合物还没有一个综合的解决方案。虽然 NIST 质谱库和 Wiley 质谱库包括了很多极性化合物衍生物的谱图信息,但是因为衍生步骤本身的不稳定性和局限性,难挥发、强极性化合物的 GC-MS 筛查效果一直欠佳。考虑到许多毒物通过人体代谢后,一般是以代谢物的形式存在,代谢物的亲水性和极性往往增加,均不适合于 GC-MS筛选。2.2.3 LC-MS 技术 对于难挥发、强极性、热不稳定化合物,目前的确证一般采用高压液相色谱-串联四极杆质谱(high pressure liquid chromatography-tandem quadrupole mass spectrometry,HPLC-MS/MS)、液相色谱-串联四极杆/飞行时间质谱(high pressure liquid chromato-graphy-quadrupole-time-of-flight mass spectrometry,HPLC-Q-Tof)等技术。然而,由于 LC-MS 主要采用软电离的方式,而且不同公司的液相色谱质谱的质谱设计原理不同,参数不同,没有统一的质谱图,各个公司得到的质谱图差别可能很大;同一公司的仪器在相同条件下质谱图也不尽相同。在同一个电离模式下,各离子的丰度比可能有差别,但是具体到某一型号的仪器,同一化合物的质谱信息应该是相同的。同一化合物在不同型号、不同公司的仪器得到的质谱图准分子离子峰和质谱碎片应该具有可比性,可用于快速筛选,再与中毒症状的判断结果进行综合,同时通过液相色谱色谱柱、流动相条件、保留时间等参数,可以进行定性确证。基于以上原因,尽管目前没有统一的、商品化的液相色谱-质谱数据库,但是各大仪器公司(Waters,ABI,Aglient,Thermo 等)在软件开发时都保留了用户自建谱库的功能。其中,ABI 公司在毒物筛查时先对第 3 期 邵 兵,等:化学性食物中毒因子检测技术研究进展 631 谱库中包含的指定离子对进行质谱多反应监测模式(multiple reaction monitoring,MRM)扫描,再通过扫描方式切换对达到域值的化合物进行二级碎片离子扫描,通过图谱进行检索,完成对未知毒物的筛选和确证,目前可同时快速分析 1000 余种化合物,由于MRM 定量、灵敏度和选择性较高,已经在法医毒物鉴定、中毒抢救和残留监测中得到成功应用。但是,这种筛查方式不能获得谱库中不包含的毒物信息,容易造成遗漏,具有一定的局限性。现有的 LC-MS 都采用软电离技术,如电喷雾离子源(electron spray ionization,ESI)、大气压化学电离源(atmospheric pressure chemical ionization,APCI)等,通过源内碰撞诱导解离可获得化合物不同的质谱信息,对相同条件下标准物质和未知物质源内碰撞诱导解离质谱图进行分析比较,可起到判定筛选的作用。Mueller 等65应用在线湍流色谱-质谱联机建立尿液中 356 种化合物的质谱库,此方法快速、灵敏、应用范围广。北京市疾病预防控制中心依据此原理开发了一套基于液相色谱串联四级杆质谱技术的含 1000余种常见毒物(药物)的质谱库,成功用于多起食物中毒和非法添加物案件的侦破过程。谱图的采集使用全扫描模式,扩大了毒物的检测范围。与串联四级杆质谱相比,飞行时间质谱等高分辨质谱具有更高的质量数分辨率和扫描速度,全扫模式下能够在一次运行中实现几百种甚至上千种未知物质的同时筛查66。因此,这些技术对于不明原因的食物中毒因子的筛查具有突出优势,更适合未知毒物的检测。2009 年,香港屯门医院、威尔斯亲王医院、伊利沙白医院、哥本哈根大学和 Waters 公司开展联合攻关,建立了一套尿液中基于现代质谱技术的广谱毒理学筛选技术,该技术具有比 REMEDi HS更广的筛选范围、更高的灵敏度和极低的误判率。此外,该技术近来也被用于食品基质中农、兽药残留以及环境样品中痕量污染物的高通量检测。Thurman 等67建立了 600 余种农药的飞行时间质谱数据库,用于蔬菜、水果中农药的筛查研究。Peters 等68建立了鸡蛋、鱼肉、猪肉中的约 100 种兽药的检测方法。飞行时间质谱用于毒物的快速筛查将是学科发展的主要方向之一。Zhang 等69在 12 min 内,实现了对简单基质中 510 种农药的检测。样品的提取和净化采用QuEChERS方法,检测器为Thermo orbitrap高分辨质谱,检出限低于 10 g/kg。Gmez-Prez 等70采用Orbitrap质谱仪建立了具有高质量精度的质谱数据库,并应用其进行了蜂蜜中农药和兽药的筛查,方法的检出限范围为 150 g/kg。由于不同的检测技术都有其优越性和局限性,因此,实际样品筛查确证时通常需要两种甚至多种检测技术联合使用,以确保分析结果的准确性和全面性。Lee 等71对阳性样品同时采用了 GC-MS、高压液相色谱-二极管阵列检测法(HPLC-DAD)、HPLC-MS/MS、HPLC-TOF-MS 进行了检测,并对几种方法的结果进行了比较。Valli 等采用 GC-MS 和REMEDi HS 实现了尿样和血样(包括血浆和全血)中药物及其代谢物的快速筛查72。3 结 语 食物中毒是最严重的食品安全事件,是现阶段我国公共卫生食品安全领域的主要问题之一。食物中毒事故的发生不仅严重危害人们的身体健康,而且造成不良的社会影响。第一时间确定中毒原因是应对化学性食物中毒突发事件的关键,因此开展有效、合理、快速、灵敏的化学性食物中毒解析技术研究,有利于中毒事件的应对和溯源,从而起到正确处置、预防其再度发生的作用。中毒因子的筛查和确证一直是卫生检验领域研究的重点和难点之一。目标毒物的快速检测产品和方法在化学性中毒因子确证中发挥了重要的作用,但都有其局限性。目前,商品化的非目标筛查技术有基于紫外检测的 REMEDi HS 系统及基于 GCMS 的NIST 质谱库和 Wiley 质谱库;REMEDi HS 系统灵敏度低且只适用于有紫外吸收的物质,而气相色谱质谱技术不适于难挥发、强极性、易热解的有毒有害物质。LC-MS 技术对于难挥发、强极性、热不稳定毒性化合物的分析具有一定的优势,是未来毒物筛查技术的发展方向之一。多种检测手段的联合使用可提高未知毒物筛查确证的效果。参考文献 1 卫生部办公厅关于 2011 年全国食物中毒事件情况的通报.http:/ of food poisoning cases in China,2011 by the office of the Ministry of Health.http:/ 食品安全质量检测学报 第 4 卷 2 张洁,陈晓敏,徐桂花,等.亚硝酸盐快速检测试纸的研制J.食品科技,2010,8(4):344346.Zhang J,Chen XM,Xu GH,et al.Development of a test paper for rapid detection of nitrite J.Food Sci Technol,2010,8(4):344346.3 林凯,陈裕华,罗若容,等.餐检中亚硝酸盐快速检测方法的探讨J.职业与健康,2007,23(22):20512052.Lin K,Chen YH,Luo RR,et al.Quick determination of nitrite in food inspection J.Occup Health,2007,23(22):20512052.4 Lee SW,Choi JH,Cho SK,et al.Development of a new QuEChERS method based on dry ice for the determination of 168 pesticides in paprika using tandem mass spectrometry J.J Chromatogr A,2011,1218(28):43664377.5