四至丸治疗膝骨关节炎的网络药理学作用机制研究.pdf

中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 收稿日期：2023 年 12 月 21 日 作者简介：周小力（1999），女，汉族，四川泸州人，研究生，中医师，研究方向为风湿免疫临床。-208-四至丸治疗膝骨关节炎的网络药理学作用机制研究 周小力 成都中医药大学，四川 成都 610075 摘要：摘要：目的 以网络药理学方法为基础，分析四至丸治疗膝骨关节炎（KOA）的潜在作用机制。方法 通过中药系统药理学分析平台（TCMSP）获取药物的活性组分，利用 PubChem 数据库、Swiss Target Predictio 数据库预测潜在靶标；用 Genecards 数据库、OMIM 数据库、DisGeNET 数据库搜寻“knee osteoarthritis”KOA 靶标，绘制韦恩图，得到四至丸与 KOA 交汇靶标；基于 STRING 数据库构建药物与疾病共同靶标的蛋白互作(PPI)网络，获得关键靶标信息；利用 Cytoscape 软件构建“药物-成分-靶标”网络；利用 DAVID 数据库对药物及疾病靶标进行 GO（gene ontology）分析、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析。结果 通过 TCMSP检索共获取药物活性成分 42 个，药物靶点 538 个，作用于 KOA 的潜在靶标 162 个，关键靶标有 28 个，GO 功能富集分析显示四至丸参与炎症应答、胞质钙离子浓度的正调节、蛋白激酶 B 的正向调节等生物过程，涉及 AGE-RAGE、细胞凋亡、HIF-1、破骨细胞的分化、TNF、PI3K-Akt 等 165 条信号通路。结论 使用网络药理学研究方法，初步探明四至丸调控炎症、保护关节软骨从而治疗 KOA 的潜在机制。关键词：关键词：四至丸；关键靶标；信号通路；膝骨关节炎；网络药理学 中图分类号：中图分类号：R285 膝骨关节炎（KOA)在病程中常有软骨、软骨下骨改变、滑膜发炎、半月板变形等表现1。这些疾病表现的伴随对于患者极其家庭都是极大的负担。KOA 归属“骨痹、膝痹”之类，素问.长刺节论强调寒邪侵入筋骨，致四肢筋骨疼痛、活动受限制，称为骨痹。诸病源候论.虚劳膝冷候强调的是肾虚受邪，筋骨失养，膝骨痹则发。医家多认为这个病为“本虚标实”之属，且与肾、肝、脾有关2-3。四至丸4（女贞子、墨旱莲、淫羊藿、当归）是四川省名中医高永翔教授在经典名方二至丸的基础上5，根据临床经验加味而成，但无研究阐明四至丸对防治 KOA 的作用机制，故本文以网络药理学为基础，从整体上分析四至丸治疗 KOA 的可能作用靶点及途径，以后造福于广大患者。1 方法 1.1 四至丸的活性组分、靶标 登录 TCMSP 数据库，以女贞子、墨旱莲、淫羊藿、当归为关键词，检索有效成分，用口服给药利用度（OB）30、类药性（DL）0.18 来筛选有效成分，通过PubChem 数据库、化源网检索获得 SMILES 结构式、2D结构，用 Swiss Target Prediction 数据库预测药物靶点，将整合后的药物靶标用 UniProt 进行标准化处理。1.2 KOA 靶标 分别登录 Genecards、DisGeNET、OMIM，以“knee osteoarthritis”为关键词检索，获得 KOA 靶标，将以上数据库结果整合删除重复项，即可获得。1.3 组建药物-疾病交汇靶标、构建药物-活性组分-功能靶标 登录 Venny2.1 软件，将四至丸的成分靶标与 KOA靶标导入，获得四至丸成分治疗 KOA 的潜在靶标。将交集靶标、药物成分导入 Cytoscape3.7.2 软件中，构建药物-活性组分-功能靶标网络图。1.4 蛋白相互作用网络建设（PPI）登录 STRING 数据库平台，导入交集靶标，构建蛋白相互作用网络（PPI），并将该网络导入 Cytoscape软件，进行处理，获得关键基因。1.5 GO 富集与 KEGG 通路富集 将四至丸与 KOA 交集靶点导入 DAVID 数据库，物种选择为 homo sapiens，P0.01，进行 GO 分析、KEGG富集分析，获得结果后，应用微生信平台绘制气泡图进行可视化分析。2 结果 中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生-209-2.1 四至丸活性成分及靶点筛选 在 TCMSP 数据库中检索，用 OB30、DL0.18进行筛选，得到女贞子、墨旱莲、淫羊藿、当归活性成分分别为 13、10、23、2 种，删除重复项，共有有效成分 42 种。上诉活性成分通过 Swiss Target Prediction 数据库预测得到 538 个靶点。2.2 KOA 相关靶点的收集 将从 Genecards 数据库检索获得 1408 个靶点，368个靶点从 DisGeNET 数据库里获得，30 个靶点从 OMIM数据库查得，将以上靶点合并去重，得到 1556 个疾病靶点。2.3 四至丸与 KOA 交集靶点、药物-靶点-疾病网络图的构建 将四至丸药物活性成分靶点与 KOA 的疾病靶点导入 Venny2.1 平台，获得 162 个交集靶点，建立属性文件和网络文件，导入 Cytoscape3.7.2 软件构建药物-靶点-疾病网络图，见图 1。图 1 药物-靶点-疾病网络图 图 2 四至丸与 KOA 靶点的 PPI 网络图 图 3 四至丸干预 KOA 的关键靶点 图 4 四至丸治疗 KOA 的 KEGG 通路富集 2.4 PPI 网络分析结果 将四至丸活性成分与 KOA 疾病的 162 个交集靶点导入 STRING 数据库，下载文件，导入 Cytoscape3.7.2软件，经处理，得到可视化图，见图 2，有 162 个节点，2425 条边，根据 CentiScape 计算网络节点的拓扑参数，获得关键靶点，筛选后有 28 个节点，324 条边，见图 3。2.5 GO 富集分析、KEGG 通路富集分析结果 通过 DAVID 数据库进行 GO 富集分析，搜集到 907条，83条为细胞组成条目，155条为分子功能条目（MF），669 条为生物过程条目（BP）。对 GO 富集分析结果进行整理，结果显示，BP 相关条目包括炎症应答（inflammatory response）、胞质钙离子浓度的正向调节（positive regulation of cytosolic calcium ion concentration）、蛋白激酶 B 的正向调节（positive regulation of protein kinase B signaling）等；CC 的相关条目包括细胞质膜（plasma membrane）、整合膜蛋白（integral component of plasma membrane）；MF 的相关条目包括酶结合（enzyme binding）、蛋白质 丝 氨 酸/苏 氨 酸/酪 氨 酸 激 酶 活 性（protein serine/threonine/tyrosine kinase activity）等）；KEGG 通路富集分析通过 DAVID 数据库进行，搜索到结果共 165 条。在 p 值排序的基础上，我们选取了前 25条路径，见图 4。结果显示涉及 KOA 的主要途径是AGE-RAGE 信号途径、细胞凋亡、HIF-1 信号途径、破骨细胞分化、TNF、PI3K-Akt 信号途径等。3 讨论 本研究结果显示，四至丸治疗 KOA 的关键靶点可能是 MMP2、NFKB1、STAT3、TP53、JUN、HIF1A、MMP9、TNF 等。现代医学认为，膝关节软骨破坏的进展与 KOA的发生、发展密切相关，而软骨的破坏程度又与炎症中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生-210-水平、基质金属蛋白酶（MMPs）的表达存在相关性。大量研究证实，MMPs 在 KOA 发挥着重要的作用。TNF 等炎性因子的表达明显上升，MMPs 的表达也会提升6-8，如MMP9、MMP2 等，同时 STAT3 的表达也会增加，STAT3表达增加，会进一步推动 MMP9 表达提升，加剧软骨破坏9。在炎症等各种因素的刺激下，NF-B 通路激活，也会引起关节软骨破坏，同时还会促进多种炎症因子的表达。TP53 参与 KOA 的方式可能是通过调控软骨细胞凋亡10-11。缺氧诱导因子 1（HIF1A）也与炎症反应相关，参与缺氧应答、生理代谢、细胞增殖、机体凋亡和血管生成等过程12。JUN 是可以发挥其转录因子作用，参与到 KOA 的发生发展中。有研究证明，通过下调 HIF1，膝关节组织中的炎症因子得到显著降低，JUN 蛋白的表达水平也伴随下降，从而起到降低骨关节组织的损伤的作用13。综上，KOA 的发生、发展是复杂的多机制共同作用下的结果。KEGG 通路富集分析发现主要涉及膝骨关节炎的通路包括 AGE-RAGE、细胞凋亡、HIF-1、破骨细胞分化、PI3K-Akt、TNF 等信号通路。RAGE（晚期糖基化终末产物受体）的激活涉及包括炎症途径在内的多个途径，是软骨退变的特征之一14。软骨细胞的凋亡，会导致软骨活力的下降，进而软骨破坏。KOA 病程中破骨细胞分化会导致病变的关节发生骨降解，加重病情；HIF-1信号通路可以通过调控炎症因子发挥保护膝关节的作用；PI3K-Akt 信号通路是成骨细胞分化的重要通路。TNF 信号通路会激活多种信号，诱导其他细胞因子参与炎症反应，是 KOA 发生发展的始动环节，也是关节损伤中起重要作用的其他途径激活后的进一步结果，在关节损伤中扮演重要角色。4 总结 本研究借助网络药理学对四至丸的作用机理进行了初步的明确，后续研究将通过相关细胞、动物实验进行验证，以进一步探索四至丸对膝骨关节炎的作用机制，为临床治 KOA 提供依据。参考文献 1ZHAO X,MENG F,HU S,et al.The Synovium Attenuates Cartilage Degeneration in KOA through Activation of the Smad2/3-Runx1 Cascade and Chondrogenesis.2陈晨.温经通络汤治疗膝骨关节炎(寒湿痹阻证)的临床观察D.南京:南京中医药大学,2020.3石佳.补肾活血汤治疗肾虚血瘀型膝骨性关节炎的网络药理学研究及临床疗效观察D.天津:天津中医药大学,2021.4魏蜀君,付康华,何青蔓,等.基于网络药理学探讨四至丸治疗绝经后骨质疏松的作用机制J.中药与临床,2020,11(04):15-20.5 王浩,庄威,薛 晓鸥.中 药 复方 二至 丸考 源 沿 革 及现 代药 理研 究进展 J.辽宁 中医 药大 学学报,2017,19(12):93-97 6易南星,梁倩倩,张伟强,等.骨性关节炎相关滑膜炎症研究进展J.昆明医科大学学报,2019,40:136-139.7贺娟娟,颜春鲁,安方玉,等.炎症因子与炎症因子相关信号通路在膝骨关节炎中的调控机制研究进展J.中国临床药理学,2019,35:1308-1311.8蔡伟松,李皓桓.信号通路在骨关节炎发病机制中的研究进展J.广西医学,2019,41(6):751754.9张艳玲,刘君伟,李春,等.基于JAK2/STAT3信号通路探讨温针灸改善膝关节骨关节炎兔软骨损伤的机制J.针刺研究,2022,47(12):1088-1094.10CHEN J.The cell-cycle arrest and apoptotic functions of p53 in tumor initiation and progressionJCold Spring Harb Perspect 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