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第五第五章章 环境环境化学化学物致物致突变突变性及性及其评其评价价/10/101第1页环境毒理学|第一节第一节第一节第一节 环境化学物致突变性及其评价环境化学物致突变性及其评价环境化学物致突变性及其评价环境化学物致突变性及其评价|一、基本概念一、基本概念一、基本概念一、基本概念|生物个体和各代之间存在着种种差异，我们通常称之为生物个体和各代之间存在着种种差异，我们通常称之为生物个体和各代之间存在着种种差异，我们通常称之为生物个体和各代之间存在着种种差异，我们通常称之为变异变异变异变异（variationvariation）。）。）。）。|基于染色体和基因变异才能够遗传，而遗传变异称为突变基于染色体和基因变异才能够遗传，而遗传变异称为突变基于染色体和基因变异才能够遗传，而遗传变异称为突变基于染色体和基因变异才能够遗传，而遗传变异称为突变（mutationmutation）。）。）。）。|突变发生及其过程就是致突变作用（突变发生及其过程就是致突变作用（突变发生及其过程就是致突变作用（突变发生及其过程就是致突变作用（mutagenesismutagenesis）。）。）。）。|突变可分为自发突变突变可分为自发突变突变可分为自发突变突变可分为自发突变(natural(natural或或或或sporadic mutation)sporadic mutation)和诱发突变和诱发突变和诱发突变和诱发突变(induced mutation(induced mutation）。）。）。）。|各物种自发突变频率较低各物种自发突变频率较低各物种自发突变频率较低各物种自发突变频率较低,而诱发突变比较常见而诱发突变比较常见而诱发突变比较常见而诱发突变比较常见,诱发突变指因为物诱发突变指因为物诱发突变指因为物诱发突变指因为物理、化学、生物等环境原因引发突变。至今理、化学、生物等环境原因引发突变。至今理、化学、生物等环境原因引发突变。至今理、化学、生物等环境原因引发突变。至今,已发觉相当数量外源化已发觉相当数量外源化已发觉相当数量外源化已发觉相当数量外源化学物能损伤遗传物质，从而诱发突变，这些物质称为致突变物或诱学物能损伤遗传物质，从而诱发突变，这些物质称为致突变物或诱学物能损伤遗传物质，从而诱发突变，这些物质称为致突变物或诱学物能损伤遗传物质，从而诱发突变，这些物质称为致突变物或诱变剂（变剂（变剂（变剂（mutagenmutagen），也称为遗传毒物），也称为遗传毒物），也称为遗传毒物），也称为遗传毒物(genotoxic agent(genotoxic agent）。）。）。）。2 2第2页环境毒理学|环境化学诱变剂分类环境化学诱变剂分类|第一组人工合成,仅在一定条件下应用诱变剂|1.药品|抗癌药抗菌素,麻醉药和避孕药等|2.农药|杀虫剂,灭鼠剂,除莠剂和除霉剂等及他们残留物|3.食品添加剂|4.化装品|5.生物污染|第二组工业生产中应用或产生环境诱变剂|1.工业烷化剂|2.有机溶剂及有机金属化合物|3.水污染物|4.空气污染物|5.重金属及其化合物|第三组自然界存在诱变剂与食品加工过程产生诱变剂|1.生物碱|2.微生物代谢产物|3.食品加工过程中产生诱变剂3 3第3页环境毒理学|二、突变类型二、突变类型|普通依据遗传物质损伤能否在显微镜下普通依据遗传物质损伤能否在显微镜下直接观察到分为直接观察到分为染色体畸变染色体畸变(chromosome aberration)和和 基因突变基因突变(gene mutation)两类：两类：|染色体损伤大于或等于染色体损伤大于或等于0.2微米时，可微米时，可在光学显微镜下观察到，称为染色体畸在光学显微镜下观察到，称为染色体畸变；变；|若小于这一下限，不能在镜下直接观察若小于这一下限，不能在镜下直接观察到，要依靠对其后代生理、生化、结构到，要依靠对其后代生理、生化、结构等表型改变判断突变发生，称为基因突等表型改变判断突变发生，称为基因突变变(gene mutation），亦称点突变），亦称点突变(point mutation）。）。4 4第4页环境毒理学5 5第5页环境毒理学6 6第6页7 7第7页8 8第8页化学毒物致突变类型化学毒物致突变类型|(一一一一)、基因突变、基因突变、基因突变、基因突变(gene mutation)gene mutation)gene mutation)gene mutation)zz1 1 1 1碱基置换碱基置换碱基置换碱基置换(basepair substitution)basepair substitution)basepair substitution)basepair substitution)指某一碱基配对性能改变或脱落所致突变。指某一碱基配对性能改变或脱落所致突变。指某一碱基配对性能改变或脱落所致突变。指某一碱基配对性能改变或脱落所致突变。(DNA(DNA(DNA(DNA碱基被碱基被碱基被碱基被其它碱基所取代其它碱基所取代其它碱基所取代其它碱基所取代)碱基碱基：腺嘌呤（腺嘌呤（A,Adenine)鸟嘌呤（鸟嘌呤（G,Guanine)胞嘧啶（胞嘧啶（C,Cytosine)胸腺嘧啶（胸腺嘧啶（T,Thymine)A-T;G-C,三个碱基对组成一个密码子三个碱基对组成一个密码子转换转换转换转换(transition)transition)transition)transition)颠换颠换颠换颠换(transvertion)transvertion)transvertion)transvertion)9 9第9页|它包含转换和颠换两种情况：它包含转换和颠换两种情况：|原来嘌呤被另一嘌呤置换或原来嘧原来嘌呤被另一嘌呤置换或原来嘧啶被另一嘧啶置换，我们称之为转换啶被另一嘧啶置换，我们称之为转换(transition）；）；|若原来嘌呤被嘧啶置换或原来嘧啶被若原来嘌呤被嘧啶置换或原来嘧啶被嘌呤置换，我们则称之为颠换嘌呤置换，我们则称之为颠换(transversion）。）。|不论是转换还是颠换都只包括一对碱不论是转换还是颠换都只包括一对碱基，其结果可造成一个三联体密码子改基，其结果可造成一个三联体密码子改变变,可能出现同义密码、错义密码和终可能出现同义密码、错义密码和终止密码。因为错义密码所编码氨基酸不止密码。因为错义密码所编码氨基酸不一样，表示蛋白质可能发生改变；假如一样，表示蛋白质可能发生改变；假如错义密码为终止密码，可使所编码蛋白错义密码为终止密码，可使所编码蛋白质肽链缩短。质肽链缩短。1010第10页|(一一)、基因突变、基因突变(gene mutation)gene mutation)化学毒物致突变类型化学毒物致突变类型1111第11页化学毒物致突变类型化学毒物致突变类型|(一一)、基因突变、基因突变(gene mutation)gene mutation)1212第12页zz2 2 2 2移码突变移码突变移码突变移码突变 (frameshift mutation)frameshift mutation)frameshift mutation)frameshift mutation)指发生一对或几对（三对除外）碱基降指发生一对或几对（三对除外）碱基降指发生一对或几对（三对除外）碱基降指发生一对或几对（三对除外）碱基降低或增加，以致从受损点开始碱基序列完低或增加，以致从受损点开始碱基序列完低或增加，以致从受损点开始碱基序列完低或增加，以致从受损点开始碱基序列完全改变，形成错误密码，并转译成为不正全改变，形成错误密码，并转译成为不正全改变，形成错误密码，并转译成为不正全改变，形成错误密码，并转译成为不正常氨基酸。常氨基酸。常氨基酸。常氨基酸。zz 3 3 3 3、大段损伤、大段损伤、大段损伤、大段损伤 大片段损伤是指大片段损伤是指大片段损伤是指大片段损伤是指DNADNA链大段缺失或插入。链大段缺失或插入。链大段缺失或插入。链大段缺失或插入。这种损伤有时可跨越两个或数个基因，但这种损伤有时可跨越两个或数个基因，但这种损伤有时可跨越两个或数个基因，但这种损伤有时可跨越两个或数个基因，但所缺失片段仍远小于光镜下所能观察到染所缺失片段仍远小于光镜下所能观察到染所缺失片段仍远小于光镜下所能观察到染所缺失片段仍远小于光镜下所能观察到染色体改变，故又可称为小缺失。色体改变，故又可称为小缺失。色体改变，故又可称为小缺失。色体改变，故又可称为小缺失。1313第13页|(二二)、染色体畸变、染色体畸变(chromosome aberration)chromosome aberration)指染色体结构改变指染色体结构改变 z染色单体型畸变染色单体型畸变(chromatid-type aberration)chromatid-type aberration)z染色体型畸变染色体型畸变(chromosome aberration)chromosome aberration)染色体畸变染色体畸变裂隙裂隙(gap)gap)断裂断裂(break)break)断片断片(fragment)fragment)和和缺失缺失(deletion)deletion)微小体微小体(minute body)minute body)无着丝点环无着丝点环环状染色体环状染色体 双着丝点染色体双着丝点染色体 倒位倒位(inversion)inversion)易位易位(translocation)translocation)插入插入(insertion)insertion)和和重复重复(duplication)duplication)辐射体辐射体 化学毒物致突变类型化学毒物致突变类型1414第14页|（1）裂隙和断裂（）裂隙和断裂（gap and brake）：都是指染色体上狭窄）：都是指染色体上狭窄非染色带，其所分割两个节段保持线状连接为裂隙，不然为非染色带，其所分割两个节段保持线状连接为裂隙，不然为断裂。断裂。|（2）无着丝粒断片和缺失）无着丝粒断片和缺失(acentric fragment and deletion)：一个染色体发生一次或屡次断裂而不重接，且这些断裂节：一个染色体发生一次或屡次断裂而不重接，且这些断裂节段远远分开会出现一个或多个无着丝粒断片和一个缺失了部段远远分开会出现一个或多个无着丝粒断片和一个缺失了部分染色质并带有丝粒异常染色体。细胞再次分裂时会形成微分染色质并带有丝粒异常染色体。细胞再次分裂时会形成微核或微小体。核或微小体。|（3）环状染色体（）环状染色体（ring chromosome）：染色体两臂各发生）：染色体两臂各发生一次断裂，其带有着丝粒节段两断端连接成一个环，称之为一次断裂，其带有着丝粒节段两断端连接成一个环，称之为环状染色体。环状染色体。|（4）倒位）倒位(inversion)：当染色体发生两次不一样部位断裂：当染色体发生两次不一样部位断裂时，中间节段倒转时，中间节段倒转1800再重接，为倒位。再重接，为倒位。|（5）插入和重复）插入和重复(insertion and duplication)：当一个染色体：当一个染色体发生三处断裂，带有两断段断片插入到另一臂断裂处或另一发生三处断裂，带有两断段断片插入到另一臂断裂处或另一染色体断裂处重接称为插入，若缺失染色体和插入染色体是染色体断裂处重接称为插入，若缺失染色体和插入染色体是同源染色体，且各有一处断裂发生于同一位点，则出现两段同源染色体，且各有一处断裂发生于同一位点，则出现两段相同节段，称为重复。相同节段，称为重复。|（6）易位）易位(translocation)：从某个染色体断下节段连接到另：从某个染色体断下节段连接到另一个染色体上称为易位。两染色体各发生一次断裂，只一个一个染色体上称为易位。两染色体各发生一次断裂，只一个节段连到另一染色体上为单方易位，相互重接为相互易位，节段连到另一染色体上为单方易位，相互重接为相互易位，若发生若发生3处以上断裂，其交换重接称为复杂易位。处以上断裂，其交换重接称为复杂易位。1515第15页染色体缺失及环状染色体形成图染色体缺失及环状染色体形成图染色体插入和重复示意图染色体插入和重复示意图1616第16页染色体臂间倒位染色体臂间倒位染色体相互易位示意图染色体相互易位示意图1717第17页|(二二)、染色体畸变、染色体畸变(chromosome aberration)chromosome aberration)化学毒物致突变类型化学毒物致突变类型1818第18页|(三三三三)、基因组突变、基因组突变、基因组突变、基因组突变 z1 1非非整整倍倍体体 非非整整倍倍体体(aneuploid)aneuploid)指指细细胞胞丢丢失失或或增增加加一一条条或或几几条条染染色色体体。缺缺失失一一条条染染色色体体时时称称为为单单体体(monosome)monosome)，增增 加加 一一 条条 染染 色色 体体 时时 称称 为为 三三 体体(trisome)trisome)。染染色色体体数数目目标标改改变变会会造造成成基基因因平平衡衡失失调调，可可能能影影响响细细胞胞生生存存或或造造成成形形态态及及功功效效上上异异常常。如如2121三体造成先天愚型三体造成先天愚型(DownDown氏综合征氏综合征)。z2 2整整倍倍体体 整整倍倍体体(euploid)euploid)指指染染色色体体数数目目标标异异常常是是 以以 染染 色色 体体 组组 为为 单单 位位 增增 减减，如如 形形 成成 三三 倍倍 体体(triploid)triploid)、四四倍倍体体(tetroploid)tetroploid)等等。在在人人体体，3 3n n为为6969条条染染色色体体，4 4n n为为9292条条染染色色体体。在在肿肿瘤瘤细细胞胞及及人人类类自自然然流流产产胎胎儿儿细细胞胞中中可可有有三三倍倍体体细细胞胞存存在在。发发生生于生殖细胞整倍体改变，几乎都是致死性。于生殖细胞整倍体改变，几乎都是致死性。化学毒物致突变类型化学毒物致突变类型1919第19页致突变作用机制|三三 致突变作用机理致突变作用机理|一、一、DNADNA损伤与突变损伤与突变z1.碱基错配碱基错配(共价结合共价结合)z2.嵌入嵌入DNA链链z3.碱基类似物取代碱基类似物取代z4.碱基化学结构改变或破坏碱基化学结构改变或破坏 2020第20页|二、二、DNA损伤修复损伤修复|遗传信息之所以能长久保持高度保遗传信息之所以能长久保持高度保真真(fidelity)即重现精度，是因为细胞能即重现精度，是因为细胞能够够:|经过对经过对DNA损伤修复以保护亲代损伤修复以保护亲代DNA链，使之防止因为外来原因作用而链，使之防止因为外来原因作用而发生改变；发生改变；|执行高度保真复制，即对复制中发执行高度保真复制，即对复制中发生错误及时修复以到达高度保真性。生错误及时修复以到达高度保真性。|现已证实突变频率与各种酶性现已证实突变频率与各种酶性DNA修复和防错系统效率呈负性相关。但也修复和防错系统效率呈负性相关。但也有一些是易错有一些是易错(error-prone)修复系统。修复系统。2121第21页|机体修复机体修复DNADNA损伤机制可分为两大类：损伤机制可分为两大类：1.损损伤伤耐耐受受机机制制：指指DNA遗遗传传可可绕绕过过那那些些阻阻止止DNA 复制复制DNA损伤。损伤。2.修复机制：修复机制：DNA修复修复直接修复直接修复切除修复切除修复O6甲基鸟嘌呤修复甲基鸟嘌呤修复光修复光修复错配碱基修复错配碱基修复碱基切除修复碱基切除修复核苷酸切除修复核苷酸切除修复机体对致突变作用影响复制后修复复制后修复呼救性修复呼救性修复2222第22页|预计人类内源性预计人类内源性DNA损伤和修复过程损伤和修复过程损伤类型损伤发生率最大修复速度脱嘌呤1000a脱嘧啶55a胞嘧啶脱氨15a单链断裂50002105N7甲基化鸟嘌呤3500aO6甲基化鸟嘌呤130104氧化性产物120105注：损伤发生率以每小时每细胞发生次数计，最大修注：损伤发生率以每小时每细胞发生次数计，最大修复速度以每小时每细胞修复碱基对数计，复速度以每小时每细胞修复碱基对数计，a指虽已测出指虽已测出实际值，但预计最大修复速度为发生率实际值，但预计最大修复速度为发生率2倍以上倍以上2323第23页1、复制前修复、复制前修复|光复活：光复活：最常见紫外线对最常见紫外线对DNA损伤：相邻损伤：相邻2个胸腺个胸腺嘧啶形成二聚体。嘧啶形成二聚体。修复：在长波紫外线或短波可见光诱导修复：在长波紫外线或短波可见光诱导下，光裂合酶可催化嘧啶二聚体进行单体下，光裂合酶可催化嘧啶二聚体进行单体化。在人类未得到充分证实。化。在人类未得到充分证实。|“适应性适应性”反应反应 低剂量烷化剂可诱导一个专一蛋白质（酶）低剂量烷化剂可诱导一个专一蛋白质（酶）合成，这种酶称为烷基转移酶或烷基受体合成，这种酶称为烷基转移酶或烷基受体蛋白。蛋白。可将结合到碱基上（鸟嘌呤）烷基转移到可将结合到碱基上（鸟嘌呤）烷基转移到酶本身半光氨酸酶本身半光氨酸-SH基上，恢复嘌呤本身结基上，恢复嘌呤本身结构。构。各种细胞中存在。各种细胞中存在。2424第24页|切除修复切除修复 多步骤修复过程。在各种酶作用下，将受损多步骤修复过程。在各种酶作用下，将受损伤碱基或异常核苷酸切除。伤碱基或异常核苷酸切除。包含损伤部位识别外切酶、内切酶、连接酶包含损伤部位识别外切酶、内切酶、连接酶等。等。能修复能修复UV、加合等各种形式、加合等各种形式DNA损伤。损伤。2、复制过程中修复、复制过程中修复 损伤保留至复制时修复，轻易发生错误。有损伤保留至复制时修复，轻易发生错误。有些损伤保留至复制时才得以修复。些损伤保留至复制时才得以修复。3-5外切核酸酶，含有校正读码功效，修复外切核酸酶，含有校正读码功效，修复复制过程中错误。复制过程中错误。3、复制后修复（、复制后修复（SOS修复修复)仅限于原核生物。仅限于原核生物。2525第25页|总之，任何总之，任何DNA损伤，只要修复损伤，只要修复无误，突变就不会发生；假如修复无误，突变就不会发生；假如修复错误或未经修复，损伤就得以固定错误或未经修复，损伤就得以固定(fixed)下来下来,于是发生突变。所以诱于是发生突变。所以诱发突变是一个受控制过程，失控才发突变是一个受控制过程，失控才真正发生突变。普通来说从真正发生突变。普通来说从DNA损伤到损伤固定需要几次细胞分裂损伤到损伤固定需要几次细胞分裂周期才能形成。周期才能形成。2626第26页突变不良后果突变不良后果突变不良后果突变不良后果突变不良后果 体细胞突变体细胞突变体细胞突变体细胞突变 生殖细胞突变生殖细胞突变生殖细胞突变生殖细胞突变 癌变癌变癌变癌变致畸致畸致畸致畸衰老衰老衰老衰老配子死亡配子死亡配子死亡配子死亡死胎死胎死胎死胎自发流产自发流产自发流产自发流产先天畸形先天畸形先天畸形先天畸形四、突变不良后果四、突变不良后果2727第27页|体细胞突变后果中最受注意是致癌问题，将在体细胞突变后果中最受注意是致癌问题，将在下一节叙述。其次，胚胎体细胞突变可能造成畸下一节叙述。其次，胚胎体细胞突变可能造成畸胎，当然，畸胎发生还与亲代生殖细胞突变相关。胎，当然，畸胎发生还与亲代生殖细胞突变相关。据报道人类妊娠最初据报道人类妊娠最初3个月流产中有个月流产中有60%有染色体有染色体畸变，在一定程度上这是致突变物透过胎盘作用畸变，在一定程度上这是致突变物透过胎盘作用于胚胎体细胞所致，而不完全是亲代生殖细胞突于胚胎体细胞所致，而不完全是亲代生殖细胞突变后果。变后果。|体细胞突变也可能与动脉粥样硬化症相关。因体细胞突变也可能与动脉粥样硬化症相关。因为对于正常动脉壁细胞中葡糖为对于正常动脉壁细胞中葡糖-6-磷酸脱氢酶有两磷酸脱氢酶有两种变异体，而从动脉粥样硬化症同一斑块取下细种变异体，而从动脉粥样硬化症同一斑块取下细胞在电泳中只表现为同一个变异体，故认为动脉胞在电泳中只表现为同一个变异体，故认为动脉粥样硬化斑块是单克隆起源。粥样硬化斑块是单克隆起源。|体外培养人类非恶性转化细胞，其寿命都有限。体外培养人类非恶性转化细胞，其寿命都有限。这些细胞在传代过程中，细胞遗传学异常率逐步这些细胞在传代过程中，细胞遗传学异常率逐步增高，而有丝分裂逐步下降，所以能够推测，体增高，而有丝分裂逐步下降，所以能够推测，体细胞突变是衰老起因，最低程度在体外如此。另细胞突变是衰老起因，最低程度在体外如此。另外，外，DNA修复能力缺点与成熟早衰老综合征也有修复能力缺点与成熟早衰老综合征也有一定关系。一定关系。2828第28页|二、生殖细胞突变后果二、生殖细胞突变后果|假如突变发生在生殖细胞，不论其发生假如突变发生在生殖细胞，不论其发生在任何阶段，都存在对后代影响可能性，其在任何阶段，都存在对后代影响可能性，其影响后果可分为致死性和非致死性两种。致影响后果可分为致死性和非致死性两种。致死性影响可能是显性致死和隐性致死。显性死性影响可能是显性致死和隐性致死。显性致死即突变配子与正常配子结合后，在着床致死即突变配子与正常配子结合后，在着床前或着床后早期胚胎死亡。隐性致死要纯合前或着床后早期胚胎死亡。隐性致死要纯合子或半合子才能出现死亡效应。子或半合子才能出现死亡效应。|假如生殖细胞突变为非致死性，则可能出假如生殖细胞突变为非致死性，则可能出现显性或隐性遗传病，包含先天性畸形。在现显性或隐性遗传病，包含先天性畸形。在遗传性疾病频率与种类增多时，突变基因及遗传性疾病频率与种类增多时，突变基因及染色体损伤，将使基因库负荷增加。染色体损伤，将使基因库负荷增加。|基因库基因库(gene pool)是指一个物种群体中生是指一个物种群体中生殖细胞内含有、并能传给后代基因总和。殖细胞内含有、并能传给后代基因总和。|遗传负荷遗传负荷(genetic load)系一个物种群体中系一个物种群体中每一个体携带可遗传给后代有害基因水平。每一个体携带可遗传给后代有害基因水平。2929第29页|五、致突变性评价方法五、致突变性评价方法|检测外来化学物致突变性普通经过检测外来化学物致突变性普通经过致突变试验致突变试验来进行。来进行。|其目标主要有两点：其目标主要有两点：|检测外源化学物致突变性，检测外源化学物致突变性，预测其对哺乳动物和人预测其对哺乳动物和人致癌性致癌性；|检测外源化学物对哺乳动物检测外源化学物对哺乳动物生殖细胞遗传毒性，预测其对人体生殖细胞遗传毒性，预测其对人体遗传危害性遗传危害性。3030第30页|1、惯用致突变试验、惯用致突变试验 z(一一)细菌回复突变试验细菌回复突变试验(AmesAmes试验试验)鼠伤寒沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌原养型原养型(his+)组氨酸营养缺点型突组氨酸营养缺点型突变株。变株。(his-)正向突变正向突变回复突变回复突变代谢活化系统代谢活化系统受试物受试物观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法 原理：利用一个突变微生物菌株与被检测化学物接原理：利用一个突变微生物菌株与被检测化学物接触，使突变型微生物回复突变，重新成为野生型微生触，使突变型微生物回复突变，重新成为野生型微生物。物。突变型微生物不具备合成组氨酸能力，不能在不含突变型微生物不具备合成组氨酸能力，不能在不含（或低浓度）组氨酸培养基上生长。（或低浓度）组氨酸培养基上生长。3131第31页|方法：方法：|将突变型沙氏菌在不含（或低浓度）组氨酸培养基将突变型沙氏菌在不含（或低浓度）组氨酸培养基上培养上培养,以其生长情况作为指标。以其生长情况作为指标。|在培养基中加入哺乳动物肝细胞微粒体：提升灵敏在培养基中加入哺乳动物肝细胞微粒体：提升灵敏度。度。|特点：优点：|简便、灵敏、快速（简便、灵敏、快速（48h）、费用低；）、费用低；|检测结果与对动物致癌性相符率达约检测结果与对动物致癌性相符率达约90%。缺点：|利用微生物作为供试物，不能全方面反应哺乳动物遗利用微生物作为供试物，不能全方面反应哺乳动物遗传信息，仅传信息，仅1/6；|微生物微生物DNA修复系统与动物有差异；修复系统与动物有差异；|微生物无免疫功效。微生物无免疫功效。3232第32页（二）、哺乳动物体细胞突变试验 （1）方法原理与微生物突变类似。）方法原理与微生物突变类似。惯用细胞株：中国地鼠肺细胞中国地鼠肺细胞V79 中国地鼠肺卵巢细胞中国地鼠肺卵巢细胞(CHO）小鼠淋巴瘤小鼠淋巴瘤L5178Y细胞株。细胞株。3333第33页V79、CHO细胞株正常细胞：缺乏利用嘌呤碱酶缺乏利用嘌呤碱酶HGPRT，不能在加入类嘌呤碱类物质培养基上，不能在加入类嘌呤碱类物质培养基上生长；生长；突变细胞：可在加入类嘌呤碱类物质培可在加入类嘌呤碱类物质培养基上生长。养基上生长。L5178Y突变细胞株正常细胞：缺乏胸苷激酶（缺乏胸苷激酶（TK），不），不可在含有细胞毒物可在含有细胞毒物5-溴脱氧尿苷培养基溴脱氧尿苷培养基上生长。上生长。突变细胞：可在此种培养基上生长。可在此种培养基上生长。3434第34页(三三)微核试验微核试验 微核微核(Micronucleus)Micronucleus)产生与染色体损伤相关，产生与染色体损伤相关，是染色体或染色单体无着丝点断片或纺锤丝受是染色体或染色单体无着丝点断片或纺锤丝受损伤而丢失整个染色体，在细胞分裂后期遗留损伤而丢失整个染色体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或几个在细胞质中，末期之后，单独形成一个或几个规则次核，包含在子细胞胞质内，因比主核小，规则次核，包含在子细胞胞质内，因比主核小，故称微核。故称微核。在细胞质中微核起源有二：断片或在细胞质中微核起源有二：断片或无着丝粒染色体在细胞分裂后期不能定向移动，无着丝粒染色体在细胞分裂后期不能定向移动，而遗留在细胞质中；有丝分裂毒物作用使个别而遗留在细胞质中；有丝分裂毒物作用使个别染色体或带苔丝粒染色体环和断片在细胞分裂染色体或带苔丝粒染色体环和断片在细胞分裂后期被留在细胞质中。后期被留在细胞质中。微核试验微核试验(Micronucleus testMicronucleus test，MNT)MNT)是观察是观察受试物能否产生微核试验。其主要可检出受试物能否产生微核试验。其主要可检出DNADNA断裂剂和非整倍体诱变剂断裂剂和非整倍体诱变剂。观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法3535第35页观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法(三三)微核试验微核试验3636第36页MNNCE观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法3737第37页z(四四)染色体畸变分析染色体畸变分析 z(五五)姐妹染色单体交换试验（姐妹染色单体交换试验（SCE）观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法3838第38页染色体畸变试验：染色体畸变试验：直接在显微镜下观察染色体结构和直接在显微镜下观察染色体结构和数目标改变情况。生殖细胞或体细胞、数目标改变情况。生殖细胞或体细胞、体外或体内试验。体外或体内试验。体外：体外：CHO细胞细胞:分裂快、数目适分裂快、数目适中、形态清楚；中、形态清楚；人类外周血淋巴细胞体内：受试动人类外周血淋巴细胞体内：受试动物骨髓细胞或其它（胸腺、脾、精原物骨髓细胞或其它（胸腺、脾、精原细胞）染色体畸变率改变。细胞）染色体畸变率改变。3939第39页试验方法：试验方法：a.体外培养：体外培养：CHO细胞或人类外周血淋巴细胞与细胞或人类外周血淋巴细胞与化学物，在细胞培养液（化学物，在细胞培养液（DMEM,RPM,1640或或1999）中，）中，370C下培养下培养24h(CHO)或或72h(人类细胞）。观察前人类细胞）。观察前2h加入秋水仙碱（中期分裂阻断剂），加入秋水仙碱（中期分裂阻断剂），制片，镜检观察。制片，镜检观察。b.体内染色体畸变分析：大鼠、小体内染色体畸变分析：大鼠、小鼠，染毒喂养，观察骨髓细胞染色体畸鼠，染毒喂养，观察骨髓细胞染色体畸变情况。变情况。4040第40页|二、惯用致突变试验二、惯用致突变试验z(五五)果蝇伴性隐性致死试验果蝇伴性隐性致死试验z(六六)显性致死试验显性致死试验z(七七)程序外程序外DNA台成试验台成试验 z(八八)转基因动物致突变试验转基因动物致突变试验z(九九)哺乳动物细胞基因突变试验哺乳动物细胞基因突变试验观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法4141第41页|三、致突变试验中一些问题三、致突变试验中一些问题 z(一一)阴性和阳性对照设置阴性和阳性对照设置 1 1阴性对照阴性对照 它是空白对照，即不加任何处理。它是空白对照，即不加任何处理。或者是溶剂对照。阴性对照除了无处理原因外，或者是溶剂对照。阴性对照除了无处理原因外，与试验组完全相同。其目标是取得试验基础数与试验组完全相同。其目标是取得试验基础数据。比如，据。比如，AmesAmes试验阴性对照可了解所用细菌试验阴性对照可了解所用细菌自发回复突变率；证实除处理原因外无任何使自发回复突变率；证实除处理原因外无任何使回复突变率增加或降低原因。回复突变率增加或降低原因。2 2阳性对照阳性对照 是用某种已知能产生阳性反应是用某种已知能产生阳性反应物质作为对照。其目标是经过对阳性物质试验物质作为对照。其目标是经过对阳性物质试验证实试验方法可靠；验证试验者在本试验条件证实试验方法可靠；验证试验者在本试验条件下，完成技术和判定致突变物能力；证实经一下，完成技术和判定致突变物能力；证实经一段时间后，本试验重复性。比如，段时间后，本试验重复性。比如，AmesAmes试验中试验中阳性对照未出现阳性结果，应考虑突变菌株可阳性对照未出现阳性结果，应考虑突变菌株可能发生问题，另一个可能是代谢活化能力不足。能发生问题，另一个可能是代谢活化能力不足。所以，当阳性对照结果未呈阳性，其试验组试所以，当阳性对照结果未呈阳性，其试验组试验数据可靠性亦大大降低。验数据可靠性亦大大降低。观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法4242第42页|三、致突变试验中一些问题三、致突变试验中一些问题z(二二)体外试验活化系统体外试验活化系统 1 1哺乳动物细胞介导哺乳动物细胞介导 使用完整细胞，尤其是大使用完整细胞，尤其是大鼠肝原代细胞，与测试细菌或细胞一起培养。这也鼠肝原代细胞，与测试细菌或细胞一起培养。这也是一个活化系统。它有完整细胞结构和各种酶及内是一个活化系统。它有完整细胞结构和各种酶及内源性辅助因子，代谢能力优于无细胞系统如源性辅助因子，代谢能力优于无细胞系统如S9S9，但但不如体内活化系统。不如体内活化系统。2 2S9 S9S9 S9指经酶诱导剂处理后制备肝匀浆，再经指经酶诱导剂处理后制备肝匀浆，再经90009000g g离心分离所得上清液，加上适当缓冲液和辅离心分离所得上清液，加上适当缓冲液和辅助因子。它主要含有混合功效氧化酶助因子。它主要含有混合功效氧化酶(MFO)MFO)，是国是国内常规应用于体外致突变试验代谢活化系统，其缺内常规应用于体外致突变试验代谢活化系统，其缺点是点是S9S9随试验动物种属或器官不一样而有差异；随试验动物种属或器官不一样而有差异；S9S9含有大量亲核物质有可能影响试验敏感性。含有大量亲核物质有可能影响试验敏感性。3 3纯化酶和基因工程纯化酶和基因工程 应用纯化细胞色素应用纯化细胞色素P-450P-450、谷胱苷肽转移酶及过氧化物水解酶，可严格控制代谷胱苷肽转移酶及过氧化物水解酶，可严格控制代谢产物诱发突变条件，但技术难度大。利用基因工谢产物诱发突变条件，但技术难度大。利用基因工程，将人细胞色素程，将人细胞色素P-450P-450基因，插入组合细胞内，基因，插入组合细胞内，用上述细胞进行致突变试验，使细胞含有代谢活化用上述细胞进行致突变试验，使细胞含有代谢活化系统。系统。观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法4343第43页|三、致突变试验中一些问题三、致突变试验中一些问题z(三三)致突变试验与致癌试验关系致突变试验与致癌试验关系 已知大多数化学致癌物含有致突变作用，遗已知大多数化学致癌物含有致突变作用，遗传学改变在原癌基因激活和抑癌基因失活上起传学改变在原癌基因激活和抑癌基因失活上起主要作用，致癌物诱致关键靶基因遗传改变直主要作用，致癌物诱致关键靶基因遗传改变直接作用等在哺乳动物试验中证实。接作用等在哺乳动物试验中证实。发觉人类接触致癌物与发觉人类接触致癌物与DNADNA加合物，同其肿瘤加合物，同其肿瘤中癌基因和抑癌基因特异碱基对突变之间含有中癌基因和抑癌基因特异碱基对突变之间含有相关性。相关性。传统长久致癌试验，花费大，周期长，不能传统长久致癌试验，花费大，周期长，不能适应化学物质快速增加需要。另外，致癌试验适应化学物质快速增加需要。另外，致癌试验所用动物数量有限，难以检出弱致癌物。需要所用动物数量有限，难以检出弱致癌物。需要发展各种体内和体外短期试验，用于对化学物发展各种体内和体外短期试验，用于对化学物质致癌性进行筛检。质致癌性进行筛检。观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法4444第44页|三、致突变试验中一些问题三、致突变试验中一些问题z(四四)试验结果在毒理学安全性评价中作用试验结果在毒理学安全性评价中作用 阴性结果判定条件：阴性结果判定条件：最高剂量应包含受试物溶解度许可或灌胃量最高剂量应包含受试物溶解度许可或灌胃量许可最大剂量。如该剂量毒性很大，则体内试许可最大剂量。如该剂量毒性很大，则体内试验和细菌试验应为最大耐受量。使用哺乳动物验和细菌试验应为最大耐受量。使用哺乳动物细胞进行体外试验，常选细胞进行体外试验，常选LDLD5050或或LDLD8080为最大剂量。为最大剂量。溶解度大、毒性低化学物，在细菌试验中能够溶解度大、毒性低化学物，在细菌试验中能够50005000gg皿作为最高剂量。皿作为最高剂量。各剂量组组间差距不应过大，以防漏检仅在各剂量组组间差距不应过大，以防漏检仅在非常狭窄范围内才有突变能力一些化学毒物。非常狭窄范围内才有突变能力一些化学毒物。满足上述条件，仍为阴性，才慎重下结论。满足上述条件，仍为阴性，才慎重下结论。观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法4545第45页|三、致突变试验中一些问题三、致突变试验中一些问题z(四四)试验结果在毒理学安全性评价中试验结果在毒理学安全性评价中作用作用阳性结果应含有剂量阳性结果应含有剂量反应关系，即随反应关系，即随剂量增加，致突变作用增加；和在一组剂量增加，致突变作用增加；和在一组或多组观察值与阴性对照比较有显著性或多组观察值与阴性对照比较有显著性差异。阳性结论，即表明受试物含有致差异。阳性结论，即表明受试物含有致突变性，而不一样致突变试验遗传学终突变性，而不一样致突变试验遗传学终点不一样，其所表示含义不一。如基因点不一样，其所表示含义不一。如基因突变是含有造成遗传性疾病突变，突变是含有造成遗传性疾病突变，DNADNA修复实际后果尚不明确。修复实际后果尚不明确。观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法4646第46页致突变试验举例|美国美国EPA毒物处毒物处(1936)提出了一个三阶段试验方案，把遗传提出了一个三阶段
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