疟疾检验技术专家讲座.pptx

疟原虫检验技术疟原虫检验技术 疟疾检验技术第1页分子生物学、血清学技术发展迅猛分子生物学、血清学技术发展迅猛,不过不过确诊确诊疟疾疟疾“金标准金标准”依然是血液显微镜依然是血液显微镜检验检验显微镜检验是唯一可判别显微镜检验是唯一可判别4种疟原虫方法种疟原虫方法厚薄血涂片检验仍被认为是不可替换疟疾厚薄血涂片检验仍被认为是不可替换疟疾诊疗金标准诊疗金标准试验室技术试验室技术疟疾检验技术第2页厚薄血膜制作厚薄血膜制作 血片制作血片制作在制作血片前，首先要查对患者姓名、年在制作血片前，首先要查对患者姓名、年纪和住址纪和住址疟疾检验技术第3页取血部位和血量取血部位和血量采血部位和取血方法：采血部位和取血方法：耳垂耳垂或无名指，通常在耳垂取或无名指，通常在耳垂取血，先用血，先用75%75%酒精棉球消毒酒精棉球消毒取血部位，待酒精干后，取血部位，待酒精干后，用左手拇指和食指紧捏耳用左手拇指和食指紧捏耳垂上方或无名指指尖，右垂上方或无名指指尖，右手持消毒针快速刺入皮肤，手持消毒针快速刺入皮肤，不宜过深或过浅。然后用不宜过深或过浅。然后用右手中指轻轻挤压出血。右手中指轻轻挤压出血。厚血膜血量约一粒米大小。厚血膜血量约一粒米大小。疟疾检验技术第4页厚血膜厚血膜 用推片一角，从取血部位刮取约用推片一角，从取血部位刮取约4微升血量微升血量（相当于火柴头大小），使血滴与平置载玻片（相当于火柴头大小），使血滴与平置载玻片接触，再由里向外一个方向旋转，转接触，再由里向外一个方向旋转，转24圈，涂圈，涂成直径成直径0.81厘米大小圆形厚血膜。厘米大小圆形厚血膜。薄血膜薄血膜再取一小滴血再取一小滴血.将血置于第一张玻片离厚血将血置于第一张玻片离厚血膜适当远地方膜适当远地方.将采血玻片将采血玻片(推片推片)边缘紧贴载玻边缘紧贴载玻片使片使 血液沿边缘散开血液沿边缘散开(如图示如图示).疟疾检验技术第5页正确推片姿势正确推片姿势疟疾检验技术第6页标准疟疾厚薄血膜片位置标准疟疾厚薄血膜片位置疟疾检验技术第7页各种不一样疟疾血片涂制法：各种不一样疟疾血片涂制法：标准血片标准血片门诊发烧病人血片门诊发烧病人血片居民普查血片居民普查血片疟疾检验技术第8页厚薄血膜标准厚薄血膜标准 厚血膜血量适宜，不宜过多或过少厚血膜血量适宜，不宜过多或过少 薄薄血膜平整血膜平整,无皱折和空泡无皱折和空泡.红细胞单层排列红细胞单层排列疟疾检验技术第9页血片染色血片染色 两种染色方法两种染色方法:吉氏染色法吉氏染色法瑞氏染色法瑞氏染色法 惯用吉氏染色法惯用吉氏染色法疟疾检验技术第10页吉氏染液吉氏染液(原液原液)配置配置 吉氏染粉吉氏染粉 (Azure B type)5g 甘油甘油 (纯纯)250ml 甲醇甲醇(纯纯)250ml吉氏粉放入研钵中，加少许甘油充分研磨吉氏粉放入研钵中，加少许甘油充分研磨,然后边加边磨，直然后边加边磨，直至甘油加完，将研磨染液倒入棕色瓶中，在至甘油加完，将研磨染液倒入棕色瓶中，在 研钵中加入少许研钵中加入少许甲醇清洗研钵，然后倒入棕色瓶中，再放入甲醇清洗，重复甲醇清洗研钵，然后倒入棕色瓶中，再放入甲醇清洗，重复数次，直至甲醇用完。盖好瓶盖，将染液充分摇匀，置于室数次，直至甲醇用完。盖好瓶盖，将染液充分摇匀，置于室内，天天晃动数分钟，存放一周后经过滤即可使用。保留时内，天天晃动数分钟，存放一周后经过滤即可使用。保留时间越长染色效果越好。间越长染色效果越好。整个染色液配制时间不能少于整个染色液配制时间不能少于5个小时个小时疟疾检验技术第11页稀释吉氏原液稀释吉氏原液原液需经原液需经pH7.0盐酸缓冲液（盐酸缓冲液（PBS）或）或净水稀释后，方可用于厚薄血片染色。净水稀释后，方可用于厚薄血片染色。吸收母液时，不要晃动瓶子吸收母液时，不要晃动瓶子,以免沉淀物以免沉淀物泛起影响染色效果泛起影响染色效果.疟疾检验技术第12页操作操作1（快染）（快染）配制配制5%染液，（每张血片约需染液染液，（每张血片约需染液2ml）：量筒内量：量筒内量2ml缓冲液或净水，直接滴加吉缓冲液或净水，直接滴加吉氏原液氏原液7滴，混匀，滴入待染标本厚薄血膜上，滴，混匀，滴入待染标本厚薄血膜上，染色染色10min，清水细缓冲洗，晾干镜检。，清水细缓冲洗，晾干镜检。操作操作2 (慢染慢染)在染色量筒内量在染色量筒内量2ml蒸馏水或净水，蒸馏水或净水，再再滴加滴加吉氏原液吉氏原液4滴，混匀，滴，混匀，滴入待染标本上，滴入待染标本上，染染色色3040min。清水细缓冲洗，。清水细缓冲洗，晾干镜检。晾干镜检。吉氏染液浓度吉氏染液浓度门诊染色门诊染色疟疾检验技术第13页将已用甲醇固定薄血膜血片插入染色缸，倒入将已用甲醇固定薄血膜血片插入染色缸，倒入3%吉氏染液稀释液（吉氏染液稀释液（3毫升吉氏原液加缓冲液或净水毫升吉氏原液加缓冲液或净水97毫升，混匀）浸没血片，同时对厚薄血膜染色毫升，混匀）浸没血片，同时对厚薄血膜染色30min（依据当地实际情况，酌情增减染色时间和浓（依据当地实际情况，酌情增减染色时间和浓度），然后用清水轻轻将染液漂洗洁净，将血片标度），然后用清水轻轻将染液漂洗洁净，将血片标本（血膜面朝下）插于晾干板上晾干，包装，镜本（血膜面朝下）插于晾干板上晾干，包装，镜检。检。成批血片染色成批血片染色疟疾检验技术第14页质量好染色质量好染色:核呈红色核呈红色,胞浆呈蓝色胞浆呈蓝色 假如血片偏红假如血片偏红,说明染液偏酸性说明染液偏酸性假如血片偏蓝假如血片偏蓝,说明染液偏硷性说明染液偏硷性外观吉氏染色血片外观吉氏染色血片疟疾检验技术第15页染色过程染色过程将血片平置于染色板上。将血片平置于染色板上。用吸管吸收已稀释吉氏液约用吸管吸收已稀释吉氏液约2ml于厚薄血于厚薄血膜上，染色膜上，染色10 min。用清水细缓冲去染液。用清水细缓冲去染液。置玻片于插板上，自然晾干。置玻片于插板上，自然晾干。血片干燥后血片干燥后,用甲醇固定薄血膜。用甲醇固定薄血膜。疟疾检验技术第16页血片制作与染色注意事项血片制作与染色注意事项 使用前载玻片一定要清洁，不然会影响使用前载玻片一定要清洁，不然会影响 血片血片制作和镜检结果制作和镜检结果 厚血膜干燥时不要加热，加热会使原虫变形，厚血膜干燥时不要加热，加热会使原虫变形，影响镜检结果影响镜检结果 配置母液时过滤可除去杂质颗粒，有利于提配置母液时过滤可除去杂质颗粒，有利于提升镜检质量升镜检质量 固定薄血膜时不要将甲醇触碰到厚血膜固定薄血膜时不要将甲醇触碰到厚血膜 冲洗染液时，不要冲走厚血膜。冲洗染液时，不要冲走厚血膜。疟疾检验技术第17页原虫密度计算原虫密度计算预计疟原虫感染程度有三种方法：预计疟原虫感染程度有三种方法：半定量计数法半定量计数法 检验厚血膜检验厚血膜白细胞原虫密度计数法检验厚血膜白细胞原虫密度计数法检验厚血膜红细胞感染率计算法检验薄血膜红细胞感染率计算法检验薄血膜疟疾检验技术第18页用厚血膜每个视野中所观察到疟原虫平均数粗略地用厚血膜每个视野中所观察到疟原虫平均数粗略地预计出疟原虫密度。这种方法简便，缺点是计数疟预计出疟原虫密度。这种方法简便，缺点是计数疟原虫数受血膜厚薄影响，只能定性，不宜作定量分原虫数受血膜厚薄影响，只能定性，不宜作定量分析。析。国内惯用。此方法将密度分为国内惯用。此方法将密度分为6级：级：1.全厚血膜查见疟原虫数在全厚血膜查见疟原虫数在10个以内，统计实际数字个以内，统计实际数字2.全厚血膜查见疟原虫数在全厚血膜查见疟原虫数在10个以上，但平均每个视个以上，但平均每个视野不到野不到1个虫，统计个虫，统计“少少”3.平均每个视野平均每个视野15个虫，统计个虫，统计“”4.平均每个视野平均每个视野610个虫，统计个虫，统计“+”5.平均每个视野平均每个视野11100个虫，统计个虫，统计“+”6.平均每个视野平均每个视野100个虫以上，统计个虫以上，统计“+”。半定量计数法半定量计数法疟疾检验技术第19页白细胞疟原虫密度计数法（白细胞疟原虫密度计数法（WHOWHO推荐）推荐）白细胞疟原虫密度计数法主要性白细胞疟原虫密度计数法主要性 用于疟疾研究用于疟疾研究 用于临床诊疗用于临床诊疗 用于抗疟后疟疾考评用于抗疟后疟疾考评疟疾检验技术第20页在厚血膜，按要求选择视野，计数在厚血膜，按要求选择视野，计数200个白细胞中疟个白细胞中疟原虫数（可分有性体和无性体），假如原虫密度较原虫数（可分有性体和无性体），假如原虫密度较低，可增加白细胞计数（低，可增加白细胞计数（500 1 000 个）。个）。白细胞疟原虫计算公式：白细胞疟原虫计算公式：疟原虫数疟原虫数 患者每微升血白细胞数患者每微升血白细胞数 计数白细胞数计数白细胞数=疟原虫数疟原虫数/l血。血。假如不知患者白细胞数，则每微升血以假如不知患者白细胞数，则每微升血以8 000个白细个白细胞计数胞计数(国际标准国际标准)。白细胞疟原虫密度计数法（白细胞疟原虫密度计数法（WHOWHO推荐）推荐）疟疾检验技术第21页白细胞疟原虫计数法举例白细胞疟原虫计数法举例假设计数假设计数200 WBC中有中有35个疟原虫，在不知患个疟原虫，在不知患 者白细胞数情况下，以每微升血者白细胞数情况下，以每微升血8000个白细个白细 胞为数胞为数,由此计算出每微升血液疟原虫密度为由此计算出每微升血液疟原虫密度为：35（原虫数）（原虫数）x 8000200（白细胞数）（白细胞数）=1400/l答：该患者原虫密度为答：该患者原虫密度为1400/l。疟疾检验技术第22页薄血膜不一样区域红细胞疟原虫感染率有较薄血膜不一样区域红细胞疟原虫感染率有较大差异，通常血膜后端和边缘部疟原虫密度大差异，通常血膜后端和边缘部疟原虫密度常比前半部或中央部高，所以，镜检时不宜常比前半部或中央部高，所以，镜检时不宜只检验一个角落，应顺玻片横轴检验。只检验一个角落，应顺玻片横轴检验。镜检时，应该统计下所观察到各种疟原虫虫镜检时，应该统计下所观察到各种疟原虫虫期，不要笼统地统计为期，不要笼统地统计为Pv或或Pf。红细胞感染率计算法（薄血膜）红细胞感染率计算法（薄血膜）疟疾检验技术第23页1.按以下公式计算：按以下公式计算：红细胞原虫感染率（红细胞原虫感染率（%）=疟原虫数疟原虫数 X 100 计数红细胞数计数红细胞数2.显微镜下选择红细胞排列整齐密集，无重迭视野显微镜下选择红细胞排列整齐密集，无重迭视野（300-500红细胞红细胞/视野）视野）3.按一定次序移动血片记数红细胞同时，统计疟原按一定次序移动血片记数红细胞同时，统计疟原虫数虫数4.假如能见到疟原虫，不过记数假如能见到疟原虫，不过记数500010000个红细胞个红细胞时却没有感染红细胞，那么设定感染率为时却没有感染红细胞，那么设定感染率为 红细胞感染率计算法（薄血膜）红细胞感染率计算法（薄血膜）疟疾检验技术第24页怎样确定疟原虫血片为阴性怎样确定疟原虫血片为阴性 检验全部厚血膜未查见疟原虫检验全部厚血膜未查见疟原虫 最少检验最少检验100个厚血膜油镜视野未查见个厚血膜油镜视野未查见 疟原虫疟原虫疟疾检验技术第25页人类四种疟原虫人类四种疟原虫 基基 本特征本特征疟疾检验技术第26页感染人疟原虫有四种感染人疟原虫有四种:恶性疟原虫恶性疟原虫 P.falciparum 间日疟原虫间日疟原虫 P.vivax三日疟原虫三日疟原虫 P.malariae 卵形疟原虫卵形疟原虫 P.ovale 疟疾检验技术第27页恶性疟恶性疟 P.falciparum 四种疟原虫中致病力最强四种疟原虫中致病力最强 无免疫力者感染后出现急性症状无免疫力者感染后出现急性症状,不及时治不及时治 疗可危及生命疗可危及生命 在我国主要流行云南省和海南省在我国主要流行云南省和海南省 疟疾检验技术第28页间日疟间日疟 P.vivax 间日疟原虫分布于我国大部分地域，间日疟原虫分布于我国大部分地域，主要是中部地域主要是中部地域 引发间日疟引发间日疟,病程呈良性病程呈良性,但有复发但有复发 疟疾检验技术第29页三日疟三日疟 P.malariae 三日疟在我国已基本毁灭三日疟在我国已基本毁灭主要发生在晚秋及初冬主要发生在晚秋及初冬,无复发无复发 卵形疟卵形疟 P.ovale又称蛋形疟原虫又称蛋形疟原虫,在我国已基本毁灭在我国已基本毁灭引发症状与间日疟相同引发症状与间日疟相同,但极少复发但极少复发疟疾检验技术第30页 四种疟原虫四种疟原虫 诊疗关键点诊疗关键点 疟疾检验技术第31页1.环状体钎细环状体钎细,红细红细胞不涨大胞不涨大2.一个红细胞内可有一个红细胞内可有几个环状体几个环状体 3.环状体内可有环状体内可有2个个核核 4.环状体可贴在红细环状体可贴在红细胞边缘胞边缘 5.血片中没有其它发血片中没有其它发育期滋养体育期滋养体 6.配子体呈新月形或配子体呈新月形或腊肠形腊肠形 7.可出现茂氏点可出现茂氏点恶性疟（恶性疟（P.falciparum）判定）判定 关键关键点点疟疾检验技术第32页1.红细胞通红细胞通常涨大常涨大 2.薛氏点显薛氏点显著著 3.成熟环状成熟环状体粗大体粗大4.滋养体有滋养体有阿米巴样阿米巴样伪足伪足5.可见不一可见不一样发育期样发育期原虫原虫 间日疟（间日疟（P.vivax）判定关键点）判定关键点疟疾检验技术第33页1.环状体可环状体可呈方形呈方形2.带状形是带状形是特点特点 3.成熟滋养成熟滋养体呈菊花体呈菊花状状,内含内含612个裂个裂殖子殖子 4.红细胞不红细胞不涨大，略涨大，略缩小缩小5.有时有西有时有西门氏点门氏点 三日疟（三日疟（P.malariae）诊疗关键点）诊疗关键点疟疾检验技术第34页卵形疟（卵形疟（P.ovale）诊疗关键点）诊疗关键点1.红细胞略涨红细胞略涨大或不变大大或不变大 2.红细胞边缘红细胞边缘呈车轮状呈车轮状3.环状体有时环状体有时展现鱼眼状展现鱼眼状4.薛氏点显著薛氏点显著 5.成熟滋养体成熟滋养体类似三日疟类似三日疟原虫原虫,但更粗但更粗大大6.原虫呈卵圆原虫呈卵圆形形 疟疾检验技术第35页 薄血膜中疟原虫寄生时薄血膜中疟原虫寄生时 红细胞改变红细胞改变间日疟原虫间日疟原虫 三日疟原三日疟原虫虫恶性疟原虫恶性疟原虫卵形疟原卵形疟原虫虫涨大涨大,色浅淡色浅淡,略变略变形形 可见薛氏点可见薛氏点(除早除早期环状体时期环状体时)多重感染少见多重感染少见 疟色素黄褐色疟色素黄褐色,散散在在,呈小杆状呈小杆状正常,或略小 正常染色时点彩不显著多重感染少见 色素见于早期,黑色颗粒状,多见于细胞周围正常大小 常见多重感染 一些细胞呈黄色边缘较厚 过分染色时茂氏点显著 疟色素颗粒较粗 新月形配子体外红细胞膜见不到感染红细胞略涨大或不变大 通常呈卵圆形 感染红细胞边缘破碎状 薛氏点显著疟色素棕黄色,类似间日疟原虫疟疾检验技术第36页种种周周 围围 血血中中 发发 育育阶段阶段红细胞形态红细胞形态疟原虫形态疟原虫形态大小大小点彩点彩胞浆胞浆疟色素疟色素裂殖子数裂殖子数恶恶性性疟疟原原虫虫环状体环状体配子体配子体正常正常常常 见见茂茂 氏氏点点环环状状体体钎钎细细，常见个核常见个核粗粗黑黑，配配子子体中显著体中显著16-32间间日日疟疟原原虫虫各各 期期 滋滋养体养体裂裂 殖殖 体体和和配子体配子体涨涨 大大,可可达达 正正 常常 1.5-2 倍倍薛薛 氏氏点点 可可出现出现阿阿米米巴巴样样滋滋养养体体，浅浅蓝蓝色色，活泼活泼金棕色金棕色不显著不显著12-24卵卵形形疟疟原原虫虫各期滋各期滋养体养体裂殖体裂殖体涨涨 大大,可可达达 正正 常常 1.25-1.5倍倍薛薛 氏氏点点 可可出现出现卵卵圆圆形形滋滋养养体体，蓝蓝色色较较深深，核核较大较大深棕色深棕色显著显著4-12三三日日疟疟原原虫虫各期滋各期滋养体养体裂殖体裂殖体和和配子体配子体正常正常西西 门门氏氏 点点少见少见圆圆形形，蓝蓝色色深深，核核紧紧缩缩，滋滋养养体带状体带状深棕色，粗深棕色，粗显著显著6-12呈菊花状呈菊花状疟疾检验技术第37页镜检示教镜检示教以下血片采自现症病例以下血片采自现症病例疟疾检验技术第38页This is a thin film from a 27 year old female backpacker,with a recent history of trekking through Northern Thailand and high fever.A typical Plasmodium falciparum presentation.Numerous fine ring forms Double chromatin dots Marginal forms Red cells are not enlarged疟疾检验技术第39页A thin film from a 22 year old male holidaying in Lombok(Indonesia)one month previously.Intermittent fevers since returning.A typical Plasmodium vivax presentationSalient features are:Developing and thick(signet)ring forms Enlarged red cells 疟疾检验技术第40页Recent travel in Africa.Pyrexia of unknown origin.A typical Plasmodium ovale presentationDeveloping form of plasmodium Comet-like red cells Enlarged red cell 疟疾检验技术第41页Female patient,arrived from Brazil two weeks previously.Flu like symptoms since arrival.A typical Plasmodium malariae presentationBroad band form of plasmodium Red cells not enlarged疟疾检验技术第42页This is a thick film prepared from a 32 year old male recently returned from Vietnam.Numerous ring form of Plasmodium can be seen(as indicated by the arrows).Note size of neutrophils(for comparison).The only definitive diagnosis that can be made from this film is that Malaria is present.Thin films would have to be examined for species identification.疟疾检验技术第43页读片练习读片练习疟疾检验技术第44页2.Intermittent fever;arrived from India 2 months ago.疟疾检验技术第45页3.History of round the world safari including S.America,Asia and Africa.General malaise.疟疾检验技术第46页4.Unspecified overseas travel.Presented with temperature 38.4C 疟疾检验技术第47页5.Male recently returned to Australia after backpacking through Asia.History of flu like symptoms.疟疾检验技术第48页6.New Australian previously from Malaysia.Intermittent temperatures and headaches.疟疾检验技术第49页7.Aches and pains,with fever.?Glandular Fever,?malaria.疟疾检验技术第50页12.Businessman;history of extensive overseas travel.Has had frequent bouts of virus infections.疟疾检验技术第51页14.50 year old male patient presented with fever after holidaying in Viet Nam.疟疾检验技术第52页18.Recent trip to Southern India-headaches and vaguely unwell.疟疾检验技术第53页19.Patient has been holidaying in the Dominican Republic,now feverish.疟疾检验技术第54页20.Unwell and feverish.疟疾检验技术第55页21.A member of the UN forces in East Timor.Presented with high temperature.疟疾检验技术第56页