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选修1 生物技术实践 学问点总结
(一) 无菌操作技术实践
第一节 微生物的分别与培育
1、培育基：为人工培育微生物而制备的适合微生物生长、繁殖或积累代谢产物的养分基质。
2、培育基依据物理性质可分为液体培育基、半固体培育基和固体培育基。在液体培育基中加入凝固剂琼脂（红藻中提取的一种多糖）后，制成固体培育基。微生物在固体培育基表面生长，可以形成肉眼可见的菌落。固体培育基应用于微生物的分别和鉴定。
·依据成分培育基可分为自然培育基和合成培育基。自然培育基是用化学成分不明的自然物质配制而成，常用于实际工业生产，如牛肉膏蛋白胨培育基。合成培育基是用成分已知的化学物质配制而成，其中成分的种类比例明确，常用于微生物的分别鉴定，如葡萄糖铵盐培育基。
·依据培育基的用途，可将培育基分为选择培育基和鉴定培育基。
选择培育基是指在培育基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物生长，促进所需要的微生物的生长。在选择培育基的配方中，将尿素作为培育基中唯一的氮源,原则上只有能够利用尿素的微生物才能够生长。
培育基中加入青霉素可以分别出酵母菌和霉菌、培育基中不加氮源可以分别出固氮微生物、培育基中不加碳源可以分别出自养型微生物
3、培育基的化学成分包括水、无机盐、碳源、氮源、生长因子等。
·碳源：能为微生物的代谢供应碳元素的物质。如CO2、NaHCO3等无机碳源；糖类、石油、花生粉饼等有机碳源。异养微生物只能利用有机碳源。
·氮源：能为微生物的代谢供应氮元素的物质。如N2、NH3、NO3-、NH4+（无机氮源）蛋白质、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨（有机氮源）等。只有固氮微生物才能利用N2。
4、无菌技术：获得纯洁培育物的关键是防止外来杂菌的入侵，要留意以下几个方面：
①对试验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。
②将用于微生物培育的器皿、接种用具和培育基等器具进行灭菌。
③为避开四周环境中微生物的污染，试验操作应在酒精灯火焰四周进行。
④试验操作时应避开已经灭菌处理的材料用具与四周的物品相接触。
无菌技术除了用来防止试验室的培育物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？
答：无菌技术还能有效避开操作者自身被微生物感染。
6、消毒与灭菌的区分
消毒指使用较为温存的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。消毒方法常用煮沸消毒法、巴氏消毒法（对于一些不耐高温的液体）、还有化学药剂（如酒精、氯气、石炭酸等）消毒、紫外线消毒。
灭菌则是指使用猛烈的理化因素杀死物体内外全部的微生物，包括芽孢和孢子。灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌(看书上的图)。
灭菌方法：①接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法；
②玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱；
③培育基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅。
④表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯。
比较项
理化因素的作用强度
毁灭微生物的数量
芽孢和孢子能否被毁灭
消毒
较为温存
部分生活状态的微生物
不能
灭菌
猛烈
全部微生物
能
7、制作固体培育基的方法步骤：计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。
确定培育基制作是否合格的方法：将未接种的培育基在恒温箱中保温1～2天，若无菌落生长， 说明培育基制备成功
8、倒平板操作的争辩
（1）培育基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你怎么估量培育基的温度？
提示：可以用手触摸盛有培育基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。
（2）为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？
通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培育基。
（3）平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
平板冷凝后，皿盖上会分散水珠，凝固后的培育基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培育基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培育基，造成污染。
（4）在倒平板的过程中，假如不当心将培育基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培育微生物吗？为什么？
空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培育基上滋生，因此最好不用该平板培育微生物。
9、纯化大肠杆菌
（1）微生物接种的方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。
（2）平板划线法是通过接种环在琼脂固体培育基表面连续划线的操作。将聚集的菌种逐步稀释分散到培育基的表面。在数次划线后培育，可以分别到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。
（3）稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培育基的表面，进行培育。分为系列稀释操作和涂布平板操作两步。
（4）用平板划线法和稀释涂布平板法接种的目的是：使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在培育基表面形成单个的菌落，以便于纯化菌种。
（5）平板划线法操作步骤：
①将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。 ②在火焰旁冷却接种环，并打开棉塞。
③将试管口通过火焰。 ④将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液。
⑤将试管通过火焰，并塞上棉塞。 ⑥左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环快速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。留意不要划破培育皿。 ⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开头往其次区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。留意不要将最终一区的划线与第一区相连。⑧将平板倒置放入培育箱中培育。
10、平板划线操作的争辩
（1）为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，照旧需要灼烧接种环吗？为什么？
第一步灼烧接种环是为了避开接种环上可能存在的微生物污染培育物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目渐渐削减，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能准时杀死接种环上残留的菌种，避开细菌污染环境和感染操作者。
（2）在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？ 以免接种环温度太高，杀死菌种。
（3）在作其次次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开头划线？
答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开头，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步削减，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
11、涂布平板操作的步骤：
①将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。 ②取少量菌液，滴加到培育基表面。
③将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8～10s。
④用涂布器将菌液均匀地涂布在培育基表面。
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