纳米氧化铈在阿霉素心肌细胞损伤中的作用研究.pdf

基金项目：内蒙古自治区自然科学基金项目（）通讯作者：韩轩茂【临床医学】纳米氧化铈在阿霉素心肌细胞损伤中的作用研究孟颖月，蔺雪峰，韩轩茂（内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院心内一科，内蒙古 包头 ）摘要 目的：在体外细胞水平研究纳米氧化铈（，）对阿霉素（，）心肌细胞损伤的影响及可能的作用机制。方法：利用不同浓度 培养大鼠心肌细胞（），确定体外模拟 心肌损伤的最佳浓度。以此为基础，加入粒径为 的不同浓度的 与 共处理 ，同时设立正常对照组。采用细胞计数盒（）法测定心肌细胞活力，用流式细胞仪测定不同组活性氧（，）表达量，同时用蛋白免疫印迹法（）测定不同组凋亡相关蛋白 、的表达量。结果：选择 处理 作为造模浓度；与正常对照组相比，模型组心肌细胞存活率下降、表达量增加、抗凋亡蛋白 表达量下降、而促凋亡蛋白 的表达量升高（）。与 单独处理组相比，低浓度 （、）与 共处理后心肌细胞存活率上升、表达减少、抗凋亡蛋白 表达量上调并且促凋亡蛋白 的表达量下调（）；而高浓度 （）与 共处理后，相较于 单独处理组，细胞存活率下降更明显（）、表达量增加（），而凋亡相关蛋白的表达量没有明显变化（）。结论：粒径为 的低浓度 （、）可以通过缓解氧化应激水平，减少细胞凋亡保护 诱导的心肌细胞损伤；而高浓度 （）对 心肌损伤没有保护作用。关键词 纳米氧化铈；阿霉素；心脏毒性；氧化应激；细胞凋亡 ：，（，）：（）（）：，年第 卷第 期 （），（，）：，（），（、）（）；（）（）（），（）：（，）（）；多柔比星（，），俗称阿霉素，在多种实体肿瘤和血液系统肿瘤的联合化疗方案中发挥着重要的作用。然而，不可逆的心脏毒性会随着 使用剂量的累积而发生，成为限制该药物持续使用的主要原因 。与 明确的抗肿瘤机制所不同的是，心脏毒性被认为是多因素复杂作用的结果，现在主要认为与氧化应激损伤和细胞凋亡有关 。因此，对 心脏毒性的机制进行深入理解，开发更为有效的保护药物，与 协同作用的同时，降低心脏毒副损伤的发生，这在临床上是迫切需要的。纳米氧化铈（，）是一种具有双重表面价态的纳米材料，其表面同时存在 与 ，两种价态之间快速可逆转化的能力赋予 抗氧化与促氧化的双重特性 。已有研究表明，能够通过减轻心肌氧化应激水平和降低炎症因子的表达治疗缺血性心肌病 。但 对 心脏毒性的作用尚不明确，本研究通过体外建立 心肌损伤模型，探索粒径为 的不同浓度 对心肌细胞的作用及相关机制。材料与方法 材料 细胞与培养本实验所用大鼠心肌 细胞株购自武汉普诺赛公司。最适培养基为含有 胎牛血清（）的高糖 培养基，放于 含 的恒温培养箱中常规传代培养。药品与试剂 平均粒径为（），粒径 购自美国 公司；（纯度：）购自上海源叶生物科技有限公司；胎牛血清（）、细胞增殖试剂盒、活性氧测定试剂盒均购自上海碧云天科技公司；凋亡相关蛋白 、内参蛋白 一抗及羊抗兔二抗购自北京 公司。方法 检测不同组细胞存活率待细胞贴壁生长融合至 时，用 胰酶消化离心后制成细胞悬液，使用细胞计数板进行细胞计数后调整细胞密度为 ，每孔取 接种于 孔板中，待细胞贴壁均匀完全后，弃掉旧培养基，更换为含有不同浓度 （、）的完全培养基（）继续培养 ，每组 个复孔，并设置空白组（只含培养基，不接种细胞），选取半数抑制浓度（）的 作为造模浓度，用于后续实验。随 后，加 入 不 同 浓 度 （、）与造模浓度 的混合液共同处理细胞 ，每组 个复孔，同时设立正常对照组。为避免纳米颗粒聚集后影响实验效果，溶液需提前用超声波清洗器超声 ，分散 。年第 卷第 期 细胞处理结束后，弃掉旧培养基，加入 用完全培养基配制的 工作液，敷育 ，为避免 颗粒发生团聚，造成培养基浑浊对 值产生影响，采用双波长法检测 值（参比波长 ，检测波长 ），并计算细胞存活率。检测不同组细胞 表达量细胞接种与分组同 中 与 共处理，给药处理结束后，加入 不含 的胰酶消化细胞，用新鲜的无血清培养基终止消化，离心收集细胞于 管中，用预冷 洗涤 次，在遮光条件下，往每管中加入 的用无血清培养基稀释为 的 ，二氯二氢荧光素二乙酸酯（，）工作液，避光反应 ，期间需每隔 上下颠倒 管以使反应充分。探针敷育结束后，上机检测，最后根据活性氧检测试剂盒说明书计算各组的 表达量。检测不同组凋亡相关蛋白表达情况将细胞接种于 孔板中，按照 中 与不同浓度 共培养的实验分组给药，待细胞处理结束后，用预冷的 漂洗 次，加入适量的细胞裂解液（）在冰上裂解 ，提取各组细胞总蛋白，用 法测蛋白浓度，按照 的上样质量，计算蛋白上样体积，并加入对应体积的抗氧化剂与 ，煮沸变性得到蛋白样品。往每孔中加入计算好的上样体积，经 聚丙烯酰胺凝胶电泳（）分离蛋白条带后，转移到 膜上。用 脱脂牛奶室温封闭 ，缓冲液（）洗 遍后加入 （稀释），（稀释）一抗，敷育过夜，次日回收一抗，洗膜洗 遍，加入兔二抗，室温敷育 ，随后再用 洗 遍，用 化学发光液显影，在蛋白成像系统上曝光，最后用 软件分析蛋白灰度值。统计学处理采用 统计软件进行分析，原始实验数据先经正态性检验和方差齐性检验，符合正态分布的计量资料以（）表示，多组间数据比较采用单因素方差分析（），方差齐组间多重比较用 法，以 为差异具有统计学意义。统计图使用 制作。结果 损伤心肌细胞模型的建立为建立 心肌损伤体外模型，本实验使用从 的 浓度梯度，欲摸索 处理 后致心肌细胞死亡的半数抑制浓度（）。实验结果发现：心肌细胞存活率随着 使用浓度的升高呈剂量依赖性下降（图 ），且 处理 后心肌细胞活力较正常对照组（含实验组相应量的溶剂 ）约下降一半（）。因此，明确本实验后续 造模的最佳浓度为 。图 浓度梯度 处理 对 心肌细胞存活率的影响注：与正常对照组相比，处理减轻 诱导的心肌细胞存活率下降在明确 为最佳浓度前提下，加入不同浓度梯度的 与 的 共同孵育心肌细胞。实验结果发现：与正常组相比，处理 后，心肌细胞存活率降至（），表明 模型构建成功；而与 单独处理组相比，分别与 、共处理 后，心肌细胞存活率分别升高至（）、（）、（），差异有统计学意义（）（图 ）；而当与 共处理 后，心肌细胞存活率下降至（），差异有统计学意义（）（图 ）。因此，低浓度 （）可以显著提高 损伤后心肌细胞存活率，而高浓度 （）对 引起的心肌细胞存活率下降没有保护作用。与 共处理对心肌细胞 表达 年第 卷第 期 的影响通过流式细胞仪分析不同组 表达的情况，实验结果发现：与正常对照组相比，处理 后，表达水平明显升高（）（图 ）；说明 作用后引起心肌细胞氧化应激损伤，然而，与 组相比，联合应用低浓度 （），表达水平明显下降（）（图 ），而联合应用高浓度 （），表达量较 单独处理组有所增加（）（图 ）。图 与浓度梯度 共处理 对 心肌细胞存活率的影响注：与正常对照组（）相比，；与 组相比，图 不同组心肌细胞 表达情况注：图：不同组心肌细胞 表达峰图；图：不同组心肌细胞 表达叠加图；图：不同组心肌细胞 含量比较，与正常对照组相比，；与模型组相比，与 共处理对心肌细胞凋亡相关蛋白表达的影响采用 方法检测不同组凋亡相关蛋白，实验结果发现：与正常对照组相比，处理 后，促凋亡蛋白 表达量明显升高，抗凋亡蛋白 表达量明显下降（）（图 ）；与 组相比，联合应用低浓度 （）可以显著提高抗凋亡蛋白 的表达量，下调促凋亡蛋白 的表达量（）（图 ）；而联合应用高浓度 （）对 凋 亡 相 关 蛋 白 的 表 达 没 有 影 响（）（图 ）。图 与浓度梯度 共处理 后凋亡相关蛋白表达图注：图 ：与浓度梯度 共处理后凋亡相关蛋白和内参蛋白电泳图；：正常对照组；：处理组；：处理组：处理组；：处理组；：处理组。图 ：图 各组蛋白条带的相对灰度分析图；与正常对照组相比，；与 组相比，表示无统计学意义 讨论 作为最经典有效的蒽环类化疗药物，已为大量的癌症患者延长了生存时间。然而，大量文献指出，会引起心、肝、肾等脏器的毒性，其中，最具限制性的不良反应特征是心血管毒性的发生率增加，主要表现为 剂量和时间依赖性的，进展性的不可逆性的充血性心力衰竭的发生 。心脏毒性的分子机制目前仍未完全阐明，目前广泛认可的造成心肌细胞损伤的机制为氧化应激和细胞 年第 卷第 期 凋亡，并且认为两大机制之间可能互为因果，共同促进 心脏毒性的发生 。作为最常见的镧系金属氧化物，以二氧化铈（）和三氧化二铈（）两种氧化物形式存在，是经 还原后得到，铈（）从 价变为 价 。价与 价之间相互快速可逆转化的能力赋予了 促氧化与抗氧化的双重性质。研究表明 ，的粒径越小，比表面积越大，晶粒表面的氧空位缺陷越多，的含量越高，其抗氧化的能力越高，推荐使用粒径 以增加 的价态百分比。因此，本研究选择粒径为 的 。基础实验发现将 与传统化疗药物联合、或通过将它表面修饰后作为化疗药物的递送载体，不仅能够克服化疗药物的毒副作用，并且能够通过逃避免疫，有望实现癌症的精准靶向治疗，提高化疗效果 。但是，对 心脏毒性是否具有保护作用，国内外文献研究不足。本研究体外模拟 心脏毒性，探讨不同浓度 对 心肌细胞损伤的作用。实验表明：低浓度 （）与 联合处理，可 以 改 善 引 起 的 细 胞 活 力 下 降，而 的 会加重心肌细胞死亡。这与 等 发现 在低浓度（）下对乳腺癌细胞没有显示出任何显著的毒性，但在较高浓度（）下会导致细胞死亡的结果相似。有文献指出 ，心脏毒性的发生与 定位于线粒体后干扰线粒体能量代谢，触发心肌细胞氧化应激损伤和细胞凋亡的发生有关。而 作为一种优异的抗氧化纳米材料，凭借其独特的表面价态，在细胞线粒体定位后，不仅可以抑制 生成，也可以清除已经存在的 ，进而减少下游凋亡信号通路的激活 。与此相似，本研究结果发现：处理后，和促凋亡蛋白 表达增加，抗凋亡蛋白 表达减少；而经低浓度 共处理后，抑制了 和 的表达，上调了 的表达。但是，高浓度 与 共处理后，的表达较 单独处理有所增加，猜测这可能与高浓度 在培养液中团聚后导致纳米颗粒表面积减少，引起表面 百分含量上升，百分含量下降而导致其发挥促氧化作用有关。综上所述，本研究证实了粒径为 的低浓度 对 心肌细胞损伤有保护作用，这种保护作用与缓解氧化应激水平，减少细胞凋亡有关。接下来还应在动物水平开展实验，体内外相结合验证 保护 心肌损伤的具体机制，为临床上开发新的 心脏毒性保护药物提供新思路。参考文献 ，：，（）：，：，：（），（）：，（）：，：，（）：，：，：，年第 卷第 期 ，（），（）：，（）：，：，：，（）：，：，（）：（收稿日期：櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂）（上接第 页），（）：，（）：，：罗潇潇，方雷，赵健，等白藜芦醇通过 通路改善血管性痴呆大鼠学习记忆能力的机制研究 右江民族医学院学报，（）：，（）：，：，：，（）：，：，：，：，（）（），（）：（收稿日期：）年第 卷第 期