蛋白质磷酸化修饰及其在细胞周期调控中的作用研究进展.pdf

蛋白质磷酸化修饰及其在细胞周期调控中的作用研究进展*谭锬1，2）柯柏怡1）梁前进2）（1）南华大学衡阳医学院生物化学与分子生物学教研室，湖南衡阳；2）北京师范大学生命科学学院，抗性基因资源与分子发育生物学北京市重点实验室/细胞增殖与调控生物学教育部重点实验室，北京）摘要细胞周期是真核生物实现细胞分裂与增殖、从母代向子代传递遗传信息的连续过程.真核细胞通过蛋白质水平的周期性调控完成细胞的分裂与增殖，细胞周期的紊乱常与肿瘤等疾病密切相关.蛋白质磷酸化修饰是细胞周期进程中一种主要的调控方式，可以改变蛋白质的分子结构，影响其与其他分子间的相互作用，从而调节相关分子的生物学活性及功能.细胞周期相关蛋白的磷酸化与非磷酸化状态的改变犹如“分子开关”，精细地控制着周期进程和细胞分裂系列事件.周期相关蛋白质的多位点磷酸化机制研究是磷酸化研究的一个热点.本文综合评述细胞周期调控进程中部分重要蛋白的磷酸化修饰机制，总结了近年来细胞周期领域中蛋白质磷酸化修饰方面的新发现、新突破，为进一步深入理解蛋白质磷酸化及细胞周期调控机制提供参考.关键词蛋白质磷酸化；蛋白激酶；细胞周期；蛋白去磷酸化；蛋白磷酸酶中图分类号Q2DOI：10.12202/j.0476-0301.20230781细胞周期的特点细胞周期（cellcycle）是指细胞分裂进程的周期性过程.其中：DNA 复制所在的时期称为 S 期（synthesisphase）；完成复制的 DNA 分离进入 2 个子代细胞的时期称为有丝分裂期（mitoticphase，M 期）；在 S 期之前的 DNA 复制准备期称为 G1 期，而在 S 期之后的有丝分裂准备期则称为 G2 期.G1、S 和 G2 期统称细胞分裂间期（interphase），与分裂期对应.在正确的时间完成遗传物质 DNA 的复制，并将复制的 DNA 精确地分配到 2 个子代细胞中，是细胞周期进程的第一要务1.这种精确的细胞运转机制具有一些基本特征：首先，细胞周期运转呈现动态性（dynamicity）.一方面，染色体（包括间期的染色质形态和分裂期相对浓缩的染色体形态）在不同时期压缩及松弛的变化体现出动态性；另一方面，各种亚细胞器或亚细胞结构（如纺锤体、中心体、线粒体、内质网等）在不同时期的解聚和重塑-重建变化也体现出周期性动态.并且细胞周期的动态性只能是 G1 期进入 S 期，S 期进入G2 期，G2 期进入 M 期、再从 M 期退出周期或转入下一周期的单向运转2.再者，细胞周期运转具有明显的“控制开关”（switch-likecontroller）3，细胞在 G1/S 期、G2/M 期、中期/后期（metaphase/anaphase）等周期转换的过程体现出细胞周期运转的快速、骤变特性相邻 2 个细胞周期之间的转换从不“拖泥带水”，也不会出现 2 个时期的叠加，特定细胞内的“开关”对细胞周期实现了精确调节.目前，周期性“控制开关”的概念已延伸至细胞内某些细胞器，如中心体复制的精确调控.中心体分裂的相关控制因子与细胞周期整体开关的分子调控有机结合，体现出细胞器周期与细胞周期的统一性4.此外，细胞周期运行和调控在分子水平呈现震荡性（oscillation）.一般认为 Cdks/Cyclins 家族蛋白激酶发挥“引擎”作用，推动着细胞周期事件的启闭和运转，在每一个特定细胞时期（周期时相）及其转换过程中都有相应的 Cdk/Cyclin 激酶发挥功能5.虽然在酵母细胞中的研究证实，S-Cdk 能够代替 M-Cdk 的部分功能，诱导酵母细胞进入 M 期，但这样的细胞无法退出 M 期6.目前的研究普遍认为，以 Cdks/Cyclins 为代表的蛋白激酶对底物（蛋白质）的磷酸化修饰是驱动细胞周期进程的关键因素.因此，蛋白质磷酸化修饰研究是理解细胞周期特征和运行机制的重要角度.*湖南省自然科学基金资助项目（2020JJ5478）；国家自然科学基金资助项目（31571394）；北京师范大学教学建设与改革/信息化与教育教学融合项目基金资助项目（18-04-05）通信作者：梁前进（1963），教授，博士生导师.研究方向：细胞遗传学.E-mail：L收稿日期：2023-05-04北京师范大学学报（自然科学版）2024-0238JournalofBeijingNormalUniversity（NaturalScience）60（1）2蛋白质磷酸化概述人类细胞中有 75%的蛋白可以发生磷酸化修饰7.在激酶的催化下，这些蛋白质的特定氨基酸残基侧链共价结合 ATP 提供的磷酸基团而得到修饰.被磷酸化诱导的蛋白质结构改变，一方面可以影响蛋白质本身的生物学活性或者其在细胞中的定位，另一方面也可以影响该蛋白质与其他分子、结构之间的相互作用.近期的研究发现，HEK293T 细胞中有 316 种蛋白质具有磷酸化敏感性的蛋白互作特点，它们与其他蛋白间的联系会随着广谱性磷酸酶的处理而消失8.磷酸基团在生理状态下带有负电荷，并具有较大的负电荷密度和水化膜，使之很容易与精氨酸等带正电荷氨基酸的侧链形成稳定的氢键或盐桥（saltbridge）9.磷酸基团很好地介导了分子间或分子内成分的相互作用.作为经典的翻译后修饰方式，蛋白质磷酸化具有一些显著的特点.1）蛋白质的磷酸化修饰是可逆的.目前已在人体细胞中发现 500 多种蛋白激酶10，同时也发现了约 200 种催化磷蛋白去磷酸化的磷酸酶11.针对某一蛋白质的激酶与磷酸酶的相对活性，决定了该蛋白质是否处于磷酸化的状态.2）蛋白质磷酸化修饰具有很好的稳定性.一方面磷酸酯键在 pH7 左右的生理状态下较为稳定（单磷酸酯在 25 环境下的半衰期为 1012年12）；另一方面生物体内以 ATP 作为能源物质，当磷酸化以 ATP 作为磷酸供体时，ATP/ADP 比例较高，蛋白质被磷酸化以后容易维持磷酸化修饰13.3）蛋白质磷酸化修饰在真核生物中普遍存在，除了丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）这3 种能发生磷酸化修饰的经典氨基酸外，组氨酸（His）、精氨酸（Arg）、赖氨酸（Lys）、天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）及半胱氨酸（Cys）等 6 种氨基酸也能发生磷酸化修饰14.20 种常见氨基酸中有 9 种氨基酸的残基侧链可以发生磷酸化修饰，体现了该修饰的普遍性.虽然最近在 HeLa 细胞中鉴定出了 560 多个组氨酸磷酸化位点15，但这些磷酸化位点的功能仍不清楚，目前在细胞周期研究领域中的主要关注点仍集中于Ser、Thr 和 Tyr 位点的磷酸化.蛋白质磷酸化修饰广泛参与调控生物的生长、发育、衰老、死亡、信号转导以及各种疾病的发生与发展过程.3G1/S 期转换相关的蛋白质磷酸化修饰3.1Rb 蛋白的磷酸化细胞 G1/S 期转换的精细调控是关乎遗传物质复制起始的重要事件，Rb 蛋白（retinoblastoma protein）的 超 磷 酸 化（hyperphosphory-lation）是细胞从 G1 期进入 S 期的关键调控事件，该蛋白上有 10 多个潜在的 Cdk/Cyclin 激酶磷酸化位点.在细胞进入 S 期之前，Rb 蛋白一直处于低磷酸化（hypophosphorylated）状 态16，在 G1 期 被 Cdk4/CyclinD 磷酸化并与转录因子 E2F 结合，抑制相关基因转录活性17，而在G1/S 期转换过程中进一步被Cdk2/CyclinE磷酸化后与 E2F 分离，被释放的 E2F 发挥转录因子活性，驱动细胞进入 S 期18.E2F 可以识别 40 多个与细胞周期相关基因的启动子位点，其中包括驱动细胞进入 S 期相关的 Cylin E、c-Myc、Cdk2 等基因以及与DNA 复制相关的 ORC、MCMs、Cdc6 等基因的表达19.在近期研究中，科研人员以 Rb 上 14 个 Cdk 磷酸化位点为干预对象，让细胞只表达具有单一 Cdk 磷酸化位点的突变体 Rb，发现每一种突变细胞都能引起不同的基因转录20，这说明 Rb 磷酸化的不同程度及位点与 E2F 启动特定的基因表达有着精细而严格的调控.除了 Cdk/Cyclin 外，p38、Chk1/2 及 AuroraB 也可以磷酸化 Rb，但这些磷酸化反应均是在细胞应激（stress）条件下发生的2123.实际上，Rb 除了能调控 E2F 转录因子的活性外，还能结合其他多种转录因子，从而体现出功能多样性.虽然目前的研究表明 Cdk/Cyclin 是调控 Rb 的关键激酶，但在众多位点的磷酸化反应是否具有先后顺序，是否存在磷酸化反应的异质性，调控关系是否与磷酸化反应的位点数量相关等问题尚不甚明确.3.2DNA 复制起始相关蛋白的磷酸化DNA 复制是 S 期最重要的事件，DNA 复制的起始也是 S 期开始的标志性事件.对酵母的研究发现，DNA 复制前需要在起始点附近形成前复制复合体（Pre-ReplicativeComplex，Pre-RC）主要包含 ORC16、Cdc6、Cdt1和 MCM27，已在 G1 末期组装完成24.Cdc6 和 Cdt1是 DNA 复制许可因子（licensingfactor），它们在 G1/S期转换过程中开始发生磷酸化，之后被泛素化介导的蛋白酶体降解25.当 Cdc6 和 Cdt1 发生磷酸化修饰而离开 Pre-RC 后，DNA 开始复制24.哺乳动物细胞的Pre-RC 调控更为复杂，最近发现 Cdc6 与 ORC1 的多段 线 性 蛋 白 基 序（multipleshortlinearproteinmotifs，SLiMs）及-螺旋之间的相互作用也可能是 DNA 复制起始的关键2627.酵母细胞中 Cdc28（Cdk）对 Cdc6 多位点磷酸化的分子机制研究得较为深入.酵母细胞的 Cdc6 包含了 8 个 S/TP 序列，其中 6 个满足 S/TPxR/K（x 是任意氨基酸）的 Cdk 典型磷酸化位点条件28.通过对 Cdc6N 端序列的 Cdc28 磷酸化研究发现，Cdk 结合蛋白 Cks1 是介导 Cdc28 磷酸化 Cdc6 的关键蛋白.一方面 Cks1 可以结合 Cdc6 上磷酸化的 T7（Thr7）位第 1 期谭锬等：蛋白质磷酸化修饰及其在细胞周期调控中的作用研究进展39点；另一方面 Clb5（酵母的 S 期 Cyclin）可以稳定结合Cdc6 上的 RxL 基序，从而帮助 Cdc28 实现对 Cdc6 的多位点磷酸化修饰2930.除了 Cdc6 之外，Cdk/Clb/Cks激酶复合体也参与调控间期 Cdk 抑制蛋白 Sic1（酵母的 p27 同功能蛋白）、G2/M 期转换关键蛋白 Swe1（酵母的 Wee1 同源蛋白）、Fin1、Whi5、Hcm1 等许多蛋白的多位点磷酸化调节29，3132，在含有 Cks 结合位点突变型 Swe1 的酵母细胞中，Cdk 的活性明显增强，但其磷酸化水平似乎并未减弱29，这说明 Cdk/Clb/Cks复合体磷酸化 Swe1 的分子机制仍不清楚.这可能与Swe1 磷酸化主要发生在 M 期有关，暗示不同细胞周期时相内的磷酸化修饰方式可能存在较大的差异.Cdk/Clb/Cks 复合体结合底物蛋白之后，一次性完成多个位点磷酸化的方式称为过程式磷酸化修饰（processivephosphorylation）33.虽然蛋白质的多位点磷酸化可以为蛋白质的功能性改变提供一个阈值，即蛋白质磷酸化到某一程度以后，蛋白质的结构及功能方发生改变，但这种理论并不能很好地解释细胞周期调控的瞬时“开关”特征34.而对细胞周期 Cdk 多位点磷酸化机制的研究，为解释细胞周期的“开关”特性提供了一种可能.4G2/M 期转换相关的蛋白质磷酸化修饰目前认为，M-Cdk1（主要是 Cdk1/CyclinB）是细胞由 G2 期进入 M 期的关键控制因子1，又称为有丝分裂 促 进 因 子（MPF）.在 高 等 真 核 生 物 中，磷 酸 酶Cdc25 去 除 Cdk1 的 T14/Y15 抑 制 性 磷 酸 化 而 激 活Cdk1，活化的 Cdk1 可以通过磷酸化修饰反馈活化Cdc25，从而进一步激活 Cdk1.Cdk1 与 Cdc25 之间的正反馈调节可能是驱动细胞进入 M 期的重要机制35.在非洲爪蟾卵细胞中发现，除了 Cdk1 外，Cdc25C（非洲爪蟾 Cdc25 的主要亚型）也可受到 Plx1、MAPK 和RSK 等 多 种 蛋 白 激 酶 的 磷 酸 化 调 控3638，这 些 非Cdk1 激酶可能是 Cdc25C 早期活性的诱导者.具有初步活性的 Cdc25C 随后与 Cdk1 之间产生正反馈激活，从而彻底活化 Cdk1.除了磷酸化激活 Cdc25C 外，活化的 Cdk1 还有多方面功能：1）Cdk1 可以磷酸化抑制 Wee1 和 Myt1 蛋白激酶3940，防止后者对 Cdk1 活性抑制位点 T14/Y15 的磷酸化，这形成了 Cdk1 和 Wee1 或 Myt1 之间的正反馈调节35；2）Cdk1 通过磷酸化激活蛋白激酶 Greatwall（哺乳动物细胞称为 MASTL），后者磷酸化修饰并激活磷酸酶 PP2A/B55 的抑制因子 ENSA/ARPP194142，从而抑制 M 期磷酸酶活性；3）Cdk1 磷酸化并激活众多参与有丝分裂亚细胞结构变化相关蛋白，启动诸如核膜崩解、核仁解体、纺锤体形成等有丝分裂事件43.虽然 Cdk1 与 Cdc25 之间的正反馈模型被用来解释M-Cdk1 的活化过程，但是这种“鸡生蛋，蛋生鸡”的正反馈模型是如何被启动的、Cdk1 与非 Cdk1 激酶如何协同参与磷酸化而激活 Cdc25 等问题尚不明确.Cdc25C 的 M 期特异性磷酸化具有显著特征.受多位点磷酸化的 Cdc25C 表观相对分子质量会异常增大，在 SDS-PAGE 中出现明显的泳动滞后现象4446，这一 M 期特有的磷酸化现象被称作 M 期超位移（M-phasesupershift）44，常被用作细胞进入 M 期的生化标志.最近的研究发现，Cdc25C 的多位点磷酸化并非仅依赖于某一种特定的蛋白激酶，且发生区域集中在蛋白质调节域（非酶活性功能域），这些区域的S/T 和S/TP 含量较高，且属于内在混乱结构域（intrinsicallydisorderedregion，IDR）44.同时，与细胞 G2/M 期转换调控过程相关的蛋白 Wee1、Myt1 和 Greatwall 也具备和 Cdc25C相似的磷酸化特征44，也发生多位点磷酸化.其中：Myt1 除了被 Cdk1 磷酸化，也能被 Plx1、MAPK 和 RSK磷酸化39，4749；Greatwall 除了受到 Cdk1 的磷酸化调控，也受到 Plx1 的磷酸化调控以及自我磷酸化调控50-51.与 Cdc25C 类似，Wee1、Myt1 和 Greatwall 的磷酸化结构域也是非酶活性区域44，其蛋白磷酸化修饰也会导致表观相对分子质量异常增大（11044104），说明它们也存在 M 期超位移现象.这种现象是否具有普遍性，是否代表了一种新的磷酸化修饰方式，还需进一步研究.人类细胞中有超过 1000 种的蛋白质在 M 期的磷酸化水平会增加，70%以上的蛋白质磷酸化调控发生在 M 期43.除了上述与 G2/M 期转换调控相关的蛋白磷酸化具有 M 期超位移的特征外，其他许多蛋白质在 M 期也会发生超位移磷酸化修饰，并且磷酸化后均会发生细胞学功能转变.表 1 列举出了人类M 期细胞中的部分具有超位移磷酸化修饰的蛋白.然而，具有一定普遍性的 M 期超位移磷酸化修饰的磷酸化特点，与目前常用来解释多位点磷酸化的过程式磷酸化修饰理论并不吻合.一方面，过程式磷酸化对多个位点的催化依赖于单个蛋白激酶与底物的锚定29，31，33，而超位移磷酸化并不依赖于某一种蛋白激酶44；另一方面，从被磷酸化蛋白底物的分子剂量上看，过程式磷酸化后的蛋白，在 Phos-tag聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中往往出现阶梯样的多条带，说明各个底物蛋白分子所含磷酸化位点存在明显的数量差异性29，31，33，而超位移磷酸化蛋白在 phos-tagPAGE中只有单一的条带（图 1），说明该磷酸化后的底物分子在磷酸化位点数量上是基本均一的44.40北京师范大学学报（自然科学版）第 60 卷5小结与展望蛋白质磷酸化修饰是细胞周期相关调控蛋白最常见的翻译后修饰方式之一，蛋白质可逆的磷酸化修饰几乎贯穿了细胞周期调控的每一个重要节点.从很大意义上讲，蛋白质磷酸化是细胞周期调控中的主旋律.截止到 2023 年 4 月，著名的 PhosphoSitePlus 数据库已收录了超过 29 万个人类蛋白质磷酸化位点的信息.底物蛋白质的磷酸化修饰效应，实际上是蛋白激酶与相应磷酸酶的活性相对变化的结果.激酶活性高于磷酸酶，则底物蛋白体现为磷酸化修饰效应；激酶活性低于磷酸酶，则底物蛋白体现为去磷酸化修饰效应.单一或者少数位点的蛋白质磷酸化修饰方式比较简单，易于理解；但多位点的磷酸化修饰机制较为复杂，在不同的细胞周期阶段（如间期和 M 期）的多位点磷酸化机制可能存在不同；许多蛋白（如Rb、Cdc6、Cdc25、Greatwall、Myt1、APC3 等）的多位点磷酸化修饰，往往在细胞周期的关键调控事件中扮演着重要的角色.蛋白质多位点磷酸化修饰可能与细胞周期调控的超敏性（ultrasensitivity）密切相关72.近年来，对多位点磷酸化修饰的研究已经进入了“深水区”.这些研究极大地丰富和发展了蛋白质磷酸化表1部分 M 期发生超位移磷酸化的人类蛋白蛋白名称间期功能M期功能参考文献Bora核仁组织中心成员激活AURKA和Plk152NUP35核孔组成蛋白调控纺锤体组装和染色体定位53NUP98核孔组成蛋白调控纺锤体极性54TPR核孔组成蛋白调控纺锤体检验点55CENPF核基质组成蛋白M期着丝粒组成蛋白56CENPT核体组成蛋白M期着丝粒组成蛋白57INCENP核质和核体的组成蛋白染色体过客复合物组成蛋白58Ki-67核质和核仁的组成蛋白包裹染色体的周围区域59NuMA1核基质组成蛋白与有丝分裂纺锤极基质相关60YAP1转录激活调控纺锤体检验点6153BP1DNA损伤应答动粒有丝分裂检查点信号62BRCA1DNA损伤应答调控纺锤体组装63Paxillin黏着斑组成蛋白促进双极性纺锤体形成64Zyxin黏着斑组成蛋白与有丝分裂器有关65Anillin核内actin结合蛋白调控胞质分裂66MAP7稳定微管控制纺锤体长度67BCL9Wnt信号通路成员调控纺锤体组装68MINK1信号通路激酶调控胞质分裂69STIM1调控内质网结构和功能阻隔内质网与纺锤体的结合70Dynactin1Dynein驱动的囊泡运输纺锤体定向71磷酸化未磷酸化磷酸化未磷酸化aba.发生过程式磷酸化的蛋白因分子间磷酸化程度不均一，常在 Phos-tagSDS-PAGE 表现为多条磷酸化蛋白条带；b.发生超位移磷酸化蛋白因各个分子磷酸化程度均较高，在短时间内所有蛋白分子磷酸化程度呈现均一性，常在 Phos-tagSDS-PAGE 中表现出单一条带.这里的 Phos-tag（也称 Phosbind）是在中性 pH（生理 pH）条件下能特异性结合磷酸离子的一种功能性双环金属络合物.Phos-tagAcrylamide 可用于磷蛋白的电泳分离，Phos-tagBiotin 可用于磷蛋白的 Westernblot 检测，Phos-tagAgarose 可用于磷蛋白纯化，Phos-tagMass 分析试剂盒可用于磷蛋白质谱（MALDI-TOF/MS）检测.由于 Phos-tag捕获磷酸基团的专门特性，Phos-tag磷酸亲和分析法获得的蛋白质磷酸化分析结果可靠性强，代表了蛋白质磷酸化研究的一项技术发展.图1过程式磷酸化蛋白和超位移磷酸化蛋白在 Phos-tagSDS-PAGE 中泳动情况模式第 1 期谭锬等：蛋白质磷酸化修饰及其在细胞周期调控中的作用研究进展41修饰的基础理论.相比于单一或少数位点的磷酸化，多位点磷酸化常需要除蛋白激酶外的其他蛋白因子参与（图 2）.人类基因组内含有大约 500 种蛋白激酶基因，这些占人类基因组 2%的蛋白激酶所催化的蛋白质磷酸化常决定底物蛋白的结构建制和活性，同时标志着蛋白质所在信号途径的激活或失活.蛋白质磷酸化影响着细胞内的信息传递过程，也影响着细胞对外在刺激做出反应的适合度和精确度，而细胞周期调控中的蛋白激酶-磷酸酶无疑扮演了此类调控的“明星角色”.ATPATPADPADPSSSSPPPPPPPP磷酸酶磷酸酶激酶激酶/非激酶蛋白Mg2+Mg2+aba.单一或少数位点蛋白质底物（S）磷酸化由专一性激酶催化，在 Mg2+的参与下，将 ATP 上的 位磷酸基团（P）转移到蛋白质的丝氨酸、苏氨酸或者酪氨酸等氨基酸残基上；专一性磷酸酶则负责对磷蛋白进行去磷酸化，某些磷酸酶的活化也可能需要其他金属离子如 Ca2+的参与.b.多位点蛋白质底物磷酸化除了需要 ATP、Mg2+的参与，常需要其他非激酶蛋白的参与，例如Cdk/Cyclin 介导的多位点磷酸化，需要 Cks 蛋白的辅助参与；超位移磷酸化也可能需要其他非激酶蛋白（因子）的参与.图2蛋白质磷酸化示意基础理论的突破往往可带来人们对客观事物认知的重大改变.对蛋白质磷酸化修饰机制的深入探究，不仅会对细胞周期调控研究领域带来全新的认识，也将对生命科学其他领域产生重大影响.6参考文献MORGAND.Thecellcycle：principlesofcontrol（primersinbiology）M.London：NewSciencePress，20071NOVKB，TYSONJJ.Mechanismsofsignalling-memorygoverningprogressionthroughtheeukaryoticcellcycleJ.CurrentOpinioninCellBiology，2021，69：72STALLAERT W，KEDZIORA K M，CHAO H X，et al.Bistable switches as integrators and actuators during cellcycleprogressionJ.FEBSLetters，2019，593（20）：28053梁前进.细胞器不依赖于 DNA 的复制：中心体自主复制解读 J.科学通报，2017，62（13）：13334POONRYC.Cellcyclecontrol：asystemofinterlinkingoscillatorsJ.MethodsinMolecularBiology，2016，1342：35BASU S，GREENWOOD J，JONES A W，et al.Corecontrol principles of the eukaryotic cell cycleJ.Nature，2022，607：3816SHARMA K，DSOUZA R C J，TYANOVA S，et al.Ultradeep human phosphoproteome reveals a distinctregulatory nature of Tyr and Ser/Thr-based signalingJ.CellReports，2014，8（5）：15837FLOYD B M，DREW K，MARCOTTE E 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