基于COI基因的浙江省内黄缘闭壳龟遗传多样性研究.pdf

Chinese Journal of Wildlife 2024，45（2）：367-377Chinese Journal of Wildlifehttp：/基于COI I基因的浙江省内黄缘闭壳龟遗传多样性研究陈敏1，2，秦媛1，林业宏1，任思齐1，叶嘉政1，郑善坚1*（1.浙江师范大学，浙江省野生动物生物技术与保护利用重点实验室，金华，321004；2.浙江省永康市野生动植物保护管理站，永康，321300）摘 要为了解浙江省内不同黄缘闭壳龟（Cuora flavomarginata）群体的种质资源现状，基于线粒体DNA COI序列对来自浙江省内野外和养殖场的8个黄缘闭壳龟群体的遗传多样性和遗传结构进行比较分析。结果表明：黄缘闭壳龟线粒体COI基因序列长度为1 040 bp，A=27.4%、T=30.5%、C=24.6%、G=17.5%，有较强的AT偏好性；共定义 9 个单倍型，单倍型多样性（Hd）为（0.799 000.210 00），核苷酸多样性（Pi）为 （0.002 090.001 47），呈“高Hd低Pi”遗传分布；不同黄缘闭壳龟群体间的遗传距离为00.003，群体内部的遗传距离为00.004，其中磐安后阁村（YS）群体内部的遗传距离最大，为0.004；单倍型系统发育树并未呈现明显的谱系结构；群体间遗传分化指数（FST）为-0.347 520.822 22，8 个群体的遗传分化不显著（p0.05）；中性检验（Tajima s D=-0.366 27，Fu s FS=-0.605）与核苷酸错配分布均表明，浙江省内黄缘闭壳龟群体并未经历种群扩张事件，同时，由Mantel检验可知，遗传距离与地理距离没有显著的相关性（R=0.293 8，p0.05）；AMOVA分子方差结果显示，群体内的遗传变异高于群体间（85.06%14.94%）。研究表明，浙江省内黄缘闭壳龟群体之间为高单倍型多样性和低核苷酸多样性的遗传特征，并且存在一定水平的遗传分化，群体内存在明显的基因交流，根据COI基因分析显示，在磐安县获得的野生黄缘闭壳龟个体确定为黄缘闭壳龟浙江种，同时也发现存在浙江种与安徽种的杂交种，建议将分化程度不同的黄缘闭壳龟群体划分为不同单元保护。研究结果为浙江省内黄缘闭壳龟种质资源开发利用和合理制定保护措施提供了基础依据。稿件运行过程收稿日期：2023-07-17修回日期：2023-08-14关键词：黄缘闭壳龟；COI；遗传多样性；遗传结构；浙江省Key words：Cuora flavomarginata；COI；Genetic diversity；Genetic structure；Zhejiang Province中图分类号：Q953文献标识码：A文章编号：2310-1490（2024）-02-0367-11DOI：10.12375/ysdwxb.20240216基金项目：浙江省省级重点研发计划项目（2021C02044）第一作者简介：陈敏（1975），男，林业工程师；主要从事野生动物保护与管理工作。E-mail：*通信作者：郑善坚，E-mail：野 生 动 物 学 报第45卷Genetic Diversity Analysis of Cuora flavomarginata Based on COI I Genes in Zhejiang ProvinceCHEN Min1，2，QIN Yuan1，LIN Yehong1，REN Siqi1，YE Jiazheng1，ZHENG Shanjian1*（1.Key Laboratory of Wildlife Biotechnology and Conservation and Utilization of Zhejiang Province，Zhejiang Normal University，Jinhua，321004，China；2.Yongkang Wildlife Protection and Management Station，Zhejiang Province，Yongkang，321300，China）Abstract：In order to understand the present situation of germplasm resources of different Cuora flavomarginata in Zhejiang Province，the genetic diversity and genetic structure of eight C.flavomarginata populations from wild and breeding farms in Zhejiang Province were compared based on mitochondrial DNA COI I sequence.The results showed that the sequence length of COI I gene of C.flavomarginata was 1，040 bp，and the average base content was A=27.4%、T=30.5%、C=24.6%、G=17.5%，with strong AT preference.Nine haplotypes were identified in the eight populations，and the haplotype diversity（Hd）was（0.799000.21000），and the nucleotide diversity（Pi）was（0.002090.00147），showing“high Hd and low Pi”genetic distribution.The genetic distance between different populations ranged from 0 to 0.003.The genetic distance within populations was between 0 and 0.004，among which the genetic distance within Pan an Houge Village（YS）population was the largest，which was 0.004.The haplotype phylogenetic tree did not show obvious pedigree structure.The genetic differentiation index（FST）interval was from-0.34752 to 0.82222，and the genetic differentiation was not significant（p0.05）in eight populations.Tajima s D and Fu s FS test values were either positive（Tajima s D=-0.36627，Fu s FS=-0.605），but statistically insignificant.The distribution of nucleotide mismatches indicated that the population of the C.flavomarginata in Zhejiang Province did not experience a population expansion event.Mantel test showed that there was no significant correlation between genetic distance and geographical distance（R=0.2938，p0.05）.AMOVA analysis found that the genetic variation within populations was higher than that between populations（85.06%14.94%）.The results showed that the populations of C.flavomarginata in Zhejiang Province are characterized by high haplotype diversity and low nucleic acid genetic diversity，and there was a certain level of genetic differentiation，and there was obvious gene exchange among the populations.The wild C.flavomarginata obtained in Pan an County was identified as Zhejiang species according to COI I gene analysis.Moreover，it was also found that there were hybrids between Zhejiang species and Anhui species.It is suggested that the C.flavomarginata populations with different degrees of differentiation should be divided into different units for protection.This study uses genetic diversity analysis to provide a basis for the development and utilization of C.flavomarginata germplasm resources in Zhejiang Province and the formulation of reasonable protection measures.黄缘闭壳龟（Cuora flavomarginata）别名夹板龟、克蛇龟、断板龟和黄缘盒龟，属地龟科（Geoemydidae）闭壳龟属（Cuora），是水陆两栖性龟类。野生黄缘闭壳龟主要分布于我国河南省和安徽省，此外，浙江省、湖南省和台湾地区等地也有野生黄缘闭壳龟的报道1。根据世界自然保护联盟（IUCN）记录，黄缘闭壳龟可分为台湾亚种（C.f.flavomarginata）、中国大陆南方亚种（C.f.sinensis）以及日本琉球亚种（C.f.evelynae）2。由于黄缘闭壳龟具有极高的食用、药用价值，驯化性好，长相独特，观赏价值高，其野生资源遭到严重破坏，已被IUCN列为濒危（EN）物种2，被 濒危野生动植物种国际贸易公约 附录收录3，被 中国生物多样性红色名录脊椎动物卷（2020）列为极危（CR）物种4，2016年被列入 浙江省重点保护陆生野生动物名录5。目前，关于黄缘闭壳龟的研究主要集中在人工养殖与繁殖67、形态与组织8、遗传多样性9及线粒体基因组1011等方面。荆胜利等12和郭旭升等13通过对黄缘闭壳龟保护遗传学等方面的分析，分别探究了大别山区人工驯养黄缘闭壳龟的遗传多样性和368陈敏等：基于COI基因的浙江省内黄缘闭壳龟遗传多样性研究第2期河南信阳黄缘闭壳龟保护区的种群现状，为黄缘闭壳龟后续的保护提供了基础。潘冬冬等14基于线粒体基因对安徽黄缘闭壳龟和台湾黄缘闭壳龟进行了研究，并对其在安徽省皖南山区、大别山区的野外生存情况进行了调查，结果发现黄缘闭壳龟的资源衰退，并存在种质混杂的情况。董传举等15对黄缘闭壳龟种群进行分类时，描述了其生物学特性，但关于浙江省内黄缘闭壳龟种质资源现状、遗传多样性研究却未见报道。因此，本研究利用线粒体COI基因序列对浙江省内不同黄缘闭壳龟群体进行遗传结构和遗传多样性分析，以期了解其种质资源情况，从而为浙江省内黄缘闭壳龟的合理利用、资源保护等研究提供理论依据。1材料与方法1.1试验材料试验用黄缘闭壳龟取自义乌宏富农业开发有限公司、东阳金雕养龟基地、东阳巍山养殖场、湖州菱湖龟鳖场、永康后项养龟场和永康下贵养龟场6家养殖场的养殖群体以及杭州清凉峰国家级自然保护区、磐安后阁村野外个体，共44个样本（表1）。1.2试验方法1.2.1基因组DNA提取使用无菌拭子擦拭黄缘闭壳龟口部黏液，置于含有200 L 0.01 mol/L磷酸缓冲盐溶液（PBS）的离心管中保存。采用上海生工Ezup柱式动物基因组DNA 抽提试剂盒提取基因组 DNA，使用 NanoDrop 2000分光光度计测定提取的DNA纯度和浓度，将合格样品于冰箱中-20 保存。1.2.2PCR扩增及测序根据GenBank数据库中公布的黄缘闭壳龟线粒体 全 基 因 组 序 列（登 录 号：EU708434.1），采 用Primer Premier 5.0软件设计其线粒体COI序列特异性引物，送至生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物。引物序列为 COI-F：5-AGCCATCTTACC-TGTGTTTT-3，COI-R：5-TTGCTCAAGTTTGGTGTA-GT-3。PCR 总反应体系为 25 L，其中 R Taq DNA Premix 10 L，基因组 DNA 1 L，上、下游引物各 1 L，ddH2O补足至25 L。PCR扩增程序为94 预变性5 min；94 变性30 s，56 退火45 s，72 延伸90 s，共5个循环；72 延伸10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，送生工生物工程（上海）股份有限公司双向测序。1.2.3数据分析利用SeqMan软件参照序列峰图对所测黄缘闭壳龟COI序列进行人工校正和修饰16。使用MEGA 6.0软件进行多序列比对、碱基组成分析以及系统发育分析，采用邻接法（NJ）构建单倍型聚类树17，并计算群体间及单倍型间的遗传距离。使用DnaSP 6软件计算序列变异位点数，分析不同群体的单倍型数、群体单倍型多样性（Hd）以及核苷酸多样性（Pi）等遗传多样性指数18，绘制核苷酸不配对分布曲线。通过Tajiam s D检验和Fu FS中性检验明确黄缘闭壳龟群体在历史上是否发生群体扩张。由 Arlequin 3.11软件计算群体遗传分化指数（FST），使用Mantel表1黄缘闭壳龟的采样信息Tab.1 Sampling information of Cuora flavomarginata编号ID12345678总计 Total代号CodeDY1DY2HZHUZYSYWYK1YK2采样点Sampling location东阳金雕东阳巍山杭州清凉峰湖州菱湖磐安后阁村义乌宏富永康后项永康下贵经纬度Longitude and latitude299 N，12013 E2919 N，12025 E3010 N，11912 E3045 N，1205 E2857 N，12035 E2910 N，11959 E2851 N，1205 E2950 N，12011 E样本数量Sample size2586955444369野 生 动 物 学 报第45卷检验，自展重复1 000次，对黄缘闭壳龟群体的遗传距离与地理距离之间的相关性进行分析19，并基于分子方差分析（AMOVA）分析群体间的遗传变异20。采用 Network 5.0（Rohl 2003）软件基于中间连接法建立单倍型网络图21，以描述单倍型序列的系统发育关系以及地理关系。2结果2.1线粒体COI I基因序列的碱基组成及变异特征对测序后的序列进行比对，获得黄缘闭壳龟线粒体COI基因序列的长度为1 040 bp，基因序列碱基A、T、C、G的平均含量分别为27.4%、30.5%、24.6%和17.5%，A+T的平均含量为57.9%，C+G的平均含量为42.1%，表现出AT偏倚性。在44只黄缘闭壳龟个体线粒体COI序列中，共检测到保守位点1 004个，多态性位点 13个，单一信息位点 4个，简约信息位点9个。2.2黄缘闭壳龟群体遗传多样性基于线粒体 COI基因序列共定义了 9 个单倍型，8 个黄缘闭壳龟群体的单倍型多样性（Hd）为（0.429 000.169 00）（1.000 000.500 00），核苷酸多样性为（0.000 420.000 16）（0.004 250.001 21）。其中，YS 群体的核苷酸多样性最高（0.004 250.001 21），DY1群体、HUZ群体和YW群体的单倍型多样性较高，分别为（1.000 000.500 00）、（1.000 000.096 00）和（1.000 000.126 00）（表2）。2.3黄缘闭壳龟群体间的遗传距离和遗传分化遗传距离分析可知，基于线粒体COI基因序列，两两群体间的遗传距离为00.003，其中YW、YS群体与其他群体间的遗传距离较远（0.0020.003）。8个群体内的遗传距离为 00.004，HZ和 YK2群体内遗传距离最小，YS 群体内遗传距离最大，达到0.004（表3）。FST分 析 结 果 显 示，两 两 群 体 间 的 FST值 在-0.347 520.822 22，DY1 与 YK2 之间的遗传分化指数最大，为 0.822 22；其次为 HUZ 群体与 YK2 群体，遗传分化指数为0.615 56，处于较高遗传分化水平。DY1 和 YK1 群体间的遗传分化指数最小，为-0.347 52，表明两个群体间的遗传分化较弱（表3）。同时，Mantel检验结果显示，浙江省内不同黄缘闭壳龟群体间的遗传距离与地理距离之间没有显著的相关性（R=0.293 8，p=0.134），表明黄缘闭壳龟种群的遗传分化受地理因素的影响不显著。利用分子方差分析和遗传分化系数对8个群体间的遗传变异和遗传进化进行分析。基于COI基因序列，群体间的分子变异率为14.94%，群体内的分子变异率为 85.06%，分子变异主要发生在群体内部。群体总体遗传分化系数为0.149 39（p0.05），总体分子变异处于中等水平（表4）。表2黄缘闭壳龟遗传多样性信息Tab.2 Genetic diversity information of Cuora flavomarginata序号ID12345678总计 Total编号CodeDY1DY2HZHUZYSYWYK1YK2单倍型数量Haplotype number22245331单倍型HaplotypeHap1、4Hap3、4Hap3、4Hap2、4、6、7Hap2、3、5、8、9Hap1、2、3Hap2、4、8Hap3单倍型多样性（Hd）Haplotype diversity1.000 000.500 000.600 000.175 000.429 000.169 001.000 000.096 000.833 000.127 001.000 000.126 000.700 000.218 000.833 000.222 000.799 000.210 00核苷酸多样性（Pi）Nucleotide diversity0.001 920.000 960.000 580.000 170.000 420.000 160.002 050.000 380.004 250.001 210.003 850.001 370.002 880.001 210.000 800.000 210.002 090.001 47平均核苷酸差异数（K）Average number of nucleotide differences2.000 000.600 000.428 572.133 334.388 894.000 003.000 000.833 332.173 02370陈敏等：基于COI基因的浙江省内黄缘闭壳龟遗传多样性研究第2期2.4黄缘闭壳龟群体间单倍型组成和分布对 9 个单倍型进行分析，构建单倍型网络（图1）。在定义的9个单倍型中，共有5个共享单倍型，4个特有单倍型。共享单倍型分别为Hap1（在DY1和YW群体中共享）、Hap2（在YW、YS、HUZ和YK1群体中共享）、Hap3（在YW、DY2、YS、HZ和YK2群体中共享）、Hap4（在DY1、DY2、HZ、HUZ和YK1群体中共享）和Hap8（在YS和YK1群体中共享），其余4个单倍型在不同群体中独有，Hap5和 Hap9为 YS群体独有，Hap6和Hap7为HUZ群体独有。2.5黄缘闭壳龟群体单倍型系统发育基于线粒体 COI基因序列的 9个单倍型，以三线闭壳龟（C.trifasciata）和潘氏闭壳龟（C.pani）为外群，构建NJ系统进化树。结果显示，8个黄缘闭壳龟表3黄缘闭壳龟群体的遗传距离（下三角）与遗传分化指数（上三角）Tab.3 Genetic distance（lower triangle）and genetic differentiation index（upper triangle）of Cuora flavomarginata populations编号CodeYWDY1DY2YSHZHUZYK1YK2YW0.0030.0020.0030.0030.0030.0020.0030.003DY1-0.275 420.0010.0010.0030.0010.0010.0010.001DY20.257 810.353 610.0010.00200.0020.0020YS-0.022 73-0.095 45-0.006 130.0040.0020.0030.0030.002HZ0.397 870.567 57-0.132 080.062 4000.0020.0020HUZ0.014 93-0.263 160.418 560.168 780.551 400.0010.0020.002YK1-0.132 81-0.347 520.200 00-0.009 320.372 950.027 930.0030.002YK20.377 430.822 220.194 630.005 410.020 410.615 560.408 420注：加粗字体代表群体内遗传距离。Note：Bolded font represents within-population genetic distances.表4黄缘闭壳龟遗传变异的分子方差分析结果Tab.4 AMOVA analysis of genetic variation in populations of Cuora flavomarginata变异来源Source of variation群体间Among population群体内Within population总计Total自由度d73643平方和Sum of squares12.73033.63346.364遗传变异元素Variance components0.164 090.934 261.098 34占总变异的比例（%）Percentage of variation14.9485.06遗传分化系数F-statistics（FST）0.149 39图1基于线粒体DNA COI序列的黄缘闭壳龟单倍型网络关系Fig.1 Network of Cuora flavomarginata based on concatenated mtDNA COI sequences haplotypes371野 生 动 物 学 报第45卷群体单倍型整体分为两个大分支，其中，Hap1、Hap5、Hap8 和 Hap7 与 黄 缘 闭 壳 龟（C.flavomarginata，KJ680321）线粒体基因组中的 COI基因聚为一支；Hap3、Hap9、Hap6 与 NCBI 数据库中的黄缘闭壳龟（C.flavomarginata，EU708434.1）线粒体基因聚为一支（图2）。不同群体的单倍型混杂分布，并未呈现一定的地理规律。8 个群体的单倍型遗传距离为0.0010.011，其中Hap5和Hap9之间的遗传距离最大，为0.011（表5）。2.6黄缘闭壳龟种群历史动态所有黄缘闭壳龟地理群体的中性检验（Tajiam s D和Fu FS）结果见表6。Tajiam s D检测中，除DY1、DY2和HZ群体外，其余群体的检测结果均为负值（p0.10），且并未检测到种群扩张（p0.05）；Fu FS检测中，除DY1、DY2、YK1和HZ群体外，其余群体检测结果均为负值（p0.05）。核酸不匹配分布图（图3）显示，基于COI基因，8个浙江省内黄缘闭壳龟群体的错配分布曲线除DY1、DY2和YK2外，均未呈现明显的单峰模式，与中性检验结果大致吻合，表明检验结果偏离了中性模式，但并不显著（p0.05）。总体上说，黄缘闭壳龟群体在历史上比较稳定，均未经历过种群扩张。图2基于COI序列构建的8个黄缘闭壳龟群体的单倍型NJ系统发育树Fig.2 Haplotype NJ phylogenetic tree of eight groups of Cuora flavomarginata constructed based on COI sequences表5基于COI基因序列黄缘闭壳龟群体单倍型间的遗传距离Tab.5 Genetic distance among eight haplotypes of Cuora flavomarginata population based on COI gene sequence单倍型HaplotypeHap1Hap5Hap6Hap7Hap9Hap3Hap8EU708434.1（Hap4）KJ680321（Hap2）Cuora paniCuora trifasciataHap10.0010.0080.0070.0100.0080.0010.0070.0060.0670.058Hap50.0090.0080.0110.0090.0020.0080.0070.0680.060Hap60.0030.0040.0020.0070.0010.0020.0630.054Hap70.0050.0030.0060.0020.0010.0640.055Hap90.0020.0090.0030.0040.0650.056Hap30.0070.0010.0020.0630.054Hap80.0060.0050.0680.060EU708434.1（Hap4）0.0010.0620.053KJ680321（Hap2）0.0630.054Cuora pani0.028372陈敏等：基于COI基因的浙江省内黄缘闭壳龟遗传多样性研究第2期3讨论3.1黄缘闭壳龟线粒体DNA COI I序列组成本研究基于线粒体COI序列对浙江省8个黄缘闭壳龟群体的遗传多样性进行分析。在44条序列碱基组成中，A+T碱基含量为57.9%，G+C碱基含量为42.1%，表现出明显的AT碱基偏倚性，结果与王珏22和张艳云等10的研究相似，而这也与大部分脊椎动物线粒体基因的编码模式23一致。经本研究发现，黄缘闭壳龟线粒体基因中的A、T、C、G分布呈现不均一性，并且具有高含量A+T碱基的线粒体基因，这也使得黄缘闭壳龟在进化中更具有优势24。3.2黄缘闭壳龟群体遗传多样性分析遗传多样性是物种进化和适应环境变化的基础，遗传多样性水平越高，种群对环境的适应能力越强，种群则会有更好的发展2526。线粒体DNA的核苷酸多样性和单倍型多样性是衡量群体遗传多样性和遗传分化的重要指标27，共同影响着种群进化历史。通过Grant等28的研究可知，Hd和Pi的临界值分别为0.5和0.005，数值越大，表明一个群体的遗传多样性水平越高，同时，平均核苷酸差异数（K）越大，遗传多样性也越丰富29。本研究中，8个群体的平均单倍型多样性和核苷酸多样性分别为（0.799 000.210 00）和（0.002 090.001 47），表明8个群体的遗传多样性水平处于中等。YS群体的Hd和Pi分别为（0.833 000.127 00）和（0.004 250.001 21），在所有群体中K值最大，为4.388 89；其次为YW群体，其Hd和Pi分别为（1.000 000.126 00）和（0.003 850.001 37），K 值为 4.000 00。由此可知，YS 群体的遗传变异程度和遗传多样性水平在黄缘闭壳龟群体中最高，YW群体次之。根据Grant等28提出的关于单倍型多样性和核苷酸多样性的4种模式可知，本研究中的HZ群体的Hd为（0.429 000.169 00），Pi为（0.000 420.000 16），属于低Hd低Pi模式，由此可推知，在 HZ群体中可能发生了瓶颈效应或奠基者事件。除HZ群体，本研究的其余群体均属于高Hd低Pi模式，但在此 7 个群体中，均未呈现明显的种群扩张，意味着7个群体目前极有可能均处于瓶颈期。3.3黄缘闭壳龟群体遗传结构分析基于线粒体 DNA COI基因序列分析了浙江省内黄缘闭壳龟群体间的遗传距离和遗传分化。遗传距离在一定程度上影响着种群的遗传分化程度，遗传距离大，彼此亲缘关系远，遗传分化程度就高30。本研究中的8个黄缘闭壳龟群体中，群体间遗传距离为 00.003，而群体内的遗传距离为 00.004，此结果意味着在不同的黄缘闭壳龟群体内部或已出现种的分化。其中，YS群体内部的遗传距离最大，为0.004，推测在YS黄缘闭壳龟群体内已经分化出黄缘闭壳龟浙江种。遗传分化系数FST作为群体遗传分化程度的重要衡量指标，在群体遗传学中起到极为重要的作用，FST可表示群体间分化程度31，以0.05、0.15 作 为 分 化 程 度 的 标 准，本 研 究 中 的AMOVA分析结果表明，8个黄缘闭壳龟群体间的FST为 0.149 39，小于 0.150 00，为中等水平的遗传分化；群体间变异仅占 14.94%，而群体内变异为85.06%，即黄缘闭壳龟遗传变异主要来源于群体内部。此外，本研究中的8个黄缘闭壳龟群体的FST指数为-0.347 520.822 22，其中YS群体与HUZ群体间存在较大遗传分化（FST=0.168 78），与 HZ 群体（FST=0.062 40）和YK2群体（FST=0.005 41）间遗传分化较小，同时该群体与其他4个群体的FST值均小于0，表明YS群体内部个体间的遗传分化大于与其他群体间的遗传分化。单倍型系统发育分析显示，8个黄缘闭壳龟群体并没有明显的地理聚群和谱系结构，推测各群体内部存在广泛的基因交流，没有形成明显的种群遗传结构。基于样本构建的NJ单倍型系统发育树（图2）和单倍型遗传距离（表 5）显示，安徽黄缘闭壳龟（GenBank登录号：EU708434.1）与台湾黄缘闭壳龟（GenBank登录号：KJ680321）之间的单倍型遗传距离为0.001，这与2014年潘冬冬32的研究结果一致，表6黄缘闭壳龟群体的Tajima D、Fu s FS结果Tab.6 Tajima D，Fu s FS results of Cuora flavomarginata population编号CodeYWDY1DY2YSHZHUZYK1YK2合计TotalTajima s D-1.192 6701.224 74-0.393 290.333 50-0.144 27-0.746 82-2.011 37-0.366 27Fu s FS-1.71600.626-0.2920.536-4.1721.342-1.162-0.605373野 生 动 物 学 报第45卷图3基于COI基因的8个群体核苷酸不匹配分布Fig.3 Distribution of nucleotide mismatches in eight populations based on COI genes374陈敏等：基于COI基因的浙江省内黄缘闭壳龟遗传多样性研究第2期同时根据该研究可知，虽然两者之间在遗传距离上并未产生显著分化，但在形态上已有显著差异，因此，极小的遗传距离可明确区分安徽黄缘闭壳龟与台湾黄缘闭壳龟。通过对黄缘闭壳龟种群进行Mantel 相关性检验后，发现其 R 值小于 0.700 0（p0.05），说明黄缘闭壳龟种群间的遗传分化并未有显著的地理隔离效应33。在本研究中，Hap1 与 Hap5、Hap1 与 Hap8 之间的单倍型遗传距离均小于0.002，表明这3个单倍型个体间亲缘关系较近；Hap1、Hap5、Hap8与Hap7、台湾黄缘闭壳龟（KJ680321）聚为一支，而Hap7与台湾黄缘闭壳龟单倍型间的遗传距离小且仅为0.001，即二者亲缘关系较近，由此推测具有 Hap1、Hap5 和Hap8这3个单倍型之一的黄缘闭壳龟为台湾黄缘闭壳龟种群。Hap6与安徽黄缘闭壳龟（EU708434.1）聚为一支，且二者之间的单倍型遗传距离为0.001，即享有该单倍型的个体在很大程度上是来自安徽本地的黄缘闭壳龟。Hap9为YS群体的独有单倍型，且被YS群体中的1只个体独享，Hap9与Hap1、Hap5的单倍型遗传距离分别为0.010、0.011，同时，Hap9与安徽黄缘闭壳龟和台湾黄缘闭壳龟之间的单倍型遗传距离分别为0.003和0.004，均大于安徽黄缘闭壳龟与台湾黄缘闭壳龟之间的单倍型遗传距离，虽未达到根井正利34所得出的亚种之间的遗传距离（0.020.20），但Hap9并未与其他单倍型聚为一支，且与其他单倍型的距离均较远，推测独享单倍型Hap9 的 YS 黄缘闭壳龟为黄缘闭壳龟浙江种。此外，Hap3与Hap9聚为一小支，二者之间的遗传距离为0.002，且Hap3与Hap1、Hap5的遗传距离分别为0.008、0.009，由此表明单倍型为Hap3的黄缘闭壳龟群体可能为安徽黄缘闭壳龟与浙江黄缘闭壳龟的杂交种。3.4黄缘闭壳龟种群动态分析核苷酸配对差异分析及中性检验是研究种群历史动态的有效检验方法35，可通过Tajima D和Fu s FS检验检测群体是否发生扩张，若检测结果为显著负值且核苷酸错配分布曲线呈单峰时，表明群体发生过扩张；若为双峰或多峰时，则表明群体一直保持相对稳定的状态，未经历过扩张26。本研究基于COI序列的分析结果显示，黄缘闭壳龟8个群体中有5个群体的Tajima D和4个群体的Fu s FS为负值，但没有显著性差异（p0.05），同时，除DY1、DY2和YK2外，核苷酸错配分布图显示均为双峰或多峰形，DY2和HZ均为正值，DY1的Tajima D和Fu s FS均为0，上述研究结果表明，浙江省内8个黄缘闭壳龟群体没有经历过扩张，而是保持相对稳定的状态。3.5黄缘闭壳龟种质资源保护黄缘闭壳龟具有较高的经济价值，近年来被大肆捕杀，导致野生种群数量急剧下降，黄斌等36的研究结果显示，安徽省境内的野生黄缘闭壳龟分布面积日渐缩小，只在安徽大别山区存在少量野生个体。此外，由于黄缘闭壳龟繁殖力较低，同时对繁殖产卵的环境要求极高，随着山区旅游业和经济的发展，导致黄缘闭壳龟没有合适的繁衍环境，从根源上减少了野生黄缘闭壳龟的数量。目前，河南信阳已于2005年建立了黄缘闭壳龟救护中心，安徽省的黄缘闭壳龟繁育也已经形成较为成熟的生态技术模式32。在本研究中，针对浙江省部分养殖场的黄缘闭壳龟群体和野生群体进行了遗传多样性调查，结果显示，黄缘闭壳龟整体遗传多样性较高，但部分群体遗传多样性仍旧较低，应更大力度加强对野生黄缘闭壳龟的保护。由于分布在不同地区的黄缘闭壳龟存在差异，所以应对不同地区的黄缘闭壳龟划分保护单元，防止种质混杂，对于野生黄缘闭壳龟可以进行栖息地保护，对种质资源进行合理利用，为黄缘闭壳龟的养殖及人工繁育提供理论指导。参考文献：1 张方，周婷，黄成.安徽黄缘闭壳龟（Cuora flavomarginata）野生种群的现状及其保护建议 J.生物学杂志，2014，31（2）：87-89.ZHANG F，ZHOU T，HUANG C.The curren