WB湿转法.doc

二、 Western相关药品的配置1. 10 半干式转移缓冲液（母液）最终浓度10Tris-base (Fw 121.1)48 mM58.1472 gGlycine (Fw 75.07)39 mM29.2773 gSDS (Fw 288.38)0.037% (W/V)3.7 gMilliQ H2OToto 1 L2. 1 半干式转移缓冲液（应用液）-室温保存用量10 半干式转移缓冲液100ml甲醇200mlMilliQ H2O700ml蛋白质转印准备1. 准备足够的转印缓冲液来装满转印槽，以及另外200 mL来平衡凝胶和膜，并润湿滤纸。2. 从转印夹中取出凝胶；切掉积层胶和点样孔。3. 将凝胶浸泡在转印缓冲液中10至30分钟。4. 将滤纸浸泡在转印缓冲液中至少30秒。5. 准备转印膜：a. 将膜在甲醇中浸泡30秒。膜应均匀地从不透明变成半透明。b. 小心将膜放入Milli-Q 水中，浸泡2分钟。c. 小心将膜放入转印缓冲液中，至少平衡5分钟。转印堆积层的组装1. 打开凝胶支架转印夹。切记：为了确保均匀的转移，请在堆积层中每一层的表面小心滚动移液管或搅拌棒，以去除气泡。不要施加过大的压力，以防止损坏膜和凝胶。2. 将泡沫（纤维）垫放在卡盒的一侧。3. 将一张滤纸放在泡沫垫上。4. 将凝胶放在滤纸上。5. 将膜放在凝胶上。6. 将第二张滤纸放在堆积层上。7. 将第二个泡沫垫放在滤纸上。8. 盖上凝胶支架转印夹。完整的转印堆积层应如下所示：蛋白质转印1. 将凝胶支架转印夹放入转印槽中，让凝胶一侧面对阴极（-），膜一侧面对阳极（+）。2. 在槽内加入足够量的缓冲液，以覆盖转印夹。3. 将黑色阴极引线（-）插入转印装置的阴极插孔，将红色阳极引线（+）插入阳极插孔。4. 将阴极引线和阳极引线连接到相应的功率输出。5. 如果有的话，根据制造商的指引设置转印槽的冷却装置。6. 开启系统，以6-8 V/极间距离运行1-2小时。按照转印槽制造商的指引，并参考蛋白质从凝胶转移到膜上（第16页），了解优化细节。7. 在转印完成后，从转印槽中取出转印夹。8. 利用镊子，小心拆卸转印堆积层。3050kd用一个条件就行：60V，11.5h（根据胶厚度调整）。