仿刺参南移养殖温度耐受性相关基因的差异表达分析.pdf

渔业研究，（）：收稿日期：基金项目：福建省省属公益类科研院所基本科研专项（、）；福建省种业创新与产业化开发工程项目（）；福建省自然科学基金（）作者简介：朱志煌（），男，研究实习员，硕士，研究方向为水产养殖与疾病防控研究。：通信作者：林 琪（），男，研究员，博士，研究方向为水产养殖。：朱志煌，林 琪，吴建绍，等 仿刺参南移养殖温度耐受性相关基因的差异表达分析 渔业研究，（）：仿刺参南移养殖温度耐受性相关基因的差异表达分析朱志煌，林 琪，吴建绍，杨求华（福建省水产研究所，福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室，福建 厦门）摘要：本研究将仿刺参幼苗从北方南移至福建进行养殖，在自然水温下饲养 年，并作为南移福建养殖的实验组，同时以北方相同苗龄的仿刺参作为对照组，比较两组间的抗热性能；采用荧光定量法分析经过热诱导、后的实验组和对照组仿刺参的、和（）温度耐受性相关基因的转录表达变化情况。研究发现：）实验组仿刺参的亚致死温度为，明显高于对照组的，实验组和对照组仿刺参的半致死温度分别为、，表明高温驯化能够提高仿刺参的耐热能力。）实验组与对照组仿刺参的 种温度耐受性相关基因的表达存在差异。在 高温刺激下，对照组仿刺参的、基因表达在温度刺激、后没有明显增加，而刺激 后才出现上调，表达量分别达到（）、（）、（）、（）；实验组仿刺参的、表达在温度刺激 后即出现显著上调，表达量分别达到（）、（）、（）、（）。实验组仿刺参的 种温度耐受性相关基因的上调时间早于对照组，表明实验组仿刺参对外界高温的适应能力强于对照组。因此，高温驯化后的仿刺参能够更早地对外界高温变化做出反应。关键词：仿刺参；高温驯化；热冲击蛋白；高温耐受性中图分类号：文献标识码：文章编号：（）仿刺参（）是棘皮动物门海参纲刺参科动物的统称，具有较高的营养、药用和经济价值。仿刺参属于温带种类，自然分布区域北起俄罗斯远东地区，经朝鲜、韩国、日本，南至中国北部，虽然在福建的自然海区无分布，但其所具有的巨大经济价值推动该品种养殖业从北往南扩张。自 年以来，福建省从辽宁等地引进仿刺参，并大力开展“北参南养”实验。年福建海参产量达到 ，占全国总产量的 ，稳居全国第三位。仿刺参为浅海底栖生物。水温是影响仿刺参生长、生理性能和免疫反应等功能的重要环境因素，并且在水温升高到一定范围后，其立即进入摄食停止、活动减少的“夏眠”状态。福建地区夏季的高温会导致养殖仿刺参发生大规模死亡，这给养殖业造成巨大的损失。目前，缺乏仿刺参耐高温良种是制约该产业进一步发展的重要因素。选择育种是获得水生动物新品系的重要方法。研究证明，热胁迫刺激能够一定程度地提高动物耐高温的能力。热休克蛋白（渔业研究第 卷，）和小热休克蛋白（，）作为细胞内的分子伴侣，能够防止蛋白质在细胞内聚集，提高细胞的耐热能力。以往研究表明，是诱导耐热的主要介质，其表达模式与生物体的耐热水平直接相关。此外，致死必需蛋白 （），（）基因也是一种小热休克蛋白的同源基因，其表现出与 类似的功能，主要与生物的耐热能力有关，并在一定程度上保护细胞免于凋亡。、和（）基因均属于热休克蛋白家族的成员，其表达的水平可用于评估高温诱导下仿刺参的热耐受力。目前，国内外对北方仿刺参的研究较为系统，众多学者在组织形态学、生态学、生理学、免疫学及分子生物学等方面展开大量研究并取得了丰硕的研究成果。有研究指出，在高温胁迫下，仿刺参的、（）、和等 热 休 克 蛋 白 基 因 的 表 达 量 会 上调。针对北方仿刺参夏眠前、后展开转录组测序的分析研究，发现温度波动会对其热休克蛋白的表达产生显著的影响。还有研究表明，仿刺参的耐热性是可塑的，预先的热冲击实验能够提高其耐热能力。因此，将北方仿刺参转移到南方来进行养殖适应，能在一定程度上提高其耐热性能。本研究从山东青岛购入仿刺参幼苗，将其饲养于温度较高的福建漳州户外浅池塘中，使其经历长期的高温海水刺激，以此作为南移福建养殖的仿刺参实验组，并以北方相同苗龄的仿刺参作为对照组，比较两组间的抗热性能，以期为仿刺参耐高温品系的培育提供理论参考。材料与方法 实验动物和驯化 年冬季从山东省青岛市即墨养殖场（、）购买仿刺参幼苗，并将其分至两地养殖，一部分放在原养殖场养殖，另一部分转移到福建省漳州市东山养殖场室外饲养浅池塘进行养殖（、），两地养殖的仿刺参均在自然光周期和水温下饲养一年。海水经砂滤过滤，盐度约为，以流水模式进行养殖。仿刺参幼苗每天投喂饲料一次，每次喂足人工海参饲料（金派生物，中国威海），并定期对池塘吸污。同时，每天记录水温情况，每月测定仿刺参幼苗的生长情况。年冬季，分别将青岛市即墨养殖场和漳州市东山养殖场养殖的仿刺参运至厦门市进行实验，此时仿刺参均为 月龄（日龄）。为了方便后续区分，将两地运回的仿刺参分别简易命名为青岛本地群体（，）和南方养殖群体（，）。实验开始前，将两地运来的仿刺参分别移入温度为 的养殖水槽中，暂养 ，每天换掉 的等温海水，其他饲养条件均相同。实验设计 仿刺参温度耐受范围实验为研究给定处理时间的仿刺参温度耐受范围，急性温度实验设计的刺激温度超过仿刺参养殖过程中海水的自然温度。将不同仿刺参群体分别放入预先调好海水温度的 透明塑料桶，每个塑料桶放入 头仿刺参，每个实验温度设置 个重复。将两个群体的仿刺参分别同时放入水温为、的塑料桶中，经过 的温度刺激后，转移至 养殖水槽中暂养 ，观察记录其存活情况，以确定两个仿刺参群体的亚致死温度、致死温度和半致死温度。实验水温由温控器控制调节，实验期间每 用精度为 的水银温度计监测水温情况。在实验期间，仿刺参的饲养条件与驯化期间相似。仿刺参温度耐受性相关基因的差异表达实验为了解不同诱导温度和处理时间下两个仿刺参群体、和（）基因的表达模式差异，将两个群体分别转入选定的温度中进行热刺激，温度设置为 （对照组）、，刺激时间分别为、。每个刺激温度和刺激时间均有 头仿刺参，在刺激、后，分别随机采集不同实验组别中的 头仿刺参，然后立即置于液氮中，带回实验室并保存在 冰箱中，备用待测。第 期朱志煌等：仿仿刺刺参参南南移移养养殖殖温温度度耐耐受受性性相相关关基基因因的的差差异异表表达达分分析析 提取和 的合成将整头仿刺参置于装有液氮的研钵中碾碎。取约 样品，放入 试剂（）中进行匀浆，再使用 公司的 试剂盒，按照说明书提取样本组织的总。利用 ，按照说明书合成，提取的样品保存在 冰箱中，备用待测。引物设计和荧光定量实验根据（：）网 站 上 已 公 布 的、和（）基因为模板设计荧光定量引物（表）。采用荧光定量 的方法，检测 个温度耐受性相关基因在温度刺激后的不同仿刺参幼苗群体中的表达情况。以 的表达量为标准值，将对照组和实验组个体在不同时间点的表达量进行校正，以消除不同个体对实验结果的影响。再将这些校正后的表达量与对照组（）进行比较，分析各基因在对照组和实验组中的倍数变化，从而发现基因在高温刺激后的表达规律。荧光定量 的反应条件为 预变性、个循环中 变性 、退火 。表 本研究中所使用的引物 基因引物序列（）（）（）（）统计学分析实验数据采用 软件进行统计分析，采用单因素方差分析（），以最小显著极差法（）比较数据间的显著性。数据结果以平均值 标准差表示，为差异显著。半致死温度通过 软件中的概率单位（）回归法 计算得出。结果与分析 不同仿刺参幼苗群体的温度耐受性青岛本地群体和南方养殖群体在高温刺激后的存活率如图 所示。青岛本地群体在 高温刺激 后均没有出现死亡，而南方养殖群体在 高温刺激 后没有出现死亡，但两个群体在经过 高温刺激 后均全部死亡。在 高温刺激组中，南方养殖群体的存活率均高于青岛本地群体，其中青岛本地群体在、温度下刺激 后的存 活 率 分 别 为 、，而南方养殖群体分别为 、，两个群体的存活率差异显著（）。因此，高温刺激 后，青岛本地群体和南方养殖群体的亚致死温度分别为、，半致死温度（）分别为 （）和 （），两个群体的致死温度均为 （图）。图1不同仿刺参幼苗群体在高温热刺激后的存活率Fig.1Survival rate of different populations ofA.japonicus seedlings after high temperatureand heat stimulation存活率/%Survival rate温度/Temperature 基因的表达情况不同仿刺参幼苗群体在高温热刺激后的渔业研究第 卷基因的表达变化差异如图 所示。青岛本地 群 体 经、高 温 刺 激 后，基因的表达量峰值出现在温度刺激 处，分别为（）、（）、（）、（）；而在 高温刺激后，基因的表达量高峰发生在 处，此时达到青岛本地群体表达量的最高值（），随后表达量随着温度刺激时间的延迟而出现降低。南方养殖群体经 高温刺激 后，基因的表达量已达到（）；在、高温刺激下，基因的表达峰值出现在温度刺激 处，而 高温刺激的最高表达值出现在 ，此 时 达 到 南 方 养 殖 群 体 表 达 量 的 最 高 值（）。在 的高温刺激下，南方养殖群体和青岛本地群体的表达模式相近，基因的表达高峰均发生在 处。青岛本地群体在高温刺激、后，基因的表达峰值分别出现在、；而南方养殖群体则分别出现在、。图2不同仿刺参幼苗群体在高温热刺激后的HSP90a基因的表达变化差异Fig.2Changes of HSP90a gene expression in different populations of A.japonicus seedlings after heat stimulation1 h2 h3 h相对表达量Relative expression相对表达量Relative expression163031323334163031323334温度/Temperature温度/Temperature注：标有不同小写字母表示差异显著（），标有相同小写字母表示差异不显著（）。以下同此。：（），（）基因的表达情况不同仿刺参幼苗群体在高温热刺激后的基因的表达变化差异如图 所示。青岛本地群体在 高温刺激下、处，基因的表达量显著低于对照组（），而在刺激 后，表达量才上调并达到峰值（）；在 高温刺激下，基因的表达量在、处均出现显著上调，并在 处出现表达量峰值；在 高温刺激下，基因的表达量在温度刺激 后出现大幅增加，并达到峰值，随后在、处表达量分别出现明显的下调和上调；在 高温刺激下，基因的表达量随着高温刺激时间的延长而增加，在 处表达量达到青 岛 本 地 群 体 的 最 高 值（）；在 高温刺激下，基因的表达量随着温度刺激时间的延长而降低。南方养殖群体在 高温刺激 后，基因的表达量已达到（），并在 处达到峰值，此时也是南方养殖群体表达量的最高值（），最后在 处出现下降；在 高温刺激下，基因的表达模式与 高温刺激下的相同，呈现先升高后下降的趋势；在 高温刺激下，基因的表达量在 处出现上调，但在 间出现上下浮动；在 高温刺激下，基因的表达量在 间来回波动，最高和最低表达值分别出现在、处；在 高温刺激下，基因的表达量在 处达到最高，之后表达量随着高温刺激时间的延长而逐渐降低。青岛本地群体在高温刺激、后，基因的表达量峰值分别出现在、；而南方养殖群体则分别出现在、。第 期朱志煌等：仿仿刺刺参参南南移移养养殖殖温温度度耐耐受受性性相相关关基基因因的的差差异异表表达达分分析析图3不同仿刺参幼苗群体在高温热刺激后gp96基因的表达变化差异Fig.3Changes of gp96 gene expression in different populations of A.japonicus seedlings after heat stimulation1 h2 h3 h相对表达量Relative expression相对表达量Relative expression163031323334163031323334温度/Temperature温度/Temperature 基因的表达情况不同仿刺参幼苗群体在高温热刺激后的基因的表达变化差异如图 所示，在相同的温度刺激下，不同刺激时间的基因的表达存在差异。青岛本地群体在、高温刺激下，基因的表达量均在 处达到峰值，分别为（）、（）、（）；而在、高温刺激下，基因的表达量峰值均出现在 处；表达量的最高值出现在 刺激 处，为（）。南方养殖群体在 高温刺激下，基因的表达量在 处达到峰值，也是该群体表达量的最高值，为（）；而在、高温刺激下，基因的表达量峰值均出现在 处；在、高温刺激下，基因的表达量峰值均出现在 处。青岛本地群体在高温刺激、后，基因的表达量峰值分别出现在、；而南方养殖群体则分别出现在、。图4不同仿刺参幼苗群体高温热刺激后HSP70基因的表达变化差异Fig.4Changes of HSP70 gene expression in different populations of A.japonicus seedlings after heat stimulation1 h2 h3 h相对表达量Relative expression相对表达量Relative expression163031323334163031323334温度/Temperature温度/Temperature 基因的表达情况不同仿刺参幼苗群体在高温热刺激后的基因的表达变化差异如图 所示。青岛本地群体经过 高温刺激，基因的表达量在 处出现明显的降低，然后在 处继续降低，但在 处达到峰值（）；在 高温刺激下，基因的表达量在 处出现显著上升，之后随着刺激时间的延长而继续上调；在 高温刺激下，基因的表达量在 处达到高峰，在 处降低到正常水平，之后在 处又出现升高；在 高温刺激下，基因的表达量在 处出现显著下调，之后在 处出现大幅增加并达到峰值，之后在 处出现迅速降低；在 高温刺激下，基渔业研究第 卷因的表达量在 处迅速上调并达到该群体表达量的最高值（），之后逐渐降低到正常水平。南方养殖群体的基因的表达量在、高温刺激下出现显著的上调，但是表达量峰值不同，最高值出现在 刺激 处，为（）；在 高温刺激下，基因的表达量随着刺激时间的延长而增加，在 处出现表达量峰值；基因的表达在、高温刺激下的表达模式相近，即高温刺激 处的表达没有显著差异，而在 处的表达量出现快速上调并达到最高峰，之后恢复正常水平。青岛本地群体在高温刺激、后，基因的表达峰值分别出现在、；而南方养殖群体则分别出现在、。图5不同仿刺参幼苗群体在高温热刺激后的HSP26基因的表达变化差异Fig.5Changes of HSP26 gene expression in different populations of A.japonicus seedlings after heat stimulation1 h2 h3 h相对表达量Relative expression相对表达量Relative expression163031323334163031323334温度/Temperature温度/Temperature （）基因的表达情况不同 刺 参 幼 苗 群 体 在 高 温 热 刺 激 后 的（）基因的表达变化差异如图 所示。青岛本地群体经过、的高温刺激后，（）基因的表达量峰值出现在 处，分别为（）、（）；在、高温刺激下，（）基因的表达量峰值均出现在 处，表达量的最高值出现在 刺激 处（）；而在 高温刺激下，（）基因的表达量峰值出现在高温刺激 处。南方养殖群体经过、高温刺激后，（）基因的表达峰值均出现在 处；而、高温刺激下，（）基因的表达量峰值则分别出现在、处，表达量的最高值出现在 刺激 处（）。青岛本地群体在高温刺激、后，（）基因的表达峰值分别出现在、；而南方养殖群体则分别出现在、。图6不同刺参幼苗群体在高温热刺激后的proeintl(2)efl基因的表达变化差异Fig.6Changes of proeintl(2)efl gene expression in different populations of A.japonicus seedlings afterheat stimulation1 h2 h3 h相对表达量Relative expression相对表达量Relative expression163031323334163031323334温度/Temperature温度/Temperature 第 期朱志煌等：仿仿刺刺参参南南移移养养殖殖温温度度耐耐受受性性相相关关基基因因的的差差异异表表达达分分析析 讨论 高温驯化提高仿刺参的耐热性仿刺参是典型的温带物种，对外界环境变化具有强敏感性。等和王青林对北方仿刺参进行高温驯化，结果发现高温驯化后仿刺参的半致死温度为 。本研究将北方仿刺参转移至南方，在自然水温下进行为期一年的养殖，然后与在北方养殖的同批次仿刺参进行耐热性比较，分析了两个群体间的耐热性差异，其中温度耐受性实验得出两个群体的致死温度均为；南方养殖群体的亚致死温度和半致死温度分别为、，青岛本地群体分别为、。本研究发现的青岛本地群体半数致死温度与 等和王青林的结论基本一致。李晓英等比较了北方 个不同地理群体仿刺参的高温耐受力，结果发现胶南群体的半致死温度最高（），而昌黎群体半致死温度最低（），分析认为胶南群体分布靠南、纬度最低，经过长时间较高温度的驯化与适应，使其对于高温的耐受力最强，而昌黎群体分布位于较北端、纬度较高，长期处于略微低温驯化中，导致其对高温的耐受能力较弱。本研究发现，南方养殖群体的亚致死温度和半致死温度显著高于青岛本地群体，这与李晓英等的研究一致，说明生长环境中水温的高低能够影响仿刺参的温度耐受性，而受到长期高温驯化的仿刺参具有更强的高温耐受性。养殖在南方自然水温中的仿刺参幼苗比北方苗种经历更强的高温胁迫，因此其相较于北方苗种具有更高的耐热性。今后在仿刺参品种选育工作中可以通过在南方累代定向选育，不断提高其耐热性能，从而迭代选育出耐高温品系。南北不同养殖仿刺参群体的热休克蛋白基因的表达差异当生物体受到外界环境刺激时，包括热休克蛋白在内的一些基因的表达可能被诱导。根据平均分子 质 量 大 小，热 休 克 蛋 白 可 分 为、和，。本研究发现，经过高温热刺激后，南方养殖群体和青 岛 本 地 群 体 的、和（）基因的表达存在差异。经过 高温刺激的青岛本地群体的、基因的表达量在、处没有出现显著增加，在 处才出现明显上调，而南方养殖群体的基因表达量在 高温刺激 处均出现显著上调。结果表明经过高温热刺激后，南方养殖群体的温度耐受性相关基因的上调时间明显早于青岛本地群体，说明南方养殖群体对高温热刺激的适应能力强于青岛本地群体。在不同的刺激温度下，青岛本地群体和南方养殖群体的、和（）基因的表达量峰值发生在不同的高温热刺激时间点，青岛本地群体的表达峰值分别出现在 处、处、处、处和 处，而南方养殖群体则分别出现在 处、处、处、处和 处。随着热刺激温度的升高或时间的延长，基因表达并非一直上调，这种下降与高温下生物体整体蛋白质合成的减少有关。当外界温度达到生物体的耐受极限，随着温度的进一步升高，机体热损伤蛋白质会不断增加，总蛋白质合成遭到破坏，因此热休克蛋白的表达受到抑制。对 比 南 方 养 殖 群 体 和 青 岛 本 地 群 体，基因在南方养殖群体的表达量最高值（为对照组的 倍）是青岛本地群体（为对照组的 倍）的 倍，基因在南方养殖群体的表达量最高值（为对照组的 倍）是青岛本地群体（为对照组的 倍）的 倍，这与王青林研究发现的仿刺参高温驯化组基因在热刺激诱导温度下的最高表达量明显高于低温驯化组的结果一致，说明经过高温驯化的仿刺参能保持较高水平的表达，以防止蛋白质变性和聚集。此外，、和（）这 个基因在两个仿刺参群体的 高温刺激 处的表达量均下调至对照组水平，说明此时仿刺参 基因的表达已达到上限并开始迅速回落，其已无法通过继续提高 基因的表达水平来抵抗外界的热胁迫，这与本研究两个群体的致死温度均为 的结果一致。渔业研究第 卷 结论经过高温驯化，仿刺参能够更早地对外界高温做出反应，同时其具有更强的合成热休克蛋白的能力，以避免温度骤升引起的蛋白质变性和聚集，从而提高它们在夏季高温下的耐热能力和存活率。因此，通过将仿刺参幼苗进行“北参南养”，经过几代的高温选育，能够为仿刺参耐高温品系的选育提供良好的实验材料。参考文献：袁秀堂，杨红生，陈慕雁，等 刺参夏眠的研究进展 海洋科学，（）：孙秀俊，李琪，孔令锋，等 中国刺参（）日本红刺参（）杂交子代的胚胎、幼体发育及幼参生长性状的研究 中国海洋大学学报（自然科学版），（）：孙灵毅，赵强，任利华，等 中国刺参与韩国红刺参杂交及子代发育特性的研究 大连海洋大学学报，（）：张黎黎，曹学彬，姜永新，等 低温对刺参中国群体与俄罗斯群体杂交 幼参摄食及生长的影响 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